黃 瑩，孫 鑫，黃 晶，楊 曉，陳 曦

中國(guó)健康促進(jìn)基金會(huì)抗衰老營(yíng)養(yǎng)與健康研發(fā)中心，湖北 武漢 430100

腸道菌群是指寄居于消化道內(nèi)的各種微生物的總和，物種類(lèi)多達(dá)1 000 種[1-2]。腸道菌群不僅是我們身體中最重要的微生物群落，同時(shí)作為“第二基因組”的腸道菌群，對(duì)人體代謝、免疫應(yīng)答和基因表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用[3-6]。腸道菌群作為人體的天然屏障，在抑制有害菌生長(zhǎng)繁殖方面發(fā)揮著重要的作用[7]。據(jù)報(bào)道，患腸道疾病的人群數(shù)量與日俱增，工業(yè)化快發(fā)達(dá)的歐洲地區(qū)，目前將近0.2%的人口都患有腸道疾病[8]，近年來(lái)隨著經(jīng)濟(jì)全球化的快速發(fā)展，各個(gè)國(guó)家和地區(qū)患腸道疾病的人數(shù)都在增加，呈現(xiàn)全球性上升趨勢(shì)[9-10]。臨床研究表明，腸道菌群失調(diào)是腸道疾病重要的激發(fā)因素之一，主要表現(xiàn)為有益菌群數(shù)量減少和有害菌群數(shù)量增多[11]。

益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主（動(dòng)物和人）有益的細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)[12]。2019 年3 月國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的《益生菌類(lèi)保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定（征求意見(jiàn)稿）》明確表明，攝取數(shù)量足夠的益生菌對(duì)宿主健康有益。消費(fèi)者健康意識(shí)的提高促進(jìn)了益生菌消費(fèi)市場(chǎng)的大幅度擴(kuò)大，我國(guó)益生菌市場(chǎng)每年都在以15%的年復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，預(yù)計(jì)今年將達(dá)到1 420 億元[13]。益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群[14]、提高免疫力[15]、潤(rùn)腸通便[16]、維持腸道內(nèi)環(huán)境均衡[17]等方面發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)其在抗氧化[18]、改善血脂異常[19]、緩解骨質(zhì)疏松[20]、護(hù)肝[21]方面的功能也有相關(guān)的研究報(bào)道。常見(jiàn)的益生菌種類(lèi)有雙歧桿菌和乳桿菌。本實(shí)驗(yàn)主要采用七種乳桿菌，即植物乳桿菌550、植物乳桿菌360、鼠李糖乳桿菌S24、植物乳桿菌543、副干酪乳桿菌S6、嗜酸乳桿菌11073、干酪乳桿菌10640，輔以益生元，組成復(fù)合益生菌粉，研究其對(duì)小鼠腸道菌群的改善作用，為研究益生菌在改善腸道菌群方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

復(fù)合益生菌粉原料：混合益生菌粉；輔料：魚(yú)膠原蛋白肽粉、維生素C、赤蘚糖醇、麥芽糊精、抗性糊精、巖藻多糖。復(fù)合益生菌粉由16.5%的原料和83.5%的輔料混合而成。復(fù)合益生菌粉的人體推薦量為2 g/d，按成人60 kg·bw 計(jì)為0.033 g/kg·bw。

混合益生菌粉由四川高福記生物科技有限公司提供。主要組成為：植物乳桿菌550、植物乳桿菌360、鼠李糖乳桿菌S24、植物乳桿菌543、副干酪乳桿菌S6、嗜酸乳桿菌11073、干酪乳桿菌10640。其他組成成分均為市售。

伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、BBL 瓊脂培養(yǎng)基、TSC 瓊脂培養(yǎng)基、TSC 瓊脂配套試劑（SR0290）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨、Lbs 瓊脂（北京路橋生物技術(shù)有限公司），氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BPC-250F 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、90 mm×15 mm 一次性培養(yǎng)皿（比克曼生物科技有限公司）、厭氧盒、厭氧袋和厭氧指示劑（日本三菱化學(xué)公司）、1 mL 移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)eppendorf 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)Babl/c 小鼠，7 周齡（19～21 g），北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司湖北分公司提供（許可證號(hào)：SCXK(鄂）2022-0030）。環(huán)境溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。維持飼料購(gòu)自武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司。

1.4 劑量選擇與受試樣品給予方式

復(fù)合益生菌粉低、中、高劑量組分別按人體推薦量的10 倍（0.333 g/kg·bw）、20 倍（0.667 g/kg·bw）、30 倍（1.000 g/kg·bw）給予，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組（給予同體積的純水）、原料組（0.165 g/kg·bw）和輔料組（0.835 g/kg·bw）。各劑量受試樣品的給予方式為經(jīng)口灌胃，灌胃量為0.1 mL/10 g·bw。

1.5 試驗(yàn)方法

方法來(lái)源：《允許保健食品聲稱(chēng)的保健功能目錄非營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑（2020 年版）（征求意見(jiàn)稿）》的第十五條，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群功能的檢驗(yàn)方法。

1.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟

在給予受試樣品之前，無(wú)菌采取小鼠肛門(mén)內(nèi)糞便0.1 g，采用0.85%的氯化鈉溶液10 倍系列稀釋?zhuān)x擇合適的稀釋度分別接種在各培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，從菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應(yīng)等方面入手，鑒定計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算出每克濕便中的菌數(shù)，取對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

受試樣品給予時(shí)間14 d 后的24 h 內(nèi)和給予時(shí)間30 d 后的24 h 內(nèi)，用與實(shí)驗(yàn)前相同的方式取直腸糞便，檢測(cè)腸道菌群，方法同上。

1.5.2 觀察指標(biāo)

體重、雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。各腸道菌群的培養(yǎng)條件如表1 所示。

表1 各個(gè)腸道菌群的培養(yǎng)條件

1.6 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定

可以對(duì)資料進(jìn)行方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F 值，F(xiàn) 值＜0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間無(wú)顯著性差異；F 值≥0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)兩兩相比的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，對(duì)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試樣品對(duì)小鼠體重的影響

試驗(yàn)期間每周稱(chēng)1 次體重，各期體重及體重增長(zhǎng)情況如表2 所示。實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、攝食、排泌等均未見(jiàn)明顯的異常狀況，且體重在持續(xù)增長(zhǎng)。與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重均未見(jiàn)異常。結(jié)果表明復(fù)合益生菌粉、原料及輔料對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無(wú)不良影響。

表2 受試樣品對(duì)小鼠體重的影響表（，n=10）

表2 受試樣品對(duì)小鼠體重的影響表（，n=10）

組別干預(yù)期體重/g 0 d7 d14 d21 d30 d陰性對(duì)照組20.99±0.76 22.77±0.88 23.29±0.96 23.93±1.06 24.77±1.21復(fù)合益生菌粉低劑量組21.05±0.79 22.84±0.57 23.30±0.61 24.21±0.75 24.82±0.62復(fù)合益生菌粉中劑量組21.20±0.80 22.70±0.83 23.16±0.87 23.87±0.73 24.87±0.73復(fù)合益生菌粉高劑量組24.78±1.06原料組21.16±0.65 21.19±0.75 23.10±0.75 23.50±0.83 24.22±0.97 24.66±0.94輔料組21.02±0.68 23.00±0.85 23.65±0.92 23.90±1.00 22.77±0.59 23.46±0.79 24.21±0.99 25.13±1.22

2.2 受試樣品對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 受試樣品對(duì)小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響

由圖1 可知，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，腸桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后復(fù)合益生菌粉各劑量組腸桿菌的數(shù)量與陰性對(duì)照組相比存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 前后腸桿菌的數(shù)量存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉高劑量組對(duì)腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用最大，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達(dá)到了73.00%，且復(fù)合益生菌粉高劑量組對(duì)腸桿菌生長(zhǎng)的抑制效果大于原料組和輔料組。

圖1 受試樣品對(duì)小鼠糞便腸桿菌菌落數(shù)的影響

2.2.2 受試樣品對(duì)小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響

由圖2 可知，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，腸球菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后各劑量組腸球菌的數(shù)量與陰性對(duì)照組相比存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 后腸球菌的數(shù)量與干預(yù)前存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉高劑量組對(duì)腸球菌的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達(dá)到了31.24%，且對(duì)腸球菌的抑制效果大于單獨(dú)的原料組和輔料組。

圖2 受試樣品對(duì)小鼠糞便腸球菌菌落數(shù)的影響

2.2.3 受試樣品對(duì)小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響

由圖3 可知，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后，產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的下降，且干預(yù)30 d 后各劑量組產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與陰性對(duì)照組相比，均存在顯著性差異（P＜0.05）；各劑量干預(yù)30 d 后產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)抑制作用最大，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干預(yù)30 d 后腸桿菌數(shù)量的下降率達(dá)到了84.17%，且對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大于單獨(dú)的原料組和輔料組。

圖3 受試樣品對(duì)小鼠糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)的影響

2.2.4 受試樣品對(duì)小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響

由圖4 可知，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組干預(yù)14 d 和30 d 后乳桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的增長(zhǎng)，但只有復(fù)合益生菌粉中劑量、高劑量組和原料組在干預(yù)30 d 后乳桿菌的增長(zhǎng)量與陰性對(duì)照組存在顯著性差異（P＜0.05），低劑量組和輔料組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與干預(yù)前相比，復(fù)合益生菌粉中、高劑量組以及原料組在干預(yù)30 d 后，乳桿菌的增長(zhǎng)量與干預(yù)前相比都存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對(duì)乳桿菌增長(zhǎng)的促進(jìn)作用最大，增長(zhǎng)率達(dá)63.77%，且對(duì)乳桿菌增長(zhǎng)的促進(jìn)效果大于單獨(dú)的原料組和輔料組。

圖4 受試樣品對(duì)小鼠糞便乳桿菌菌落數(shù)的影響

2.2.5 受試樣品對(duì)小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

由圖5 可知，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組在干預(yù)14 d 和30 d 后雙歧桿菌的數(shù)量均出現(xiàn)了不同程度的增長(zhǎng)，但是只有復(fù)合益生菌粉的中劑量和高劑量組在干預(yù)30 d 后乳桿菌的增長(zhǎng)數(shù)量與陰性對(duì)照組存在顯著差異（P＜0.05）；與干預(yù)前相比，在復(fù)合益生菌粉中、高劑量組干預(yù)30 d 后，雙歧桿菌的增長(zhǎng)數(shù)量與干預(yù)前相比存在顯著性差異（P＜0.05）。復(fù)合益生菌粉中劑量組對(duì)雙歧桿菌增長(zhǎng)的促進(jìn)作用最大，增長(zhǎng)率達(dá)47.74%，且對(duì)雙歧桿菌的促增長(zhǎng)效果大于單獨(dú)的原料組和輔料組。

圖5 受試樣品對(duì)小鼠糞便雙歧桿菌菌落數(shù)的影響

3 討論

比較實(shí)驗(yàn)前后各菌種自身及組間雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的變化情況發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌粉在干預(yù)前后自身也發(fā)生了顯著性變化，且干預(yù)后與陰性對(duì)照組比較也存在顯著性差異，主要表現(xiàn)為小鼠糞便中雙歧桿菌和乳桿菌明顯增加，對(duì)乳桿菌的增殖作用更強(qiáng)了，腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌明顯減少，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉對(duì)腸道菌群的改善效果優(yōu)于單獨(dú)的原料組和輔料組。

本研究采用含多種乳桿菌的原料與輔料組成復(fù)合益生菌粉，大量研究證明乳桿菌在改善腸道菌群方面成效顯著，例如Lahtinen 等[22]研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌對(duì)老年人糞便中乳桿菌和艱難梭菌的數(shù)量有明顯的改善作用。張澤鵬等[23]研究植物乳桿菌對(duì)小鼠血脂及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)干預(yù)42 d 后，干預(yù)組小鼠糞便中大腸桿菌的數(shù)量均低于模型組（P＜0.05）；糞便雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量均高于模型組（P＜0.05）。劉偉賢等[24]給予小鼠灌胃副干酪乳桿菌K56 菌株，比較干預(yù)14 d 前后的菌株數(shù)量，發(fā)現(xiàn)各組小鼠糞便中的雙歧桿菌、乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯著增加（P＜0.05），而腸桿菌和腸球菌則無(wú)顯著變化（P＞0.05）。陳雪等[25]研究植物乳桿菌對(duì)雄性小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)功能，研究結(jié)果表明，植物乳桿菌HCS03-001 的中、高劑量組可顯著提高小鼠小腸墨汁推進(jìn)率（P＜0.05）；植物乳桿菌HCS03-001 高劑量可降低產(chǎn)氣莢膜梭菌（P＜0.05）、腸球菌（P＜0.05）、腸桿菌（P＞0.05）的活菌數(shù)，同時(shí)促進(jìn)乳桿菌增殖（P＜0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌粉對(duì)腸道菌群的改善效果優(yōu)于單獨(dú)的原料組和輔料組，因?yàn)檩o料組中的一些益生元成分作為一種不被人體消化的食物成分，通過(guò)選擇性地刺激腸道內(nèi)的益生菌生長(zhǎng)來(lái)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益影響，改善機(jī)體的健康狀況[26]。

研究發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)腸道有害菌的抑制作用和對(duì)有益菌增長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)為：（1）益生菌可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)大分子物質(zhì)、影響DNA 或RNA的活性、競(jìng)爭(zhēng)病原菌中生長(zhǎng)相關(guān)物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，阻止細(xì)胞生長(zhǎng)分裂[27]、益生菌黏蛋白的黏附作用和定植以及一定濃度的毒素能夠在一定程度上對(duì)致病菌產(chǎn)生拮抗作用[28]；（2）益生菌可提高小鼠空腸絨隱比，改善其腸道吸收功能；可升高盲腸內(nèi)容物的總SCFAs 含量，增強(qiáng)腸道的屏障功能，使腸道菌群中的乳桿菌屬等有益菌相對(duì)增加，對(duì)有害菌產(chǎn)生一定的抑制作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的分布生長(zhǎng)情況，改善腸道內(nèi)環(huán)境[29]。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明益生菌具有改善小鼠腸道菌群的作用，但是涉及益生菌對(duì)人體腸道菌群改善作用機(jī)理的研究仍需要使用更復(fù)雜的模型去預(yù)測(cè)作用機(jī)制并開(kāi)展更嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)去證實(shí)，本研究為后續(xù)益生菌制劑調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的探索提供了理論支持。