李金鴿，胡丞丞，付培蕾，馮 爽，李 珂，2，李文淵，2*

1.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院河南省水環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000

細(xì)菌感染一直是威脅人類生命健康的潛在危險(xiǎn)因素，每年都會(huì)造成千百萬(wàn)人感染疾病甚至死亡[1-2]。自1928 年青霉素被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染治療以來(lái)，人類細(xì)菌感染性疾病的發(fā)病率和死亡率便大大降低了[3-4]。由于人們對(duì)抗生素認(rèn)知不足和濫用，導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，致使抗生素的治療功效急劇下降，甚至引發(fā)了一系列不良反應(yīng)。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將細(xì)菌耐藥性列為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3-5]。因此，尋找安全有效、不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)少的抗菌藥物是當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

中藥常常被用于疾病的控制和預(yù)防，具有來(lái)源廣、毒副作用少等特點(diǎn)。中藥抗菌是“后抗生時(shí)代”對(duì)抗細(xì)菌耐藥現(xiàn)象的有效措施。近年來(lái)，人們對(duì)中藥抗菌的研究日漸增多，魏要武等[6]通過(guò)對(duì)25 種中藥進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)丁香、石榴皮、綠茶三種中藥提取物的抗痤瘡功效最明顯。柳香香等[7]研究發(fā)現(xiàn)甘草中的甘草甜素對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，抗菌效果較好。江麗等[8]從金銀花和甘草等20 種中草藥中篩選出了抗菌活性顯著的五味中藥，分別是大黃、黃芩、甘草、牡丹皮和金銀花。進(jìn)一步的研究表明，中藥主要是通過(guò)影響其細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)及核酸等組分的穩(wěn)定性，來(lái)改變其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到抑菌效果的。因此，篩選具有抗菌活性的中藥可以為研發(fā)新的抗菌藥物提供理論依據(jù)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)選取了21 種中藥提取物分別研究了金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌等的抑菌效果，為開(kāi)發(fā)治療細(xì)菌感染性疾病的“中藥抗生素”提供了參考。

1 材料

1.1 材料

金銀花、苦地丁、紅景天、大黃、黃連、黃芩、黃柏、厚樸、決明子、麻黃、丁香、廣藿香、女貞子、綿馬貫眾、板藍(lán)根、甘草、大青葉、魚(yú)腥草、連翹、桔梗、秦皮，共計(jì)21 種，均來(lái)自安徽亳州，藥材由鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院李珂副教授鑒定。

1.2 菌種

金黃色葡萄球菌BNCC186335、枯草芽孢桿菌FSCC115037、銅綠假單胞菌GDMCCI443、大腸桿菌ATCC25922 由河南省水環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要儀器

LDZF-75KB-II 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、LHS-CL 恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ 型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）、ReadMax1900Plus 光吸收酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）等。

1.4 主要試劑

乙醇、二甲亞砜（DMSO）分別購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司、天津市富宇精細(xì)化工有限公司，本實(shí)驗(yàn)所用到的化學(xué)試劑均為分析純。LB 培養(yǎng)基的成分胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物購(gòu)于北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司，瓊脂粉購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 方法

2.1 中藥提取物的制備

稱取10 g 中藥材粗粉于100 mL 80%乙醇中浸泡30 min，回流提取兩次，時(shí)間為70 min，合并濾液。將濾液濃縮至5 mL，放入烘箱中烘干為浸膏。將干燥后的中藥浸膏溶于1 mLDMSO，配制成質(zhì)量濃度為10.24 mg/mL 藥品供試液。

2.2 菌液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌分別接種于LB 固體培養(yǎng)基上，置于37 °C 的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度設(shè)置為28 °C），刮下菌苔，接入10 mL液體培養(yǎng)基，放入搖床培養(yǎng)（150 r/min）。24 h 后，取1 mL 用LB 液體培養(yǎng)基稀釋10 000 倍備用。

2.3 藥材活性的篩選

取無(wú)菌96 孔板平底微量培養(yǎng)板，每孔加入10 μL 藥液、90 μL LB 培養(yǎng)基和100 μL 稀釋后的菌液，每相鄰3 孔為1 組平行對(duì)照，設(shè)置空白對(duì)照組（純菌液），放入35.5 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，用光吸收酶標(biāo)儀測(cè)量其625 nm 下的吸光度（OD）值，初步記錄初始濃度下提取物的抗菌活性。

2.4 二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）

取無(wú)菌96 孔平底微量培養(yǎng)板，在A 行每孔中加入10 μL 中藥提取物母液和190 μLLB 液體培養(yǎng)基，充分混勻。B 至F 行每孔加入100 μLLB 液體培養(yǎng)基，吸取100 μLA 行孔內(nèi)培養(yǎng)液至對(duì)應(yīng)的B 行孔，充分混勻；再吸取100 μLB 行孔內(nèi)培養(yǎng)液至對(duì)應(yīng)的C 行孔，充分混勻，依次操作，直至F 行。最后各孔均加入100 μL 稀釋后的菌液，混勻。陽(yáng)性對(duì)照組為含1%相應(yīng)抗生素的菌懸液，空白對(duì)照組為200 μLLB 液體培養(yǎng)基。將96 孔培養(yǎng)板置于35 °C 恒濕恒溫箱中培養(yǎng)24 h 觀察結(jié)果，用光吸收長(zhǎng)酶標(biāo)儀（625 nm）測(cè)定吸光度，計(jì)算其MIC 值。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 21 種中藥乙醇粗提物體外抗菌活性測(cè)定結(jié)果

通過(guò)設(shè)置陰性對(duì)照與空白對(duì)照，分別測(cè)試21 種中藥乙醇提取物（初始質(zhì)量濃度10.24 mg/mL 對(duì)不同菌種的抑菌活性），結(jié)果如表1 所示。

表1 21 種中藥提取物對(duì)不同菌種的抗菌活性測(cè)定

3.2 MIC 測(cè)定結(jié)果

根據(jù)抗菌活性測(cè)定結(jié)果，篩選出具有抗菌活性的中藥提取物，用二倍稀釋法測(cè)定其MIC，其結(jié)果見(jiàn)表2-5。金銀花、紅景天、大黃、黃連、黃柏、厚樸、麻黃、丁香、廣藿香、女貞子、綿馬貫眾、板藍(lán)根、甘草的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用，其MIC 值分別為0.84 mg/mL、5.16 mg/mL、2.91 mg/mL、7.01 mg/mL、5.86 mg/mL、1.13 mg/mL、11.42 mg/mL、14.92 mg/mL、12.82 mg/mL、12.97 mg/mL、11.21 mg/mL、4.27 mg/mL、3.62 mg/mL。其他8 種中藥的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)明顯抑制活性。金銀花、黃柏、厚樸、板藍(lán)根、甘草、大青葉、桔梗、秦皮對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC 值分別為11.32 mg/mL、6.51 mg/mL、10.18 mg/mL、11.32 mg/mL、13.01 mg/mL、17.96 mg/mL、6.92 mg/mL、4.27 mg/mL；其他13種中藥的乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌無(wú)明顯抑制抗菌活性。桔梗、秦皮對(duì)銅綠假單胞菌的MIC 值均大于20 mg/mL，表明這兩種中藥乙醇提取物對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌活性較弱，但其他19 種中藥乙醇提取物均無(wú)抗菌活性。金銀花、桔梗對(duì)大腸桿菌的MIC值分別為8.80 mg/mL、18.69 mg/mL，表明金銀花乙醇提取物對(duì)大腸桿菌的抗菌活性比桔梗乙醇提取物好，而其它19 種中藥乙醇提取物均沒(méi)有抗菌活性。

表2 13 種中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值測(cè)定

表3 8 種中藥提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC 值測(cè)定

表4 2 種中藥提取物對(duì)銅綠假單胞菌的MIC 值測(cè)定

表5 2 種中藥提取物對(duì)大腸桿菌的MIC 值測(cè)定

4 討論

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)一些中藥及其活性成分提取物對(duì)細(xì)菌及病原微生物具有較強(qiáng)的抑制作用。中藥化學(xué)成分復(fù)雜且抑菌機(jī)理多樣化，如中藥可以影響微生物細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)及核酸等組分的穩(wěn)定性，取得抑菌效果。我們應(yīng)發(fā)揮中醫(yī)藥理論的優(yōu)勢(shì)特色，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究中藥的化學(xué)成分及其理化性質(zhì)，闡明中藥的抗菌機(jī)制，為耐藥菌藥物的研發(fā)和創(chuàng)制提供思路。

本實(shí)驗(yàn)選取的21 種中草藥乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌分別表現(xiàn)出了不同程度的抗菌效果。從實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，金銀花、板藍(lán)根、甘草、桔梗的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用均很強(qiáng)；紅景天、大黃、黃柏、厚樸的乙醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌也有明顯的抑制作用，秦皮乙醇提取物對(duì)枯草芽孢桿菌也有一定的抑制作用。桔梗、秦皮的乙醇提取物對(duì)銅綠假單胞菌有抑制作用，金銀花、桔梗乙醇提取物對(duì)大腸桿菌也有抑制作用。

研究結(jié)果表明，金銀花對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有抑菌效果，金銀花乙醇提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的MIC 比對(duì)革蘭氏陰性菌的MIC 強(qiáng)10 倍左右，提示其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的作用機(jī)制可能不同。該研究為進(jìn)一步探究金銀花乙醇提取物的抑菌成分及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。