劉微微,常楚婷,馮敬杰,張家赫,李飛勝,丁文濤,王昌祿

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457)

D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖C3位置的差向異構(gòu)體[1],具有與蔗糖相似的口感,但代謝產(chǎn)生的能量只有蔗糖的0.3%,還具有改善胰島素抵抗和預(yù)防糖尿病的功能[2-3],還可以提升嚙齒動(dòng)物的抗肥胖作用,防止2型糖尿病的發(fā)展,并改善大鼠血脂異常[4-5]。糖尿病和肥胖癥是全球日益嚴(yán)重的健康問(wèn)題,具有低熱量和預(yù)防糖尿病等功能的天然甜味劑D-阿洛酮糖受到廣泛關(guān)注[6],作為蔗糖的替代品具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值[7]。

D-阿洛酮糖在自然界中的含量很低,提取成本極高,直接提取法很難滿足市場(chǎng)需求;此外,化學(xué)合成法反應(yīng)條件苛刻,污染環(huán)境,副產(chǎn)物分離困難,難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[8]。生物合成法則有周期短、成本低、對(duì)環(huán)境影響較小等優(yōu)勢(shì),目前,已成為生產(chǎn)D-阿洛酮糖的主要方法。GU等[9]在培養(yǎng)大腸桿菌中進(jìn)行了培養(yǎng)基優(yōu)化并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行研究,還研究了搖瓶培養(yǎng)中提高大腸桿菌分泌DAE的策略,使活性達(dá)3.5 U/mL。李秋鳳等[10]對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后DAE的酶活可達(dá)10.11 U/g,以120 g/L的D-果糖為底物全細(xì)胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖產(chǎn)量為11.47 g/L。

本文以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶(D-allulose 3-epimerase, DAE)的重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株,研究發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件對(duì)重組菌株生長(zhǎng)和酶活的影響。通過(guò)優(yōu)化重組大腸桿菌培養(yǎng)基碳源、氮源以及金屬離子的組成和濃度,提高了菌體密度和單位體積酶活;在此基礎(chǔ)上,對(duì)接種量、裝液量、誘導(dǎo)時(shí)間等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,使得單位體積酶活進(jìn)一步提高;最終在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行批式發(fā)酵,實(shí)現(xiàn)了重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng),大大提高了DAE酶活,對(duì)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)菌株為本研究室構(gòu)建的大腸桿菌BL21-pET22b-CbDAE菌株,所表達(dá)DAE來(lái)自Clostridiumbolteae,Genbank登錄號(hào)：EDP19602.1。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸粉5、氯化鈉10,pH自然。

LBA培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入氨芐青霉素,終質(zhì)量濃度為100 mg/L。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：基于SUN等[11]方法改進(jìn),葡萄糖30、酵母浸粉8、蛋白胨4、(NH4)2SO43、KH2PO43、MgSO40.5,pH 7。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃,20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 8453紫外分光光度計(jì)、Agilent 1200高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;5 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐,上海百倫生物科技有限公司;Sugar-Pak I Column色譜柱,Waters;LS-B50 L立式蒸汽壓力鍋,上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)方法

1.3.1.1 活化

將保藏于-80 ℃的重組大腸桿菌劃線接種于LBA液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接于LBA固體平板,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.3.1.2 種子培養(yǎng)

將平板活化后的重組大腸桿菌挑取單菌落,接種于LBA培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.1.3 蛋白表達(dá)

將種子液以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo)重組大腸桿菌合成目的蛋白,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h后結(jié)束發(fā)酵。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

(1)通過(guò)單因素試驗(yàn)進(jìn)行碳源選擇及添加量?jī)?yōu)化：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,使用不同碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘油)替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,確定最佳碳源。在最佳碳源種類的基礎(chǔ)上,進(jìn)行碳源添加量(5、10、15、20、25、30、35 g/L)的優(yōu)化。

(2)通過(guò)單因素試驗(yàn)進(jìn)行氮源選擇及添加量?jī)?yōu)化：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,使用不同氮源及不同配比(酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸粉+胰蛋白胨、酵母浸粉+牛肉膏、酵母浸粉+大豆蛋白胨)替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。在最佳氮源種類的基礎(chǔ)上進(jìn)行氮源添加量(5、10、15、20、25、30 g/L)的優(yōu)化。

(3)通過(guò)單因素試驗(yàn)進(jìn)行金屬離子選擇及添加量?jī)?yōu)化：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察不同金屬離子(Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)對(duì)發(fā)酵酶活性的影響。在最佳金屬離子種類的基礎(chǔ)上進(jìn)行金屬離子添加量(0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol/L)的優(yōu)化。

1.3.2.2 搖瓶水平發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)接種量：利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基,分別按1%、3%、5%、7%、10%(體積分?jǐn)?shù))的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌合成目的蛋白,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h后結(jié)束發(fā)酵。

(2)裝液量：利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基,在250 mL錐形瓶培養(yǎng)大腸桿菌,將種子液以5%接入量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量分別為10%、20%、30%、40%、50%(體積分?jǐn)?shù)),培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件同上。

(3)發(fā)酵時(shí)間：利用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基,將種子液以5%的接種量進(jìn)行接種,培養(yǎng)條件同上,30 ℃、200 r/min分別培養(yǎng)8、10、12、14、16 h。

(4)IPTG添加量：將種子液以5%的接種量進(jìn)行接種,當(dāng)OD600在0.6～0.8時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),IPTG添加量分別為0.1、0.2、0.4、0.7、1 mmol/L,培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件同上。發(fā)酵結(jié)束收集菌體,離心并用PBS緩沖液洗滌2次,將定容后的菌液進(jìn)行果糖催化反應(yīng)。

1.3.2.3 5 L發(fā)酵罐放大驗(yàn)證

利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵,裝液量為3 L,pH控制為7,溶氧控制為30%,在誘導(dǎo)發(fā)酵過(guò)程中,每隔2 h取樣一次,收集菌體,離心,用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌2次,將定容后的菌液進(jìn)行果糖催化反應(yīng)。

1.3.2.4 不同細(xì)胞添加量對(duì)酶促反應(yīng)的影響

在催化體系中分別加入不同量的細(xì)胞,分別為0.014、0.007、0.002 8、0.001 4 g DCW/L,反應(yīng)20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h,取樣測(cè)定。

1.3.3 指標(biāo)檢測(cè)方法

菌體測(cè)量方法：發(fā)酵過(guò)程中取樣測(cè)定,稀釋一定倍數(shù)之后,在波長(zhǎng)600 nm測(cè)定吸光度值。

酶活性測(cè)定：將發(fā)酵液進(jìn)行離心(6 000 r/min,10 min,4 ℃),收集菌體,用PBS緩沖液(pH=7,50 mmol/L)洗滌2次。將收集的菌體利用PBS緩沖液重懸并定容后進(jìn)行酶促反應(yīng)。

酶促反應(yīng)體系：果糖終質(zhì)量濃度500 g/L,加入PBS(pH=7)緩沖液并加水稀釋至體系終濃度為50 mmol/L。50 ℃預(yù)熱反應(yīng)體系,將適量的細(xì)胞加入到預(yù)熱后的酶促反應(yīng)體系中,50 ℃反應(yīng)20 min,沸水浴10 min終止反應(yīng)。反應(yīng)液低溫離心(4 ℃,10 000 r/min,10 min)后取上清液,稀釋20倍后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

高效液相色譜測(cè)定條件：柱溫溫度80 ℃,流動(dòng)相為超純水,流速0.6 mL/min;檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

1.3.4 酶活性的定義

酶活性定義：在50 ℃反應(yīng)條件下,1 min內(nèi)酶催化D-果糖產(chǎn)生1 μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)表示。使用SPSS中Duncan方法,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重測(cè)試分析。在P<0.05時(shí)表示處理的結(jié)果存在差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源種類及添加量對(duì)酶活性和菌體量的影響

在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,利用不同碳源(果糖、乳糖、蔗糖、甘油)替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,確定最佳碳源,結(jié)果如圖1-a所示。當(dāng)碳源為蔗糖時(shí),D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的比酶活最高,為9.81 U/mL,是對(duì)照組的2.22倍;其次為甘油、乳糖和果糖。不同碳源不僅導(dǎo)致單位體積酶活的差異,同時(shí)也對(duì)菌體量有影響,在以甘油為唯一碳源時(shí),菌體密度最高,OD600為5.69。當(dāng)使用蔗糖作為碳源時(shí),OD值增加了27.35%,但單位體積酶活性增加了112.4%,說(shuō)明蔗糖為碳源有利于重組大腸桿菌對(duì)重組蛋白的合成。

a-不同碳源;b-蔗糖添加量圖1 不同碳源的添加以及蔗糖添加量對(duì)酶活性及OD600的影響

以蔗糖作為碳源,進(jìn)行添加量(5、10、15、20、25、30、35 g/L)的優(yōu)化,對(duì)菌體OD值和酶活性的影響如圖1-b所示。隨著蔗糖添加量的增加,DAE的酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)蔗糖添加量為10 g/L時(shí),單位體積的酶活性最高,為15.16 U/mL。蔗糖添加量過(guò)高不僅會(huì)導(dǎo)致DAE的酶活降低,也導(dǎo)致菌體量降低。說(shuō)明過(guò)高濃度的蔗糖對(duì)微生物的生長(zhǎng)有一定的抑制作用[12]。因此,確定最優(yōu)蔗糖添加量為10 g/L。

2.1.2 氮源種類及添加量對(duì)酶活性和菌體量的影響

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,使用不同氮源(酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母浸粉+牛肉膏、酵母浸粉+大豆蛋白胨)替換初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母浸粉+胰蛋白胨,對(duì)菌株生長(zhǎng)以及酶活性的影響如圖2-a所示。不同氮源對(duì)單位體積的酶活性有較大影響,當(dāng)?shù)礊榇蠖沟鞍纂藭r(shí),DAE的酶活性最高,為11.16 U/mL,比對(duì)照組提高47.71%,且顯著高于其他氮源。當(dāng)胰蛋白胨為唯一氮源時(shí),OD600值最高,達(dá)到4.43,但酶活性卻僅為大豆蛋白胨為碳源時(shí)的51.05%,因此,確定最優(yōu)氮源為大豆蛋白胨。對(duì)大豆蛋白胨進(jìn)行氮源添加量(5、10、15、20、25、30 g/L)的優(yōu)化,結(jié)果如圖2-b所示。大豆蛋白胨添加量對(duì)單位體積的酶活性影響顯著,隨著大豆蛋白胨添加量的升高,單位體積酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)大豆蛋白胨添加量為15 g/L時(shí),單位體積酶活性最高,為11.59 U/mL。因此,確定大豆蛋白胨最優(yōu)添加量為15 g/L。

a-不同氮源;b-大豆蛋白胨添加量圖2 不同氮源的添加以及大豆蛋白胨添加量對(duì)酶活性及OD600的影響

2.1.3 金屬離子種類及添加量對(duì)酶活性和菌體量的影響

蛋白質(zhì)的多肽鏈通常與金屬離子配位,具有官能團(tuán)的側(cè)鏈可以作為金屬的附加結(jié)合位點(diǎn),包括組氨酸的咪唑基團(tuán)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基、酪氨酸的酚環(huán)以及賴氨酸和精氨酸側(cè)鏈的氮[13]。氫鍵、靜電和疏水鍵以及范德華相互作用對(duì)金屬-蛋白質(zhì)相互作用具有重要意義,對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有相當(dāng)大的影響。影響金屬與蛋白質(zhì)結(jié)合的因素包括金屬性質(zhì),例如價(jià)態(tài)、離子半徑、電荷接受能力和各自生物區(qū)室中的游離金屬濃度[14]。以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),考察不同金屬離子(Fe2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Zn2+)對(duì)DAE酶活性和菌體生長(zhǎng)的的影響,結(jié)果如圖3-a所示。不同金屬離子對(duì)單位體積酶活性有較大影響,當(dāng)金屬離子為錳離子時(shí),酶活性最高,為13.19 U/mL,相比于對(duì)照組提高36.39%。添加不同離子對(duì)酶活性有很大影響,但對(duì)OD600值卻影響不大,說(shuō)明金屬離子對(duì)菌體的生長(zhǎng)影響不顯著。在此基礎(chǔ)上,研究了不同的Mn2+添加量(0.01、0.025、0.05、0.075、0.1 mmol/L)對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶活性的影響,結(jié)果如圖3-b所示。隨著Mn2+添加量的升高,單位體積酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)錳離子添加量為0.025 mmol/L時(shí),單位酶活性可高達(dá)14.25 U/mL。不同金屬離子濃度對(duì)OD600值的影響不大。

2.2 單因素發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 接種量對(duì)DAE酶活性和菌體量的影響

除培養(yǎng)基外,接種量對(duì)微生物的發(fā)酵也有較大影響。提高接種量,可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng),且有利于縮短菌體生長(zhǎng)的延滯期;而接種量過(guò)大,代謝會(huì)向生物量轉(zhuǎn)變,減少酶的合成[15]。因此,合適的接種量對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)有著重要的意義。分別按1%、3%、5%、7%、10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量研究其對(duì)微生物生長(zhǎng)及酶活性的影響,結(jié)果如圖4所示。隨著接種量的增大,單位體積酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為3%時(shí),單位體積酶活性最高,為14.94 U/mL。雖然不同接種量對(duì)酶活性有較大影響,但對(duì)于發(fā)酵菌體的最終密度影響并不大。因此,確定了最佳接種量為3%。

圖4 接種量對(duì)酶活性及OD600的影響

2.2.2 培養(yǎng)基裝液量對(duì)DAE酶活性及菌體量的影響

由于大腸桿菌是一種兼性厭氧菌,發(fā)酵液中的溶氧量對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)起著重要作用,菌體生長(zhǎng)快慢對(duì)重組蛋白的合成同樣產(chǎn)生影響。在搖瓶培養(yǎng)中,溶氧量的多少直接受到搖瓶裝液量的影響。因此,搖瓶?jī)?nèi)適量的培養(yǎng)基有利于菌種的生長(zhǎng)和重組蛋白的表達(dá)。分別按10%、20%、30%、40%、50%的裝液量研究其對(duì)菌體生長(zhǎng)與酶活性的影響,結(jié)果如圖5所示。隨著裝液量的增加,單位體積酶活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為30%時(shí),單位體積酶活性最高,為13.41 U/mL。不同裝液量對(duì)單位體積酶活性影響較大,但對(duì)菌體影響較小。因此,確定了最佳裝液量為30%。

圖5 裝液量對(duì)酶活性及OD600的影響

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)DAE酶活性和菌體量的影響

誘導(dǎo)時(shí)間與蛋白產(chǎn)量和酶活性密切相關(guān),受到氮源、碳源等能源物質(zhì)的限制和已表達(dá)蛋白的抑制作用的影響,重組蛋白產(chǎn)量不會(huì)一直持續(xù)增長(zhǎng)。分別誘導(dǎo)8、10、12、14、16 h,研究不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體密度和單位體積酶活性的影響,結(jié)果如圖6所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),單位體積酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵10 h時(shí),單位體積的酶活性最高,為20.23 U/mL。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到或超過(guò)12 h時(shí),菌株OD持續(xù)增加,但酶活性顯著降低。因此,最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h。

圖6 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活性及OD600的影響

2.2.4 誘導(dǎo)劑添加量對(duì)DAE酶活性和菌體量的影響

本研究中使用的是重組大腸桿菌,其DAE啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,只有加入誘導(dǎo)劑(IPTG)才會(huì)開(kāi)始表達(dá)蛋白。誘導(dǎo)劑濃度是影響誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)重組蛋白的重要因素,濃度過(guò)低可能導(dǎo)致誘導(dǎo)劑的量不足以與阻遏蛋白結(jié)合,從而降低表達(dá)水平;當(dāng)誘導(dǎo)劑的濃度太高又可能會(huì)使菌體的生長(zhǎng)受限,重組蛋白的表達(dá)太快會(huì)產(chǎn)生包涵體[16]。本研究中以不同的誘導(dǎo)劑濃度(0.1、0.2、0.4、0.7、1 mmol/L)誘導(dǎo)蛋白表達(dá),結(jié)果如圖7所示。隨著誘導(dǎo)劑濃度的升高,單位體積酶活性不斷增大。當(dāng)誘導(dǎo)劑添加量為1 mmol/L時(shí),單位體積酶活性最高,為14.22 U/mL,是誘導(dǎo)劑添加量0.1 mmol/L時(shí)單位體積酶活性的1.85倍。隨著IPTG濃度的增加,菌體密度逐漸降低,說(shuō)明高濃度IPTG對(duì)菌株的生長(zhǎng)不利?？紤]到IPTG對(duì)酶活性的影響及經(jīng)濟(jì)問(wèn)題,確定最佳誘導(dǎo)劑添加量為1 mmol/L。

圖7 IPTG添加量對(duì)酶活性及OD600的影響

2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化前后對(duì)酶活性和菌體量的對(duì)比

采用單因素對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,重組大腸桿菌的菌體密度和單位體積酶活性變化如圖8所示。優(yōu)化后,重組大腸桿菌單位體積酶活性有了大幅提升,達(dá)到優(yōu)化前的2.57倍;菌體密度也有所提高,達(dá)到優(yōu)化前的1.46倍,說(shuō)明培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件優(yōu)化在提高菌體密度的同時(shí),大幅度提高了目的蛋白的活性表達(dá)。

圖8 優(yōu)化前后酶活性及OD600的對(duì)比

2.4 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵研究

相比于搖瓶培養(yǎng),發(fā)酵罐培養(yǎng)不但能夠更好地控制發(fā)酵條件,從而有利于微生物的生長(zhǎng)和目的蛋白的穩(wěn)定表達(dá),而且發(fā)酵罐也更接近實(shí)際生產(chǎn)條件,具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究在前期培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,利用5 L發(fā)酵罐研究重組大腸桿菌的生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)特性,在誘導(dǎo)10 h后開(kāi)始進(jìn)行補(bǔ)充葡萄糖溶液,參考李瀾瀟等[17]補(bǔ)料方式,結(jié)果如圖9-a所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),重組大腸桿菌菌體密度逐漸增加并逐漸趨于平衡,OD600最高可達(dá)51.8,菌體干重最高可達(dá)21.5 g/L;單位體積酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為18 h時(shí),單位體積酶活性最高為103.8 U/mL。

a-不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)大腸桿菌的干重、OD600及酶活性的影響;b-不同細(xì)胞添加量、不同催化時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響;c-產(chǎn)物液相檢測(cè)圖圖9 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)大腸桿菌的干重、OD600、酶活性不同影響以及不同細(xì)胞添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

取不同誘導(dǎo)時(shí)間的重組大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行D-果糖到D-阿洛酮糖的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng),當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為18 h時(shí),D-阿洛酮糖產(chǎn)量最高,達(dá)到90.47 g/L;轉(zhuǎn)化率達(dá)到18.26%?？紤]到不同細(xì)胞添加量對(duì)催化速率的影響,在反應(yīng)體系中加入不同細(xì)胞量在不同反應(yīng)時(shí)間取樣測(cè)定,結(jié)果如圖9-b所示。細(xì)胞添加量越多,在初始反應(yīng)時(shí)催化速度越快,當(dāng)細(xì)胞添加量為0.014 g DCW/L時(shí),催化1 h即可達(dá)到最大反應(yīng)平衡點(diǎn)28.76%,D-阿洛酮糖產(chǎn)量可達(dá)149.74 g/L。

3 結(jié)論與討論

在重組大腸桿菌發(fā)酵D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的研究中,獲得高水平的單位體積酶活性是實(shí)際生產(chǎn)中的本質(zhì)要求,這與菌株的生長(zhǎng)代謝關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基與發(fā)酵條件,確定了重組大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中的最適碳氮源以及金屬離子濃度,也確定了培養(yǎng)基的成分以及最佳培養(yǎng)條件。其中,最佳培養(yǎng)基的組成為：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO43 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO40.5 g/L、MnSO40.025 mmol/L。通過(guò)發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化研究確定了大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h,接種量為3%,搖瓶裝液量為30%,IPTG添加濃度為1 mmol/L。通過(guò)本研究的優(yōu)化,搖瓶單位體積酶活性達(dá)到優(yōu)化前的2.57倍,菌體密度達(dá)到優(yōu)化前的1.46倍。

周雪[15]在優(yōu)化培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件后,以36 g/L果糖為底物,反應(yīng)5 h生成D-阿洛酮糖為12.07 g/L。胡夢(mèng)瑩[18]在45%D-果糖為底物,55 ℃,反應(yīng)30 min時(shí)DAE的轉(zhuǎn)化率為12.5%左右。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件后,以500 g/L的D-果糖為底物,pH為7,50 ℃反應(yīng)20 min轉(zhuǎn)化率為20.43%,D-阿洛酮糖生成量為102.33 g/L。在不同細(xì)胞添加量時(shí),當(dāng)細(xì)胞添加量為0.014 g DCW/L時(shí)反應(yīng)1 h最高轉(zhuǎn)化率為28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可為149.74 g/L。最后,利用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn),菌體密度(OD600)最高可達(dá)51.8,菌體干重最高可達(dá)21.5 g/L;誘導(dǎo)18 h時(shí)單位體積酶活性最高,可達(dá)103.8 U/mL。CHEN等[19]在7.5 L發(fā)酵罐中補(bǔ)料培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)DAE,需要84 h獲得酶活性為95 U/mL。FU等[20]利用枯草芽孢桿菌在7.5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵72 h酶活性為74 U/mL。因此,本研究對(duì)于D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值。