孫凱

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)部 鄭州 450014

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是最常見的腦血管疾病。由于全麻后血管擴(kuò)張及圍術(shù)期禁飲食,常導(dǎo)致有效血容量降低,尤其對(duì)有基礎(chǔ)病的老年患者,因腦血流灌注不足易發(fā)生圍術(shù)期IS[1]。溶栓后所引發(fā)的腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, I/R)將進(jìn)一步加劇腦損傷。減輕腦缺血再灌注造成的腦損傷,對(duì)于治療IS具有重要意義。壞死性凋亡是最新發(fā)現(xiàn)的一種兼具凋亡與壞死形態(tài)特征的細(xì)胞死亡方式[2]。研究表明,I/R過程中伴隨著壞死性凋亡[3],而壞死性凋亡抑制劑可顯著減輕I/R引起的腦損傷[4-5]。右美托咪定是一種常用的鎮(zhèn)靜藥,具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、抑制交感活動(dòng)作用[6],并可保護(hù)大腦免受I/R導(dǎo)致的損傷[7]。本研究采用HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞,在體外建立氧糖剝奪/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,擬評(píng)價(jià)右美托咪定在體外對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用,并基于抑制壞死性凋亡探討其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 美國(guó)Bio-Rad公司的Imark酶標(biāo)儀。美國(guó)Thermo Fisher公司的FRESCO21離心機(jī)。美國(guó)ABI公司的Q5熒光定量PCR儀。日本尼康公司的TS-2倒置熒光顯微鏡。美國(guó)Beckman公司的CytoFLEX流式細(xì)胞儀。

1.1.2 材料 HT22細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。右美托咪定(純度≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素雙抗、胰酶購自美國(guó)Thermo Fisher公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶公司。總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自北京天根生物公司。SYBR熒光定量試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司。受體相互作用蛋白激酶1 (receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)、混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自美國(guó)CST公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)購自美國(guó)Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 OGD/R模型的建立 HT22細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS,1%青-鏈霉素雙抗)中。細(xì)胞長(zhǎng)至約60%<70%時(shí),采用PBS清洗細(xì)胞3次,將培養(yǎng)基更換為無血清無糖培養(yǎng)基,置于低氧培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、94% N2)中培養(yǎng)12 h后,復(fù)糖復(fù)氧24 h。

1.2.2 細(xì)胞給藥處理 (1)HT22細(xì)胞分為7組,右美托咪定分別設(shè)0、2.5、5、10、20、40、80 μM不同濃度梯度。給藥處理24 h后,采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率。(2)HT22細(xì)胞分為5組,分別為對(duì)照組,OGD/R組,右美托咪定低、中、高濃度組(分別為2.5、5、10 μM)。細(xì)胞低氧12 h后,加入相應(yīng)藥物,復(fù)氧24 h后,檢測(cè)細(xì)胞存活率、上清液中LDH含量,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,收集細(xì)胞提取RNA和蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè) HT22細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中,藥物處理24 h后,每孔加入100 μL CCK-8溶液,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值,計(jì)算細(xì)胞存活率。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞上清LDH含量檢測(cè) HT22細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中,藥物處理24 h后,1 000 rpm離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書加入反應(yīng)試劑,采用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光值,計(jì)算上清液中LDH含量。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HT22細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中,藥物處理24 h后,加入胰酶消化2 min,加入血清終止消化。1 000 rpm離心10 min,棄上清,加入PBS清洗3次,1 000 rpm離心10 min,棄上清,PBS重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V/FITC染料吹打混勻,室溫避光孵育5 min,加入5 μL PI染料后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) HT22細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中,藥物處理24 h后,消化并收集細(xì)胞,采用試劑盒提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用SYBR熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性20 s,60℃退火延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由上海Invitrogen公司合成,序列為:RIPK1:5’-CTGTTCCCTGTGCCCAATAA-3’ (sense),5’-ATGACTCTGAAGCTGTCCTTT C-3’ (antisense);MLKL:5’-UCAAGGACGUGAACAGGAATT-3’ (sense),5’-UU CCUGUUCACGUCCUUGATT-3’ (antisense);GAPDH: 5’-CAAGGTCATCCA TGACAACTTTG-3’ (sense),5’-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3’ (antisense)。

1.2.7 免疫印跡(Western blot) HT22細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中,藥物處理24 h后,消化并收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液,超聲破碎10 s,靜置裂解20 min,12 000 g離心20 min,收集上清。采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,加入loading buffer 后于100℃加熱10 min,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入一抗(RIPK1: 1∶1 000,MLKL:1∶2 000,GAPDH:1∶5 000),4℃搖床孵育過夜。PBST漂洗3次,加入HRP標(biāo)記的二抗孵育30 min,PBST漂洗3次,滴加ECL顯色液后顯影,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞存活率的影響與對(duì)照組比較,右美托咪定濃度在20 μM以上顯著降低了HT22細(xì)胞存活率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);當(dāng)濃度低于10 μM時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無影響,因此后續(xù)研究選擇10 μM以下濃度。與對(duì)照組比較,OGD/R組細(xì)胞存活率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組均顯著提高了細(xì)胞存活率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.001)。見圖1。

注:與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與OGD/R組相比,##P<0.001,###P<0.001圖1 右美托咪定對(duì)OGD/R處理HT22細(xì)胞存活率的影響

2.2 右美托咪定對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞上清LDH含量的影響與對(duì)照組比較,OGD/R組細(xì)胞上清中LDH含量顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM濃度組的LDH含量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖2。

注:與Control組比較,***P<0.001;與OGD/R組比較,###P<0.001圖2 右美托咪定對(duì)OGD/R處理HT22細(xì)胞上清LDH含量的影響

2.3 右美托咪定對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較,OGD/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM濃度組的細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖3。

注:與Control組比較,***P<0.001;與OGD/R組比較,###P<0.001圖3 右美托咪定對(duì)OGD/R處理HT22細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 右美托咪定對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞RIPK和MLKL的mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,OGD/R組細(xì)胞RIPK1和MLKL的mRNA表達(dá)水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組RIPK1和MLKL的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

注:與Control組比較,**P<0.01;與OGD/R組比較,##P<0.01圖4 右美托咪定對(duì)OGD/R處理HT22細(xì)胞RIPK和MLKL的mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 右美托咪定對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞RIPK和MLKL蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,OGD/R組細(xì)胞RIPK1和MLKL的蛋白表達(dá)水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.001)。與OGD/R組比較,右美托咪定5 μM和10 μM組RIPK1和MLKL的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注:與Control組比較,**P<0.01,***P<0.001;與OGD/R組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001圖5 右美托咪定對(duì)OGD/R處理HT22細(xì)胞RIPK和MLKL的蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

近年來,IS的發(fā)病率逐年上升,我國(guó)每年約有190萬人死于IS[8]。及時(shí)恢復(fù)大腦供血是降低IS病死率的關(guān)鍵,但再灌注會(huì)造成腦組織新的損傷。因此,合理選擇具有腦保護(hù)作用的麻醉藥可有效減輕腦卒中引起的大腦損傷。本研究采用OGD/R處理HT22細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)右美托咪定可顯著減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡,提高細(xì)胞存活率,減少LDH的釋放,與有關(guān)研究的結(jié)果一致[9]。

大量研究表明,壞死性凋亡是I/R引起大腦神經(jīng)元死亡的重要方式,而抑制壞死性凋亡可顯著減輕I/R造成的腦損傷[3,6]。壞死性凋亡是一種依賴于RIPK和MLKL的細(xì)胞程序性壞死,其中RIPK1是壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子,其N端參與激活NF-κB信號(hào),C端可與TNFR1相互作用,而同型作用結(jié)構(gòu)域可與RIPK3結(jié)合形成壞死小體并參與誘導(dǎo)壞死性凋亡[2]。研究表明,RIPK1在I/R模型中表達(dá)顯著上調(diào),RIPK1抑制劑可顯著減輕I/R引起的小鼠腦組織損傷[4,10]。MLKL是壞死性凋亡的執(zhí)行者,其N端有個(gè)4HB結(jié)構(gòu)域,正常時(shí)與C端的假性激酶樣區(qū)域結(jié)合而保持失活狀態(tài)。當(dāng)RIPK1促使RIPK3活化后,RIPK3與MLKL結(jié)合,并使其暴露出4HB結(jié)構(gòu)域,促使MLKL向細(xì)胞膜發(fā)生異位并寡聚化,影響細(xì)胞膜上的離子通道,促使水鈉內(nèi)流及鉀離子外流,升高細(xì)胞內(nèi)滲透壓,導(dǎo)致細(xì)胞壞死性凋亡[11]。另外,寡聚化的MLKL還可以與磷酸肌醇結(jié)合,直接破壞細(xì)胞膜的完整性而導(dǎo)致細(xì)胞壞死[12]。MLKL抑制劑可通過抑制壞死性凋亡,減輕急性缺血性腦損傷[5]。本研究中,RIPK1和MLKL的表達(dá)在OGD/R組均顯著升高,表明OGD/R誘導(dǎo)了細(xì)胞壞死性凋亡。右美托咪定可通過下調(diào)RIPK1的表達(dá)抑制MLKL活化,減輕OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死性凋亡。Chen等[13]在心肌細(xì)胞中也證實(shí)了右美托咪定可抑制低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的壞死性凋亡。

綜上所述,右美托咪定可通過抑制壞死性凋亡減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,不僅揭示了右美托咪定的神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制,也為右美托咪定在臨床麻醉中減輕圍術(shù)期IS提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。