孫賽男

廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021

皮膚是人的身體器官中最大的器官，具有重要的屏障保護(hù)作用[1]。受到內(nèi)外源性等多重因素的影響，皮膚衰老不可避免，包括角質(zhì)層變薄、活性氧增高、細(xì)胞增殖和分化減少等。降低氧自由基產(chǎn)生、提高皮膚成纖維細(xì)胞的抗氧化能力成為延緩皮膚衰老的當(dāng)選之策。玫瑰在抗氧化方面的活性被多次報(bào)道。玫瑰精油作用諸多，包括抗菌作用[2-3]、抑制氧自由基活性、調(diào)控皮膚內(nèi)環(huán)境，常被應(yīng)用于化妝品、食品與醫(yī)藥等領(lǐng)域[4-5]。本文研究玫瑰精油對(duì)D-gal 誘導(dǎo)的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞衰老、增殖及遷移的影響，檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞衰老、增殖及遷移相關(guān)指標(biāo)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞來(lái)源：小鼠皮膚成纖維細(xì)胞取自5～7 d Balb/c 乳鼠背部皮膚，原代分離培養(yǎng)后獲得，Balb/c乳鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要工作液的制備

D-gal 溶液：配制20 g/L 升的D-gal 溶液。

玫瑰精油：用DMSO 將玫瑰精油稀釋成三個(gè)濃度。

玫瑰精油濃度①：10 μL 原濃度精油加90 μLDMSO 稀釋成精油濃度①。

玫瑰精油濃度②：10 μL 精油濃度①加90 μLDMSO 稀釋成濃度②。

玫瑰精油濃度③：10 μL 精油濃度②加90 μLDMSO 稀釋成濃度③。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代小鼠皮膚成纖維細(xì)胞分離及培養(yǎng)

滅菌眼科剪分離鼠背部皮膚，剪碎用I 型膠原酶消化，離心洗脫組織團(tuán)塊，細(xì)胞篩過(guò)濾，放置4 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞傳代

密度達(dá)80%，PBS 清洗，胰酶消化3 min，完全培停止消化，離心重懸后移入培養(yǎng)瓶孵箱中培養(yǎng)。

1.3.3 β-gal 苷酶染色

PBS 清洗加固定液。染色工作液：X-Gal50 微、染色液A 10 μL、B 10 μL、C 930 μL，膜封孔板防蒸發(fā)，37 ℃過(guò)夜。顯微鏡下記錄。

1.3.4 EdU-594 細(xì)胞增殖染色

加稀釋的2XEdU 染色工作液（20 uM）孵育2 h。EdU 染液標(biāo)記后加固定液，洗滌液清洗。通透15 min。洗滌液清洗。0.5 mLClick 工作液：430 μL Click Reaction Buffer、20 μLCuSO4、1 μLAzide 594、Click Additive Solution 50 μL 避光30 min，洗滌后加1 mL 1X Hoechst 33342 避光10 min。洗滌后，熒光顯微鏡下觀察記錄。

1.3.5 細(xì)胞劃痕

細(xì)胞達(dá)80%，用200 μL 槍頭垂直劃線(xiàn)。PBS 洗漂浮細(xì)胞后無(wú)血清培養(yǎng)。拍照記錄0 h、24 h 細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用GraphPad8.0 統(tǒng)計(jì)分析制圖。p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*代表p＜0.05，**代表p＜0.01），ns 表示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 玫瑰精油對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞衰老的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組（D-gal 組）比較，加入玫瑰精油的各組衰老染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（p＜0.001，如圖1 所示）。

圖1 （10×，**表示p＜0.001）

2.2 玫瑰精油對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入不同濃度的玫瑰精油各組增殖的細(xì)胞數(shù)顯著增多（p＜0.01，如圖2 所示）。

圖2 （10×，**表示p＜0.01）

2.3 玫瑰精油對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞遷移的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入不同濃度的玫瑰精油各組細(xì)胞遷移的面積顯著增多（p＜0.001，如圖3所示）。

圖3 （4×，**表示p＜0.001）

3 討論

人們?cè)谏钊胝J(rèn)識(shí)皮膚衰老后發(fā)現(xiàn)，皮膚可以保護(hù)機(jī)體內(nèi)組織和器官免受環(huán)境中物理、化學(xué)和生物因素的侵襲；能防止組織內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分、水分和電解質(zhì)等物質(zhì)的流失。受多重因素影響，皮膚衰老不可避免。減少自由基的產(chǎn)生、清除老化代謝產(chǎn)物和提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法。有很多研究證實(shí)玫瑰具有抗衰老和抗氧化能力。

有研究表明，自然衰老皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減少[6]。有研究證實(shí)，D-gal 致衰老與自然衰老的一致性較高，D-gal 衰老細(xì)胞模型被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)天然活性物質(zhì)的抗衰老作用。

在D-gal 衰老模型中加入不同濃度的玫瑰精油，D-gal+玫瑰精油組衰老染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，玫瑰精油增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，從而對(duì)細(xì)胞衰老有修復(fù)作用。EdU-594 細(xì)胞增殖染色實(shí)驗(yàn)中，D-gal+玫瑰精油組細(xì)胞增殖數(shù)明顯高于衰老模型組，說(shuō)明玫瑰精油可以增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。遷移實(shí)驗(yàn)中，D-gal+玫瑰精油組的細(xì)胞24 h 遷移率明顯高于衰老模型組，表明玫瑰精油可以增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，玫瑰精油具有延緩皮膚成纖維細(xì)胞衰老、促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用。玫瑰精油的其他功效還有待進(jìn)一步探究。