王冠娜,鄭義培,鄭璞

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

香蘭素以游離態(tài)和葡萄糖苷的形式存在于植物及植物提取物中,如香莢蘭豆、丁香油、甜菜根、秘魯香脂、吐魯香脂和天冬門(mén)等,其中較集中存在于香莢蘭豆中[1]。純凈的香蘭素具有濃郁的奶香氣,有“香料之王”的美譽(yù),被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、香料和醫(yī)藥等領(lǐng)域中[2]。目前,市場(chǎng)上香蘭素的生產(chǎn)方式主要包括植物提取法、微生物轉(zhuǎn)化法和化學(xué)合成法[3]。植物提取法主要是從香莢蘭豆中提取香蘭素,但香莢蘭的種植受氣候的影響,其產(chǎn)量有限,價(jià)格昂貴,不能滿足市場(chǎng)需求?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)的香蘭素價(jià)格低廉,但其生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染,而且香型單一,安全性也備受質(zhì)疑,不符合下游應(yīng)用市場(chǎng)對(duì)天然原料的消費(fèi)趨勢(shì),并且歐盟(European Union,EU)和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)不允許將其用于食品[4]。天然底物經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的香蘭素被稱為“天然香蘭素”。以天然阿魏酸為底物,微生物生產(chǎn)的香蘭素在價(jià)格和品質(zhì)方面都比化學(xué)合成的香蘭素占有優(yōu)勢(shì)。其中,Amycolatopsissp.ATCC 39116[5]和Streptomycessp.strain V-1[6]用于阿魏酸發(fā)酵生產(chǎn)天然香蘭素,產(chǎn)量可達(dá)10 g/L以上。

全基因組測(cè)序是對(duì)未知基因組序列的生物體進(jìn)行高通量DNA測(cè)序和生物信息學(xué)組裝以獲得全基因組序列信息[7]。全基因組測(cè)序有助于了解菌株代謝特點(diǎn),認(rèn)識(shí)其遺傳信息與生理功能之間的聯(lián)系[8-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期篩選到1株擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsissp.)CCTCC NO：M2011265,它可以轉(zhuǎn)化阿魏酸合成香蘭素[11-13];為深入了解擬無(wú)枝酸菌中參與香蘭素合成的功能基因及其代謝通路信息,本文通過(guò)第二代全基因組測(cè)序技術(shù),獲得擬無(wú)枝酸菌的全基因組信息,然后根據(jù)已報(bào)道的香蘭素合成的基因信息,挖掘擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsissp.)CCTCC NO：M2011265潛在參與香蘭素生物合成的功能基因。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsissp.)CCTCC NO：M 2011265保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物中心,E.coliJM109和E.coliJM110均為市售菌株,質(zhì)粒pULcrRNA由中國(guó)上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王金教授贈(zèng)予;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(柱式法),寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;質(zhì)粒小量制備試劑盒,上海捷瑞生物工程有限公司;ClonExpress Ⅱ 多片段克隆試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;引物合成和PCR產(chǎn)物測(cè)序,金唯智生物科技有限公司;天然阿魏酸,西安冠宇生物技術(shù)有限公司;安普霉素(apramycin,Apr),生工生物工程(上海)有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨,英國(guó)OXOID有限公司;瓊脂粉、牛肉浸膏、酵母浸膏、蔗糖、冰醋酸、甲醇、氯化鈉,國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

5418離心機(jī)、Eporator電轉(zhuǎn)儀,德國(guó)艾本德公司;HH-4恒溫水浴鍋,榮華儀器制造有限公司;G154DWS立式高壓滅菌鍋,美國(guó)致微公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Waters2487高效液相色譜儀,美國(guó)Waters公司;DYCP-31DN核酸電泳儀,北京六一儀器有限公司;Tanon-3500R凝膠成像儀,上海天能科技有限公司;SPX-150-B生化培養(yǎng)箱,上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;HYL-C組合式搖床,太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;9700A-PCR儀,南京賽飛生物科技公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[12],本氏培養(yǎng)基、YEME培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體的活化與培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱取出保存菌種甘油管,放置冰上融化后用接種環(huán)沾取少量的菌液,在本氏固體培養(yǎng)基上劃線,30 ℃培養(yǎng)7 d后挑取單菌落,接種至本氏液體培養(yǎng)基于30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 基因組DNA提取、測(cè)序與功能注釋

將斜面保存的擬無(wú)枝酸菌接種于新鮮的本氏培養(yǎng)基中,在30 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)28 h,獲得擬無(wú)枝酸菌菌液,使用柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取擬無(wú)枝酸菌基因組DNA。提取好的擬無(wú)枝酸菌基因組DNA經(jīng)0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用核酸檢測(cè)儀測(cè)量基因組DNA的濃度,并將合格的樣品委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因組測(cè)序。使用Illumina Hiseq platform進(jìn)行基因組測(cè)序、利用FastQC對(duì)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行可視化評(píng)估,為了保證信息分析質(zhì)量,對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,得到Clean數(shù)據(jù)。Reads質(zhì)量的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：90%以上的堿基Q值>20。序列拼接使用SPAdes-3.5.0軟件,利用軟件Prokka結(jié)合Swiss-Prot庫(kù)注釋,分別使用KOBAS工具、rpsblast工具、和blast2GO算法,將預(yù)測(cè)的基因分別與KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)以注釋其功能[14-17]。

1.2.3 香蘭素合成與代謝基因篩選

根據(jù)已知產(chǎn)香蘭素模式菌株Amycolatopsissp.ATCC 39116(GenBank：NZ_AFWY00000000.3)的產(chǎn)香蘭素的關(guān)鍵基因,利用NCBI的BLAST工具(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265的全基因組序列進(jìn)行序列相似性分析,篩選擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265基因組中可能參與香蘭素生物合成的功能基因。

1.2.4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Amycolatopsissp.ATCC 39116的ech-fcs和ech2基因設(shè)計(jì)引物,以擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M 2011265基因組作為模版,分別用引物P1(5′-GTATCTGAAAGGGGATACGCATGAGCACAGCGGTCG-GCAACGGGC-3′)/P2(5′-GCGACGTAGATGACCTGGCCTCAGCCG-AAGCGGCGGCGGACCTCG-3′)和P3(5′-TCCGCCGCCGCTTCGGCTGAGGCCAGGTCATCT-ACGTCGC-3′)/P4(5′-GGGAGATCTACTAGTACGGT-CTTGCCCTGGCTGAACC-3′)擴(kuò)增獲得ech-fcs和ech2片段,通過(guò)一步克隆將回收的ech-fcs、ech2片段和線性化pULcrRNA質(zhì)粒按照2∶1的摩爾比,在37 ℃下反應(yīng)30 min連接。以上連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中,37 ℃孵育45 min后涂布在對(duì)應(yīng)抗性平板上,獲得的轉(zhuǎn)化子使用引物P5(5′-GCTGCTCCTTCGGTCGGACGT-3′)和P6(5′-CACTACTTCTCCGGGTCGA-3′)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pULwgn03。

1.2.5 過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建

將擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265從斜面接到新鮮的YEME培養(yǎng)基,30 ℃,220 r/min培養(yǎng)36～48 h后以5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的YEME培養(yǎng)基,30 ℃,220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)約12 h,將菌體放于冰上冰浴30 min;隨后4 ℃,5 000 r/min,離心5 min收集菌體;倒掉上清液,用冰浴的電擊緩沖液洗滌2～3次,然后用1～2 mL電擊緩沖液重懸菌液。將菌液按每份100 μL裝入1.5 mL離心管中。pULwgn03質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliJM110去甲基化;獲得的質(zhì)粒于98 ℃加熱10 min后立即放在冰上冷卻,與擬無(wú)枝酸菌感受細(xì)胞態(tài)輕輕混勻,冰上放置5 min,隨后加入0.1 cm預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯中,放置于電轉(zhuǎn)儀中,電轉(zhuǎn)條件為1 800 V、5 ms。電擊后立刻加入預(yù)熱本氏培養(yǎng)基,30 ℃,220 r/min孵育約4 h。菌液在5 000 r/min的條件下離心5 min,去除上清液,將菌體重懸涂布于含有安普霉素的固體本氏培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)5～7 d,使用P5/P6引物進(jìn)行菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.6 過(guò)表達(dá)菌株搖瓶發(fā)酵分析

阿魏酸生物轉(zhuǎn)化分為兩階段法：生長(zhǎng)階段和轉(zhuǎn)化階段。種子液的獲得：從斜面保存的過(guò)表達(dá)菌株接兩環(huán)于種子培養(yǎng)基中30 ℃,220 r/min培養(yǎng)36 h左右獲得種子液。按10%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,溫度30 ℃,220 r/min培養(yǎng)16～24 h,加入終質(zhì)量濃度為12 g/L的底物阿魏酸,同時(shí)溫度上升至35 ℃。間隔取樣,測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的OD600、阿魏酸和香蘭素的含量。

1.2.7 分析方法

取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min下離心5 min,稀釋10倍后用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后,進(jìn)行HPLC分析。色譜柱采用C18柱,進(jìn)樣體積為10 μL,柱溫35 ℃,流動(dòng)相為30%甲醇和0.1%乙酸為流動(dòng)相,流速為1 mL/min,波長(zhǎng)選擇280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的質(zhì)檢

擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsissp.)CCTCC NO：M2011265基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢(圖1),結(jié)果為單一且無(wú)明顯彌散的條帶,表明提取基因組DNA的質(zhì)量較好。如表1的結(jié)果顯示擬無(wú)枝酸菌基因組的總量為0.85 μg,OD260/OD280值為1.80,說(shuō)明基因組DNA無(wú)降解、無(wú)污染,達(dá)到基因組DNA測(cè)序要求,將合格的樣品委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序、拼接、注釋和生物信息學(xué)分析。

表1 擬無(wú)酸菌基因組DNA濃度Table 1 Concentration of Amycolatopsis sp.genomic DNA

圖1 擬無(wú)枝酸菌基因組 DNA 電泳圖

2.2 擬無(wú)枝酸菌全基因組概況

擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265可以轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素,為了更全面地了解擬無(wú)枝酸菌合成香蘭素基因信息,采用從頭測(cè)序技術(shù)對(duì)擬無(wú)枝酸菌菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析,得到2 726 966 400 bp測(cè)序數(shù)據(jù)量,使用軟件SPAdes進(jìn)行初步組裝后將組裝結(jié)果進(jìn)行比對(duì)評(píng)估,組裝總共得到64個(gè)scaffolds,總長(zhǎng)度為8 425 551 bp,其中scaffold平均長(zhǎng)度為131 649 bp,最大scaffolds長(zhǎng)度為716 347 bp,整個(gè)基因組組裝大小約為8.43 M,總GC含量為71.89%,N50長(zhǎng)度為363 153 bp。上述結(jié)果表明擬無(wú)枝酸菌基因組的組裝質(zhì)量較好,結(jié)果如表2所示。

表2 擬無(wú)枝酸菌基因組序列拼接結(jié)果Table 2 Results of genome splicing of Amycolatopsis sp.

2.3 基因的預(yù)測(cè)與功能注釋

將上述得到的基因組數(shù)據(jù)分別使用blast2GO算法、rpsblast工具和KOBAS工具與GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和功能注釋[18-19]。結(jié)果共有8 185個(gè)基因得到注釋,占基因總數(shù)的97.04%,其中,在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到功能注釋的基因較多,為6 910個(gè),占基因總數(shù)的84.40%。在GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋的基因分別是5 386和2 824個(gè),分別占基因總數(shù)的65.80%和34.50%。

2.3.1 COG注釋

COG數(shù)據(jù)庫(kù)按照功能一共可以共分為26類(lèi),由擬無(wú)枝酸菌的COG功能注釋統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知,在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中一共有6 910個(gè)基因得到注釋,占全部編碼基因的百分比為84.40%(圖2)。其中Mobilome：prophages,transposons這一分類(lèi)沒(méi)有被注釋到,一般功能預(yù)測(cè)基因富集最為顯著,達(dá)到1 065個(gè),其次是轉(zhuǎn)錄類(lèi)別基因注釋為968個(gè),而碳水化合物運(yùn)輸與代謝、氨基酸運(yùn)輸與代謝、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因注釋也相對(duì)較多,分別為555、554、550和447個(gè)。

圖2 擬無(wú)枝酸菌預(yù)測(cè)基因的 COG 注釋圖

2.3.2 GO數(shù)據(jù)庫(kù)

GO數(shù)據(jù)庫(kù)是基因功能描述的分類(lèi)系統(tǒng)?？偦虻?5.80%(5 386)在GO數(shù)據(jù)庫(kù)得到了注釋,注釋結(jié)果由細(xì)胞組分(cellular component,)、分子功能(molecular function)和生物過(guò)程(biological process)組成。GO注釋蛋白質(zhì)分類(lèi)顯示,其中“生物過(guò)程”類(lèi)別注釋了4 060個(gè)基因、“分子功能”類(lèi)別注釋了4 159個(gè)基因和細(xì)胞組分類(lèi)別注釋了2 327個(gè)基因,且大部分基因被注釋了多個(gè)類(lèi)別,表明了擬無(wú)枝酸菌擁有較為旺盛的初級(jí)和次級(jí)代謝過(guò)程。

2.3.3 KEGG注釋

將擬無(wú)枝酸菌的氨基酸序列與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì),共有34.5%(2 824)的基因得到了注釋,比對(duì)到了1 665個(gè)KO號(hào)。其中ABC 2型運(yùn)輸系統(tǒng)-ATP結(jié)合蛋白(KO1990：ABC-2 type transport system ATP-binding protein)預(yù)測(cè)到基因最多,其次是ABC 2型運(yùn)輸系統(tǒng)-通透酶蛋白(KO1992：ABC-2 type transport system permease protein)。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有占總數(shù)18.6%(1 523)的基因得到了注釋,其中部分基因被注釋到了多條途徑,如圖3所示,擬無(wú)枝酸菌基因組中基因注釋最多的15條途徑。其中有986個(gè)基因被注釋到代謝途徑(KO01100：metabolic pathways),其次為次不同環(huán)境中微生物代謝(KO01120：microbial metabolism in diverse environments),共有476個(gè)。

圖3 擬無(wú)枝酸菌預(yù)測(cè)基因的部分 KEGG Pathway 注釋結(jié)果

2.4 香蘭素合成與代謝途徑相關(guān)基因預(yù)測(cè)

根據(jù)GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果,將疑似基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),挖掘與香蘭素合成與代謝相關(guān)的基因。其中在GO注釋結(jié)果中挖掘到了1個(gè)與香蘭素合成的基因z4344,將其氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),確定為阿魏酰輔酶A合成酶(fcs);在KEGG注釋結(jié)果中挖掘到了1個(gè)與香蘭素合成的基因z4343,將其氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),確定為烯酰輔酶A醛縮酶(ech)。此外,參考其他細(xì)菌中香蘭素合成代謝途徑,結(jié)合3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果,檢索到了2個(gè)關(guān)鍵基因z7967和z8076,分別為烯酰輔酶A醛縮酶2(ech2)和香蘭素脫氫酶(vdh)。其中,烯酰輔酶A醛縮酶2在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為：烯酰輔酶A醛縮酶活性(enoyl-CoA hydratase activity);在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝(enoyl-CoA hydratase activity)。香蘭素脫氫酶在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為：苯甲醛脫氫酶(benzaldehyde dehydrogenase);在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為：醛脫氫酶活性(aldehyde dehydrogenase activity);COG數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋為：能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換(energy production and conversion)。將這4個(gè)酶與NCBI中其他來(lái)源序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果如表3所示。

表3 相關(guān)的序列比對(duì)結(jié)果 單位：%

如表4所示香蘭素合成與代謝相關(guān)酶基本信息,其中fcs基因與ech基因?yàn)橥粋€(gè)基因簇。此外,參考其他細(xì)菌中香蘭素合成代謝途徑[20],推測(cè)阿魏酸在擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265中是在FCS的作用下生成阿魏酰輔酶A,在ECH和ECH2的共同作用下生成香蘭素,最后在VDH的作用下生成香草酸,相關(guān)的代謝反應(yīng)推測(cè)如圖4所示。

表4 香蘭素合成與代謝相關(guān)的酶Table 4 Enzymes involved in vanillin synthesis and catabolism

圖4 擬無(wú)枝酸菌中香蘭素合成與分解代謝途徑

2.5 過(guò)表達(dá)(ech-fcs-ech2)菌株轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的分析

2.5.1 過(guò)表達(dá)菌株的構(gòu)建

首先以擬無(wú)枝酸基因組為模板,分別利用引物P1/P2和P3/P4擴(kuò)增獲得ech-fcs基因片段和ech2基因片段,如圖5-a所示,ech-fcs基因片段目的條帶約為2 200 bp,與實(shí)際大小2 339 bp吻合,ech2基因片段目的條帶約為400 bp,與實(shí)際大小453 bp吻合,隨后將這2個(gè)基因片段與線性化pULcrRNA質(zhì)粒相連,成功構(gòu)建出過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pULwgn03。將重組質(zhì)粒pULwgn03電轉(zhuǎn)入野生型擬無(wú)枝酸菌中,涂布在含有安普霉素平板上,生長(zhǎng)5～7 d后,隨機(jī)挑選10個(gè)轉(zhuǎn)化子,使用引物P5/P6進(jìn)行的菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證,如圖5-b所示,目的條帶約為3 000 bp,與實(shí)際大小2 792 bp吻合,說(shuō)明ech-fcs-ech2過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

a-ech-fcs、ech2基因的PCR產(chǎn)物(M-DNA marker;1-ech-fcs基因片段;2-ech2基因片段);b-轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定結(jié)果(M-DNA marker;1～10-單菌落)圖5 目的基因ech-fcs、ech2和轉(zhuǎn)化子的電泳圖

2.5.2 過(guò)表達(dá)菌株的發(fā)酵分析

按照1.2.6節(jié)發(fā)酵方法將過(guò)表達(dá)菌株與野生型分別接入搖瓶發(fā)酵,研究過(guò)表達(dá)fcs、ech和ech2基因?qū)贽D(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素的影響。從圖6-a中可以看出過(guò)表達(dá)菌株與野生型的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線有顯著性差異,過(guò)表達(dá)菌株在48 h后,發(fā)酵生長(zhǎng)曲線迅速下降,推測(cè)是fcs-ech-ech2的組成型表達(dá)引起了香蘭素的快速合成,短時(shí)間內(nèi)積累高濃度的香蘭素對(duì)菌體有一定毒害作用,轉(zhuǎn)化至55 h,過(guò)表達(dá)菌株底物阿魏酸基本上已經(jīng)消耗殆盡了,轉(zhuǎn)化停止,此時(shí)過(guò)表達(dá)菌株中發(fā)酵液香蘭素質(zhì)量濃度達(dá)到了11.06 g/L,而野生型菌株的底物阿魏酸殘余量為6.41 g/L,香蘭素的質(zhì)量濃度為4.67 g/L(圖6-b、圖6-c)。過(guò)表達(dá)菌株代謝阿魏酸和生成香蘭素的速率均比野生型快,發(fā)酵時(shí)間比野生型縮短了一半,野生型在轉(zhuǎn)化94 h時(shí)香蘭素產(chǎn)量為7.77 g/L(圖6-c),過(guò)表達(dá)菌株比野生型產(chǎn)香蘭素的濃度提高了42.30%。上述搖瓶發(fā)酵結(jié)果證明了ech、fcs、ech2基因與香蘭素合成密切相關(guān)。

a-OD600;b-阿魏酸的質(zhì)量濃度;c-香蘭素的質(zhì)量濃度圖6 野生型菌株和過(guò)表達(dá)菌株對(duì)阿魏酸的轉(zhuǎn)化

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用Illumina二代測(cè)序技術(shù)對(duì)擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265進(jìn)行了全基因組的測(cè)序,獲得了64個(gè)scaffolds,總長(zhǎng)度為8 425 551 bp,GC含量71.89%,包含8 185個(gè)預(yù)測(cè)編碼蛋白。同時(shí)對(duì)組裝的基因組進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)、功能注釋和聚類(lèi)分析。最終獲得的這些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)有益于從分子水平上認(rèn)識(shí)擬無(wú)枝酸菌CCTCC NO：M2011265的生理功能、代謝特性。通過(guò)生物信息學(xué)分析得到香蘭素合成相關(guān)基因ech、fcs和ech2基因,其中ech和fcs為一個(gè)基因簇,香蘭素分解代謝相關(guān)基因,vdh基因,與已報(bào)道Amycolatopsissp.ATCC 39116香蘭素合成與分解代謝的基因一致。構(gòu)建的過(guò)表達(dá)ech-fcs-ech2菌株代謝阿魏酸和生成香蘭素的速率均比野生型快,發(fā)酵時(shí)間比野生型縮短了一半。過(guò)表達(dá)菌株最終產(chǎn)香蘭素質(zhì)量濃度為11.06 g/L,野生型為7.77 g/L,比野生型產(chǎn)香蘭素的濃度提高了42.30%,進(jìn)一步證明了ech、fcs和ech2基因與香蘭素生物合成密切相關(guān)。