王玉榮,高君,雷炎,管桂坤,劉宇,侯強川,郭壯*

1(湖北文理學院,湖北省食品配料工程技術研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術與應用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽,441053) 3(山東蘭陵美酒股份有限公司,山東 蘭陵,277731)

作為醬香型白酒釀造過程中所必須的糖化發(fā)酵劑和生香劑,高溫大曲不僅為發(fā)酵體系提供了豐富的酶系和菌系,亦賦予了酒體豐富的風味物質及其他前體成分[1]。高溫大曲中風味代謝物的形成需要經過復雜的發(fā)酵過程,主要依賴于內源酶和微生物之間的相互作用,其中微生物群落的組成和豐度顯著影響了大曲中風味代謝物的形成[2]。SHI等[3]通過探究黑、白和黃3種高溫大曲的微生物群落和揮發(fā)性代謝產物發(fā)現(xiàn),Thermomyces(嗜熱真菌屬)是所有大曲中共有的優(yōu)勢真菌屬,且Thermoascus(嗜熱子囊菌屬)和Aspergillus(曲霉屬)與大曲中絕大多數(shù)含量豐富的揮發(fā)性代謝物呈正相關。沈世明等[4]通過對高溫大曲微生物群落結構以及曲香風味物質進行分析發(fā)現(xiàn),Byssochlamys(絲衣霉菌屬)和Pichia(畢赤酵母屬)隨著貯存時間的延長逐漸變?yōu)榇笄械膬?yōu)勢真菌屬,且Pichia等酵母屬與酯類物質存在正相關。由此表明,以霉菌和酵母菌為主的真菌群落結構對大曲風味品質的形成具有不可忽視的作用[5],因此探究高溫大曲中真菌微生物群落及其與風味代謝物之間的相關性是很有必要的。

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展,基于免培養(yǎng)的高通量測序技術(high-throughput sequencing,HTS)在食品領域的應用逐漸深入,研究人員可以借助該技術對高溫大曲中大部分微生物群落結構進行解析[6]。JIANG等[7]通過揭示高溫大曲生產過程中微生物群落結構和演替規(guī)律發(fā)現(xiàn),異常威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)為大曲生產初期的優(yōu)勢真菌屬,隨著大曲發(fā)酵溫度升高,Wickerhamomyces逐漸消失,扣囊覆膜酵母屬(Saccharomycopsis)和Thermoascus的豐度逐漸升高,大曲發(fā)酵結束期間,Thermomyces和Thermoascus成為大曲中的優(yōu)勢真菌屬。ZUO等[8]對2種制曲方式下高溫大曲的細菌組成進行研究發(fā)現(xiàn),機制大曲的細菌多樣性和Bacillus相對豐度均高于手工大曲。電子鼻技術具有操作簡單、客觀可靠且重現(xiàn)性良好的優(yōu)勢,可以有效反映樣品中特征揮發(fā)性物質及其風味品質。CAI等[9]對不同類型低溫大曲風味品質進行分析發(fā)現(xiàn),紅心大曲中芳香類物質豐度較高,清茬大曲和后火大曲的風味較為相似。張春林[10]通過對瀘州老窖大曲進行分析表明,電子鼻分析可以有效區(qū)分高溫優(yōu)級大曲與中溫優(yōu)級大曲、中溫普級大曲和高溫普級大曲之間的氣味差異。綜上表明,高溫大曲中微生物群落結構受到發(fā)酵溫度、生產周期和制曲方式等多種因素的影響,因此,利用HTS和電子鼻聯(lián)用技術對高溫大曲中真菌類群與其風味品質的關聯(lián)性進行分析是可行的。

山東省臨沂市蘭陵縣地處我國白酒黃淮流域超級產區(qū),四季分明且雨熱同期,屬于溫帶季風氣候,適合于大多數(shù)微生物的生長繁殖。本研究首先利用MiSeq高通量測序技術對蘭陵高溫大曲中真菌多樣性進行解析,再結合電子鼻對其風味品質進行評價,并進一步探究真菌屬與風味品質之間的關聯(lián)性,以期為高溫大曲風味品質及真菌類群的解析提供數(shù)據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫大曲樣品,采集自山東省臨沂市蘭陵縣某酒廠制曲車間;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA),青島海博生物技術有限公司;QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒,德國QIAGEN公司;引物ITS3F/ITS4R,武漢天一輝遠生物科技有限公司;5×TransStartTMFastPfu Buffer、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、2×PCR Buffer、rTaq酶、PMD 18-T載體,北京全式金生物技術有限公司;Axygen PCR清潔試劑盒,成都康迪生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

AF-08A新型密封式粉碎機,北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司;霉菌培養(yǎng)箱,上海一恒科學儀器有限公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國ProteinSimple公司;NanoDrop ND-2000C微量紫外-可見光分光光度計,美國Nano Drop公司;DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀,北京六一生物科技有限公司;vetiri96 ProFlex梯度基因擴增儀,美國Applied Biosystems公司;PE300型高通量測序平臺,美國Illumina公司;R920型機架式服務器,美國DELL公司;PEN3電子鼻,德國AIRSENSE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集與預處理

本研究使用的高溫大曲由山東省臨沂市蘭陵縣某白酒釀造廠提供(117°41″～118°18″E,34°37′～35°06″N),共隨機采集了15份同一批次黃色高溫大曲樣品,依次編號為LL1～LL15。

1.3.2 高溫大曲中霉菌和酵母菌落計數(shù)

參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》對高溫大曲中霉菌和酵母進行活菌計數(shù),即：稱取25 g大曲樣品,加入到225 mL無菌生理鹽水中進行倍比稀釋,準確吸取1 mL適宜稀釋度的樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿中,采用傾注法注入適量的PDA固體培養(yǎng)基,并在28 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)5 d,每個梯度設置3個平行。

1.3.3 基于高通量測序技術解析大曲真菌多樣性

DNA提?。焊鶕圃焐痰氖褂弥改?利用QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒從2 g大曲樣品中提取總基因組DNA。DNA的提取質量及濃度和純度分別通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外-可見光分光光度計進行檢測與分析[11],檢測合格的DNA樣品進行后續(xù)分析。

PCR擴增：使用引物ITS3F和ITS4R對真菌的內部轉錄間隔區(qū)(ITS1)進行PCR擴增[12]。擴增體系：4 μL的5×PCR緩沖液,4 μL的dNTPs(2.5 mmol/L),0.8 μL的ITS3F(5 μmol/L),0.8 μL的ITS4R(5 μmol/L),0.4 μL的DNA聚合酶(5 U/μL),0.2 μL的BSA和10 ng的DNA模板,并用ddH2O補充至20 μL。擴增參數(shù)：95 ℃預加熱3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃復性45 s,循環(huán)35次;72 ℃保持10 min。PCR的擴增質量通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[13],并利用Axygen PCR清潔試劑盒對檢測合格的PCR產物進行純化。

高通量測序：待測樣品寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,使用PE300型高通量測序平臺將擴增合格的PCR清潔產物進行測序。

1.3.4 序列質控和生物信息學分析

使用QIIME平臺(v1.9.0)對樣品中真菌群落的擴增子序列進行分析。首先參考LI等[14]的方法對原始序列進行質量控制,通過UCLUST兩步法將有效序列按照100%和97%相似度建立分類操作單元(operational taxonomic units,OTU)[15],使用UCHIME算法去除含嵌合體序列OTU[16],選取代表性序列與UNITE數(shù)據庫進行同源性比對并確定物種分類學地位[17],并基于真菌門和屬水平對微生物豐度進行統(tǒng)計,計算樣品中真菌群落α和β多樣性指數(shù)。

1.3.5 基于電子鼻技術分析大曲風味品質

取10 g待測大曲樣品于電子鼻頂空進樣瓶中,樣品體積約占樣品瓶的1/3,并用帶聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene,PTFE)硅膠墊片的頂空瓶蓋密封。每份樣品設置3個平行,并在室溫下平衡30 min后進行頂空進樣。進樣條件[18]：首先傳感器置于干燥空氣中平衡120 s,檢測時間90 s;樣品測試時間60 s,取樣間隔1 s,清洗時間110 s,歸零時間5 s;測量時間、預采樣時間和注射流量分別為90 s、5 s和300 mL/min。選取傳感器信號較為穩(wěn)定的49～51 s為信號采集時間,并將傳感器響應值的平均值用于后續(xù)實驗分析。

1.3.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據處理及可視化分析主要在Excel 2016、Origin 2021、R4.1.0和GraphPad Prism 9中進行與實現(xiàn)。當2組方差不均勻時,采用曼-惠特尼(Mann-Whitney)檢驗法對2個聚類之間進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蘭陵地區(qū)高溫大曲中真菌類群OTU分布和β多樣性分析

采用MiSeq高通量測序技術,本研究從15份蘭陵高溫大曲中共獲得923 724條序列,經過質量控制、去除嵌合體并按照97%相似度被劃分為6 778個OTU。若某一個OTU存在于15個高溫大曲中,則將其定義為核心OTU。本研究首先統(tǒng)計了高溫大曲中OTU的分布情況,并進行了基于加權UniFrac距離的層次聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),結果見圖1。

a-OTU花瓣圖;b-層次聚類分析圖1 高溫大曲真菌類群的OTU花瓣圖和基于加權UniFrac距離的層次聚類分析

由圖1-a可知,15份高溫大曲真菌類群共有12個核心OTU,包含793 381條序列,占有效序列的86.37%。除核心OTU外,不同高溫大曲中亦含有133～534個OTU,包含165～54 035條序列,占有效序列的0.02%～5.88%。由此可見,作為同一批次的高溫大曲,雖然共有大量核心真菌類群,但不同高溫大曲之間真菌群落結構亦存在一定差異。由圖1-b可知,當加權UniFrac距離為5時,除高溫大曲LL2、LL3、LL4、LL6、LL8和LL10外,其余9份高溫大曲明顯聚為一類。因此,本研究將高溫大曲LL1、LL5、LL7、LL9、LL11、LL12、LL13、LL14和LL15定義為聚類I,將高溫大曲LL2、LL3、LL4、LL6、LL8和LL10定義為聚類II。

2.2 蘭陵地區(qū)高溫大曲中霉菌和酵母菌落計數(shù)及真菌類群α多樣性分析

為了更直觀比較2個聚類中真菌類群結構的差異,本研究采用純培養(yǎng)技術對2個聚類中可培養(yǎng)霉菌和酵母進行了菌落計數(shù)分析,并計算了2個聚類真菌類群發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農指數(shù),發(fā)現(xiàn)物種數(shù)可以有效評估樣品中物種豐富度,香農指數(shù)則用于評估物種多樣性[11]。結果如圖2所示。

a-霉菌和酵母菌落數(shù);b-發(fā)現(xiàn)物種數(shù);c-香農指數(shù)圖2 兩個聚類中霉菌和酵母菌落數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農指數(shù)

由圖2可知,聚類I和聚類II的平均霉菌和酵母菌落數(shù)分別為6.37 lgCFU/g和5.82 lgCFU/g,平均發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為182和434,平均香農指數(shù)分別為0.48和2.92。經過Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn),2個聚類高溫大曲中霉菌和酵母菌落數(shù)差異不顯著(P>0.05),而發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農指數(shù)差異極顯著(P<0.001),表明隸屬于聚類I的高溫大曲真菌類群的豐富度和多樣性均顯著偏低。

2.3 蘭陵地區(qū)高溫大曲中真菌類群分析

為進一步探究2個聚類高溫大曲在真菌群落結構上的差異,本研究選取代表性序列與數(shù)據庫進行同源性比對,共鑒定到4個真菌門和32個真菌屬,并對2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌門和屬進行了可視化統(tǒng)計分析。2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌門分布情況及差異分析見圖3。

由圖3可知,高溫大曲中真菌主要隸屬于2個門,分別為Ascomycota(子囊菌門)和Mucoromycota(毛霉門),其在聚類I和聚類II中的平均相對含量分別為99.83%和0.17%以及99.05%和0.94%。經過Mann-Whitney檢驗表明,2個聚類中Ascomycota和Mucoromycota相對含量差異均不顯著(P>0.05)。2個聚類中平均相對含量>0.5%的真菌屬分布情況及差異分析見圖4。

由圖4可知,高溫大曲中真菌主要隸屬于4個屬,分別為隸屬于Ascomycota的Thermomyces、Aspergillus和Thermoascus以及隸屬于Mucoromycota的Thermomucor(嗜熱毛霉屬),其在聚類I和聚類II中的平均相對含量分別為96.44%、1.47%、1.34%和0.13%以及46.60%、37.89%、13.03%和0.93%。經過Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn),較之聚類II,聚類I高溫大曲中Thermomyces相對含量極顯著偏高(P<0.001),而Aspergillus相對含量極顯著偏低(P<0.001)。由圖4-f可知,所有蘭陵高溫大曲中Thermomyces和Aspergillus相對含量呈現(xiàn)極顯著負相關性(P<0.001)。

PANG等[19]對中國北方地區(qū)高溫大曲微生物類群進行分析發(fā)現(xiàn),Thermomyces、Thermoascus、Byssochlamys(絲衣霉屬)和Aspergillus是黑色、白色和黃色大曲中的優(yōu)勢真菌屬,且嗜熱菌Thermomyces和Thermoascus可以編碼與糖化和乙醇發(fā)酵相關的酶。鄧燦等[20]對湖北某酒廠高溫大曲真菌群落進行解析發(fā)現(xiàn),Thermomyces、Thermoascus和Aspergillus是構成大曲微生物群落的3個真菌屬,且優(yōu)級曲中嗜熱菌Thermomyces和Thermoascus占比98.89%,Aspergillus僅占比0.57%,這與本研究中聚類I高溫大曲分析結果相似。通過文獻調研,ZHANG等[21]指出Thermomyces、Thermoascus和Aspergillus是高溫大曲中主要的真菌類群,這與本研究所得結論一致。

2.4 蘭陵地區(qū)高溫大曲風味品質分析

PEN3電子鼻含有對特定揮發(fā)性氣體具有較高靈敏度的金屬傳感器,可以快速且客觀的對樣品進行檢測分析[22]。本研究基于電子鼻技術對大曲樣品的風味品質進行評價,電子鼻傳感器的響應值與風味物質的濃度呈現(xiàn)正相關,通過Mann-Whitney檢驗對兩個聚類的各傳感器響應值進行了比較分析,結果見表1。

表1 兩個聚類高溫大曲風味品質的比較分析(n=15)Table 1 Comparative analysis of flavor quality of two clusters of high-temperature Daqu (n=15)

由表1可知,傳感器W1C對聚類I高溫大曲的響應值比聚類II高,而傳感器W1 W、W2S、W2 W和W3S對聚類I高溫大曲的響應值比聚類II低,且除了傳感器W2 W的響應值在2個聚類之間差異顯著(P<0.05)之外,其余6個傳感器的響應值在2個聚類之間差異均不顯著(P>0.05)。由此表明,較之聚類II,聚類I高溫大曲中有機硫化物含量顯著偏低(P<0.05)。已有報道顯示,芳香類物質是對白酒風味貢獻最大的骨架風味化合物之一[23],而大多數(shù)含硫化合物則具有令人不愉悅的氣味,如具有臭雞蛋味的硫化氫、具有豆腥味的二甲基三硫以及具有洋蔥味的二乙基硫、二甲基二硫和二乙基二硫等[24]。由此可見,聚類I高溫大曲風味品質可能更佳,與上述真菌類群分析推測一致。

2.5 蘭陵地區(qū)高溫大曲真菌屬與風味品質的多元統(tǒng)計學分析

本研究基于主成分分析(principal components analysis,PCA)和普式分析(procrustes analysis),進一步對兩個聚類高溫大曲中平均相對含量>0.5%的真菌屬與風味品質評價指標進行了空間排布和形狀映射,結果見圖5。

a-因子得分圖;b-因子載荷圖;b-普式分析圖5 基于高溫大曲真菌屬與風味指標的主成分分析和普式分析

由圖5-a可知,第一主成分包括Thermomyces、Aspergillus、W1C(對芳香類物質靈敏)、W2S(對乙醇靈敏)、W2W(對有機硫化物靈敏)和W3S(對烷烴靈敏)共6個指標,第二主成分包括Thermoascus、Thermomucor、W3C(對氨氣、芳香類物質靈敏)、W5C(對烷烴、芳香類物質靈敏)和W1W(對有機硫化物、萜類物質靈敏)共5個指標,累計貢獻率為71.79%。此外,Thermomyces以及傳感器W1C、W3C和W5C敏感的物質均分布于Y軸左側,Thermoascus、Aspergillus和Thermomucor以及傳感器W2S、W3S、W1W和W2W敏感的物質均分布于Y軸右側。由圖5-b可知,隸屬于聚類I的高溫大曲主要集中分布于Y軸左側和第四象限,隸屬于聚類II的高溫大曲則主要分布于Y軸右側和第三象限且空間排布分散。由此表明,隸屬于聚類I的高溫大曲Thermomyces豐度較高且芳香類物質含量豐富,隸屬于聚類II的高溫大曲Thermoascus、Aspergillus和Thermomucor以及有機硫化物等物質含量較高。

由圖5-c可知,通過對高溫大曲中菌群豐度和風味強度的數(shù)據進行降維,納入本研究的樣品在一個低維空間內產生了形狀映射,本研究在此基礎上進行了點坐標之間偏差平方和(M2值)計算和顯著性檢驗(P值),結果表明高溫大曲中平均相對含量>0.5%的真菌屬與風味因子之間具有非常顯著的相關性(P<0.01)。由此可知,高溫大曲在賦予發(fā)酵體系酶系和菌系的同時,對其風味品質亦產生了影響。基于Spearman相關性分析技術,本研究進一步探究了真菌屬與風味指標之間的關聯(lián)性,如圖6所示。

由圖6-a可知,Thermomyces與傳感器W2W的響應值呈非常顯著負相關(P<0.01),Thermoascus與傳感器W2W的響應值呈顯著正相關(P<0.05),與傳感器W3C的響應值呈顯著負相關(P<0.05),Thermomucor與傳感器W1W的響應值呈非常顯著正相關(P<0.01),與傳感器WIC的響應值呈顯著負相關(P<0.05)。由此表明,高溫大曲中Thermomyces與有機硫化物存在顯著負相關,而Thermoascus和Thermomucor與有機硫化物存在顯著正相關,與芳香類物質存在顯著負相關。由圖6-b和圖6-c可知,與高溫大曲風味品質具有顯著相關性的真菌屬之間亦存在一定的關聯(lián)性,且Thermomyces和Thermoascus之間呈現(xiàn)顯著負相關(P<0.05)。綜合上述分析可知,隸屬于聚類I的高溫大曲Thermomyces和芳香類物質含量豐富,且與Thermoascus和Thermomucor之間存在一定的負相關性,這表明Thermomyces對高溫大曲風味品質形成可能具有積極貢獻。

3 結論

本研究將15份蘭陵地區(qū)高溫大曲劃分為兩個聚類,研究發(fā)現(xiàn),對兩個聚類高溫大曲的劃分具有重要影響的真菌類群主要為Thermomyces、Aspergillus、Thermoascus和Thermomucor。其中,Thermomyces相對含量豐富的聚類I高溫大曲中芳香類物質含量明顯偏高,Aspergillus、Thermoascus和Thermomucor相對含量較高的聚類II高溫大曲中有機硫化物含量明顯偏高。由此可見,Thermomyces對高溫大曲風味品質形成可能具有積極貢獻。