于勁松，黃 煦，任方圓，黎瑛婕，李朝霞，阿麗婭，呂欣欣，曹 慧，袁 敏，葉 泰，吳秀秀，郝麗玲，徐 斐

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院/上海食品快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，上海，200093

鎘離子作為一種對(duì)人體危害性極大的重金屬離子，是一種世界公認(rèn)的嚴(yán)重污染物，并且很多產(chǎn)品都設(shè)立了對(duì)鎘含量的限值[1-2]。目前已有的檢測(cè)手段，都需要經(jīng)歷較為復(fù)雜的前處理過(guò)程，將鎘離子富集和分離[3-5]。而離子印跡技術(shù)作為一種重要的重金屬檢測(cè)技術(shù)已逐漸被運(yùn)用于很多關(guān)鍵領(lǐng)域，離子印跡技術(shù)一般以離子為模板，通過(guò)靜電作用和配位作用等手段與功能單體結(jié)合，形成螯合物，之后以酸性試劑為洗脫劑，將模板離子從螯合物上洗脫[6-8]。最終制備出具有與目標(biāo)金屬離子相對(duì)應(yīng)的三維孔穴結(jié)構(gòu)的離子印跡聚合物[9]?，F(xiàn)如今，離子印跡技術(shù)已逐漸被應(yīng)用于食品，分析化學(xué)，工業(yè)廢水治理等領(lǐng)域[10-11]。

但值得注意的是，離子印跡檢測(cè)技術(shù)仍需要進(jìn)一步完善，其主要問(wèn)題在于金屬離子半徑過(guò)小，且各種金屬離子結(jié)構(gòu)相近，導(dǎo)致目前常用的功能單體都無(wú)法做到將特異性與模板離子的特異性相結(jié)合[12-13]?；诖?。本研究的主要目標(biāo)就是探究重金屬鎘離子和功能單體鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸（GMP）的結(jié)合機(jī)理，為篩選出可以與鎘離子的特異性結(jié)合的優(yōu)秀功能單體提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究中采用等溫滴定量熱法研究二者的親合機(jī)理。等溫滴定量熱法（ITC）是一種直接測(cè)量雙分子反應(yīng)過(guò)程中熱量釋放或消耗的物理技術(shù)，是一種在恒定溫度下配體與大分子接觸的分析方法[14-15]。它根據(jù)熱力學(xué)的基本原理工作，兩個(gè)分子之間的接觸會(huì)導(dǎo)致熱量產(chǎn)生還是吸收，往往取決于結(jié)合的類(lèi)型，即放熱或吸熱[16-17]。通過(guò)對(duì)ITC 結(jié)果進(jìn)行分析，可以定量測(cè)定分子結(jié)合過(guò)程中的化學(xué)計(jì)量比（N）、親合常數(shù)（K）、焓變（ΔH）和熵變（ΔS）等參數(shù)[14]。獲取的這些參數(shù)將為研究鎘離子與單體的親合機(jī)理提供直接的熱力學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鎘、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）及氫氧化鈉均購(gòu)自國(guó)藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鳥(niǎo)嘌呤核糖核苷酸（GMP）購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

等溫滴定量熱儀（ITC200）（美國(guó)馬爾文儀器有限公司）；Heraeus TMFresco TM17 離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；Brand 普蘭德單道可調(diào)移液器（德國(guó)普蘭德Brand 有限公司）；磁力攪拌器（IKA）、pH 計(jì)（梅特勒托利多）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）溶液配制：用pH 7.5 的HEPES 緩沖溶液按實(shí)驗(yàn)所需配制不同濃度的氯化鎘和GMP 溶液。

（2）溶液脫氣：因?yàn)榈葴亓繜岬味ǚy(cè)量的是微量反應(yīng)熱，溶液中含有氣泡會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大的誤差。為了預(yù)防產(chǎn)生誤差，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，需要對(duì)溶液進(jìn)行離心，這樣不僅可以使溶液體系均勻，還可以去除其中的氣泡。在配制完溶液后，將其放入離心機(jī)中，在25 ℃的條件下，離心5 min。

（3）樣品池加樣：使用專(zhuān)用進(jìn)樣針抽取離心管中的樣品，在抽取過(guò)程中要盡量保證進(jìn)樣針內(nèi)無(wú)氣泡進(jìn)入，抽取之量大概為樣針的三分之二。抽取完畢后，將進(jìn)樣針插入樣品池中，緩慢勻速地將樣品推入樣品池中，直到樣品與樣品池等高。之后用針筒的針頭緩慢攪動(dòng)樣品池，排出樣品池中的氣泡。

（4）滴定注射器加樣：在樣品進(jìn)樣完畢之后，將裝有滴定物的PCR 管放到儀器的對(duì)應(yīng)孔中，儀器就會(huì)自動(dòng)抽取一定體積的滴定物。在儀器抽取完滴定物之后，需確認(rèn)滴定注射器內(nèi)是否含有氣泡，如果有，則需操作儀器重新取樣，直到滴定注射器中沒(méi)有氣泡。

（5）進(jìn)行等溫量熱滴定實(shí)驗(yàn)：在滴定物裝載完畢后，將滴定物注射器插入樣品池中，按照提前設(shè)定好的滴數(shù)和相關(guān)參數(shù)將滴定物加入樣品池中，用滴定物注射器進(jìn)行攪拌，使滴定物和被滴定物充分結(jié)合。

（6）數(shù)據(jù)處理：將通過(guò)ITC 得到的熱反應(yīng)曲線導(dǎo)入ITC200 配套的original 軟件中，通過(guò)軟件計(jì)算得出反應(yīng)熱曲線的各項(xiàng)數(shù)值，結(jié)合常數(shù)K，化學(xué)計(jì)量比N，焓變?chǔ)，熵變?chǔ)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選用的緩沖液為非離子緩沖液HEPES。非離子型緩沖液可以減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中緩沖背景對(duì)電導(dǎo)率測(cè)試的干擾。為了研究GMP 與鎘離子的作用機(jī)理，實(shí)驗(yàn)分別選取四種比例濃度的GMP 和鎘離子進(jìn)行反應(yīng)，分別為：5∶1、8∶1、10∶1 和20∶1，即將5、8、10、20 mmol/L 的氯化鎘分成20 滴逐滴加到1 mmol/L 中的GMP 中。其中探針中氯化鎘的總體積為40 μL，除了第一滴為0.4 μL 外，其他19 滴都為2 μL，GMP 的體積為210 μL。

此外，還需進(jìn)行背景滴定實(shí)驗(yàn)。分別用5、8、10、20 mmol/L 的氯化鎘滴定實(shí)驗(yàn)所用的緩沖溶液HEPES，使最終結(jié)果扣除背景的影響。背景扣除也是采用ITC200 配套的original 軟件進(jìn)行的。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例的鎘離子與GMP 的等溫滴定量熱研究

2.1.1 鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時(shí)的ITC 實(shí)驗(yàn)研究

圖1 是鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時(shí)的ITC滴定曲線和OneSite 模型擬合結(jié)果，圖中上半部分的兩條曲線分別為鎘離子滴加到緩沖液中所產(chǎn)生的背景熱量和鎘離子與GMP 結(jié)合產(chǎn)生的熱量變化曲線。兩條曲線本來(lái)都是以縱坐標(biāo)0 為基線的，但為了方便比較，都將背景熱量向上平移了4 個(gè)單位，之后的幾組數(shù)據(jù)也采用了同樣的處理方式。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，一共向GMP 中滴加了20 滴鎘液，除了第一滴鎘液是用來(lái)確定基線的，之后每一個(gè)峰都代表著一滴鎘液滴加到GMP 中所產(chǎn)生的熱量變化。在這個(gè)濃度比中，每個(gè)反應(yīng)峰都在基線以下，說(shuō)明電源代償?shù)墓β蕿樨?fù)值，參比池的溫度低于樣品池，由此得知此過(guò)程為放熱反應(yīng)。而終點(diǎn)的峰并未返回基線，說(shuō)明在這個(gè)濃度比中，GMP 未全部與鎘離子結(jié)合。

圖1 鎘離子和GMP 濃度比為5∶1 時(shí)的ITC 圖譜

圖1 的下半部分，是將圖1 上半部分兩條熱量變化曲線的每個(gè)峰值相減，再積分求它們的面積，最后得到19 個(gè)數(shù)值，擬合出來(lái)的就是下邊的曲線，它反映了整個(gè)結(jié)合過(guò)程中的熱量變化。圖的縱坐標(biāo)為反應(yīng)的熱量，橫坐標(biāo)為摩爾比率，在該反應(yīng)過(guò)程中，曲線斜率變化不大，說(shuō)明該反應(yīng)是以一種較為均勻的速度進(jìn)行的。右邊方框里的四個(gè)數(shù)值分別為結(jié)合常數(shù)K，化學(xué)計(jì)量比N，焓變量ΔH，熵變量ΔS。N 值反應(yīng)了鎘離子與GMP 的反應(yīng)比例，K 值反應(yīng)了鎘離子與GMP 結(jié)合的性能。在此反應(yīng)中K 值大約為1.51E 3，說(shuō)明其結(jié)合性能并不理想。焓變值ΔH 和熵變值ΔS 分別代表整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中的熱量變化和體系混亂程度的變化，在此濃度中，ΔH＜0，ΔS＞0，根據(jù)吉布斯函數(shù)公式ΔG=ΔH-TΔS，ΔG＜0，說(shuō)明該反應(yīng)是一個(gè)以焓變?yōu)橹饕?qū)動(dòng)力的自發(fā)反應(yīng)，可以在任何條件下自發(fā)進(jìn)行。

2.1.2 鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時(shí)的ITC 實(shí)驗(yàn)研究

圖2 是鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時(shí)ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結(jié)果，從上半部分的兩張圖可以看出，比值為5∶1 時(shí)，該濃度下熱量變化曲線的最后幾個(gè)峰已經(jīng)接近基線了，但還沒(méi)有完全回到基線，說(shuō)明GMP 仍未反應(yīng)完全。

圖2 鎘離子和GMP 濃度比為8∶1 時(shí)的ITC 圖譜

從圖下半部分的曲線可以看出，一開(kāi)始斜率較大，之后慢慢趨于平緩，進(jìn)入了一個(gè)平臺(tái)期。而右邊的圖框顯示N 值變小了，這是由于鎘離子的濃度變高，其化學(xué)計(jì)量比下降了。而K 值增加（8.92E 3），說(shuō)明在該濃度下，鎘離子與GMP 的結(jié)合更加穩(wěn)定了。同時(shí)表明，該反應(yīng)也是一個(gè)以焓變?yōu)橹饕?qū)動(dòng)力的自發(fā)反應(yīng)。

2.1.3 鎘離子和GMP 濃度比為10∶1 時(shí)的ITC 實(shí)驗(yàn)研究

圖3 是鎘離子與GMP 的濃度比為10∶1 時(shí)ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結(jié)果，該圖相較于上述兩個(gè)濃度的ITC 曲線明顯不同。從上半部分的圖可以明顯看出整個(gè)反應(yīng)從放熱反應(yīng)變?yōu)榱宋鼰岱磻?yīng)。但在第一個(gè)吸熱峰之后存在一個(gè)小的放熱峰，所以推測(cè)可能同時(shí)存在吸熱和放熱兩種反應(yīng)。

圖3 鎘離子和GMP 濃度比為10∶1 時(shí)的ITC 圖譜

從圖的下半部分來(lái)看，曲線的構(gòu)型與前兩個(gè)濃度正好相反，說(shuō)明在該濃度下，而者的結(jié)合反應(yīng)發(fā)生了變化。而從圖中的擬合參數(shù)可知，N 值高達(dá)1.89，幾乎是前兩個(gè)濃度的N 值的兩倍，說(shuō)明鎘和GMP的結(jié)合比例大約為2∶1。該濃度比例下，K 值是前兩個(gè)濃度的10 倍，但K 值的誤差也較大，為6.01E 4±1.50E 5，說(shuō)明該比例下的擬合結(jié)果不理想。

2.1.4 鎘離子和GMP 濃度比為20∶1 時(shí)的ITC 實(shí)驗(yàn)研究

圖4 是鎘離子和GMP 的濃度比為20∶1 時(shí)ITC 滴定曲線和OneSite 模型的擬合結(jié)果。從圖中上半部分的滴定曲線可知，鎘離子與GMP 的結(jié)合延續(xù)了10∶1 的濃度比，一開(kāi)始為吸熱反應(yīng)，且反應(yīng)迅速；第6 滴之后，滴定曲線顯示，二者的結(jié)合過(guò)程從吸熱反應(yīng)變成了放熱反應(yīng)；且在第9 滴之后反應(yīng)趨于穩(wěn)定，基本與滴定的背景結(jié)果值一致。

圖4 鎘離子和GMP 濃度比為20∶1 時(shí)的ITC 數(shù)據(jù)

從圖3 下半部分的模型擬合結(jié)果可知，N 值為0.998，說(shuō)明鎘離子與GMP 是接近并按照1∶1 的比例結(jié)合的。該比例下擬合得到的K 值為1.21E 4±2.26E 3，擬合誤差小，結(jié)果較為理想。

2.2 不同比例鎘離子和GMP 反應(yīng)的熱力學(xué)擬合結(jié)果分析

表1 的結(jié)果顯示了不同比例的鎘離子與GMP反應(yīng)的各個(gè)熱力學(xué)參數(shù)，通過(guò)比較四組數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)體系中鎘離子濃度較低、GMP 濃度較高時(shí)，反應(yīng)為放熱反應(yīng)。反應(yīng)化學(xué)計(jì)量比也在1 以下，說(shuō)明此時(shí)大分子GMP 與鎘應(yīng)該只有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與鎘離子結(jié)合會(huì)產(chǎn)生放熱反應(yīng)。但當(dāng)體系中鎘離子濃度升高且GMP 濃度降低到一定比例時(shí)，反應(yīng)就會(huì)變成吸熱反應(yīng)，同時(shí)N 值也會(huì)突然升高到1.89，此時(shí)鎘離子與GMP 的化學(xué)計(jì)量比將近2∶1，即一個(gè)GMP 結(jié)合兩個(gè)鎘離子，說(shuō)明此時(shí)GMP 與鎘離子可能存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在其他人研究中也出現(xiàn)了類(lèi)似的情況，周潔和王延華等[18]在用ITC 研究Zn 離子和血清蛋白的結(jié)合機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)濃度較低時(shí)，只發(fā)生放熱反應(yīng)，但當(dāng)濃度升高到一定比例時(shí)，會(huì)同時(shí)出現(xiàn)吸熱和放熱反應(yīng)。他們推斷血清蛋白和Zn 離子有吸熱和放熱兩種結(jié)合位點(diǎn)，在濃度較低時(shí)，只有放熱結(jié)合位點(diǎn)會(huì)發(fā)生反應(yīng)，而當(dāng)濃度升高到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤龝r(shí)，放熱反應(yīng)產(chǎn)生的熱會(huì)“激活”吸熱位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)生吸熱和放熱結(jié)合。

表1 不同比例鎘離子和GMP 反應(yīng)的熱力學(xué)擬合參數(shù)

從熱力學(xué)的角度進(jìn)行分析，在5∶1 和8∶1 時(shí)，ΔH＜0，ΔS＞0，根據(jù)吉布斯函數(shù)，該反應(yīng)在任何情況下都可以自發(fā)進(jìn)行，而到10∶1 和20∶1 時(shí)，ΔH＞0，ΔS＞0，該反應(yīng)只有溫度T 大于一定程度才會(huì)自發(fā)發(fā)生。而分析下圖的縱坐標(biāo)得知，起始熱量會(huì)隨濃度上升而越來(lái)越高，說(shuō)明初始溫度上升，會(huì)使吸熱結(jié)合位點(diǎn)自發(fā)發(fā)生反應(yīng)。

因此，我們推測(cè)在本實(shí)驗(yàn)中GMP 和鎘也可能同時(shí)含有吸熱和放熱兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但在濃度較低時(shí)，只有放熱結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，N 值小于1。但當(dāng)濃度到達(dá)一個(gè)適合的比例時(shí)，GMP 的另一個(gè)吸熱結(jié)合位點(diǎn)就會(huì)被激活，此時(shí)溶液會(huì)同時(shí)發(fā)生吸熱和放熱兩種結(jié)合，且由于吸熱位點(diǎn)的結(jié)合能力較放熱位點(diǎn)強(qiáng)很多（K 值較大），反應(yīng)以吸熱為主，這也可以解釋結(jié)合常數(shù)K 在反應(yīng)變?yōu)槲鼰岱磻?yīng)后突然上升的現(xiàn)象。而當(dāng)反應(yīng)體系中鎘離子的濃度進(jìn)一步升高時(shí)，鎘離子只與結(jié)合能力強(qiáng)的吸熱位點(diǎn)結(jié)合，N 值又回到了1 以下。當(dāng)然此結(jié)論都是基于GMP 有吸熱和發(fā)熱兩種結(jié)合位點(diǎn)的假設(shè)，具體結(jié)論還有待研究。

2.3 反滴法研究鎘離子與GMP 的結(jié)合機(jī)理

為了進(jìn)一步研究鎘離子與GMP 的結(jié)合機(jī)理，我們采用反滴法，以GMP 為滴定物，鎘離子為被滴物，選擇1∶10 的濃度比進(jìn)行試驗(yàn)。滴定和擬合結(jié)果如圖5 和表2 所示。

表2 正滴法和反滴法反應(yīng)的熱力學(xué)擬合參數(shù)對(duì)比

圖5 反滴法（GMP→Cd）濃度比為10∶1 時(shí)的ITC圖譜

不同于正滴法，再10∶1 的濃度下，二者的結(jié)合過(guò)程依然是放熱反應(yīng)，且反應(yīng)速度很快，8 滴之后反應(yīng)基本就結(jié)束了。其熱力學(xué)參數(shù)與正滴法中的放熱反應(yīng)相似，結(jié)合常數(shù)K 為6.05E 3±2.38E 3，介于正滴法的5∶2 和8∶1 之間。焓變?chǔ)＜0，熵變?chǔ)＞0，ΔG＜0，得知該過(guò)程也是一個(gè)以焓變力為主要驅(qū)動(dòng)力的自發(fā)反應(yīng)。因?yàn)槭欠吹畏ǎ藭r(shí)的化學(xué)計(jì)量數(shù)與正滴法互為倒數(shù)，換算成正滴法應(yīng)為2.3，說(shuō)明此時(shí)可能已經(jīng)出現(xiàn)兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，但吸熱結(jié)合位點(diǎn)的活度不夠，整體反應(yīng)還是以放熱為主。但反應(yīng)的焓變相較于前兩種濃度已經(jīng)降低了很多，且反應(yīng)的后半段已經(jīng)出現(xiàn)了吸熱小峰。該體系很可能正處于放熱反應(yīng)和吸熱反應(yīng)的交界點(diǎn)附近?？傮w而言，在同樣的濃度比下，反滴法的結(jié)果與正滴法存在很大的差距，說(shuō)明反應(yīng)樣品的加入順序?qū)φ麄€(gè)反應(yīng)有顯著影響。

3 結(jié)論

離子印跡技術(shù)作為一種特異性檢測(cè)和重金屬離子去除技術(shù)，目前所面臨的主要難點(diǎn)在于其對(duì)功能單體的選擇，常用的幾種分子印跡聚合物都無(wú)法很好地與重金屬離子的特異性結(jié)合，而國(guó)內(nèi)外關(guān)于相關(guān)功能單體的研究仍主要集中于單體性能，缺乏對(duì)結(jié)合機(jī)理的深入探究。本文通過(guò)研究鎘離子與GMP的結(jié)合機(jī)理，希望可以為之后功能單體的選擇研究提供一些幫助。

從研究中得出的主要結(jié)論如下：鎘離子和GMP的濃度比不同會(huì)對(duì)二者的結(jié)合過(guò)程產(chǎn)生顯著影響，在低濃度比下，反應(yīng)為焓驅(qū)動(dòng)的放熱反應(yīng)；在高濃度比下，反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。根據(jù)數(shù)據(jù)推測(cè)GMP 與鎘離子存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)為放熱結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)為吸熱結(jié)合位點(diǎn)，在低濃度比下，只有放熱結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，濃度比達(dá)到一定值時(shí)，才會(huì)激活吸熱結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)生吸熱和放熱結(jié)合。而且因?yàn)槲鼰峤Y(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合能力更強(qiáng)，反應(yīng)可能呈現(xiàn)為吸熱反應(yīng)。通過(guò)反滴法與正滴法的比較，發(fā)現(xiàn)在同一濃度下，不同的滴加方式和滴加順序也會(huì)對(duì)結(jié)合結(jié)果造成較大的影響。

ITC 法作為一種熱力學(xué)分析方法，可以從得到的熱力學(xué)參數(shù)來(lái)解釋物質(zhì)之間親合力的強(qiáng)弱，是研究物質(zhì)之間相互作用的黃金標(biāo)準(zhǔn)。本文的研究結(jié)果將為篩選可以與鎘離子結(jié)合的優(yōu)秀功能單體提供一定的理論數(shù)據(jù)支撐和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。