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北京中飛華正檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，北京 101300

我國游泳場所衛(wèi)生場所明文規(guī)定，游泳池中尿素含量不得超過2.5 mg/L。目前測定游泳池水中尿素的方法主要有鄰苯二醛法、苯酚-次氯酸鹽光度法、OPA 法、urase-berthlot 法、二乙酰一肟法等。二乙酰肟安替比林法是國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但在實際應(yīng)用中存在諸多問題，如曲線線性濃度范圍小，曲線不易做成；加熱時間過長；在沸騰情況下，比色管帽極易噴濺，易損失液體；顯色時間過長且顯色后要立即測定。綜合上述問題，用氨基硫脲代替二乙酰一肟法測定尿素，從擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、最佳吸收波長、溫度的條件、加熱時間等方面篩選最佳測定條件，并確定方法檢出限、準(zhǔn)確度和精密度，從而建立一種方便、實用的測定方法。本文基于國家標(biāo)準(zhǔn)方法，建立二乙酰一肟-氨基硫脲測定游泳池中尿素的方法，從波長的選擇、酸度的條件、試劑的加入量、溫度的條件、加熱時間來尋求最佳條件。

1 實驗部分

1.1 實驗的儀器和試劑

1.1.1 實驗儀器

實驗中所用的儀器見表1。

表1 實驗儀器

表2 實驗試劑

1.1.2 實驗試劑

1.2 實驗原理

1.2.1 二乙酰一肟-氨基硫脲測定尿素的實驗原理

二乙酰一肟法測定尿素的主要反應(yīng)原理是血清中尿素在氨基硫脲存在下與二乙酰一肟在遇熱強酸溶液中生成紅色復(fù)合物，該復(fù)合物與尿素含量成正比。在最大吸收波長下符合朗伯-比爾定律，即溶液吸光分子在最大吸收波長的吸光度A 與該吸光分子的濃度C 的關(guān)系[1]。

1.2.2 二乙酰一肟-氨基硫脲測定尿素的實驗方法

在室溫下，在25.0 ml 比色管中加入10.0 ml 樣品，同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取比色管，向其中加入尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液：0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、5.00 mL、7.00 mL。于上述各管中加入二乙酰一肟-氨基硫脲溶液2.00 mL，磷-硫混酸溶液5.00 mL，并用超純水稀釋至25 mL，混勻。將上述各管放在水浴鍋沸水浴中加熱20 min，取出并在流動的自來水中冷卻大約2 min。立即以超純水為對照，在480 nm 處，用1 cm 比色皿比色，以濃度對應(yīng)吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以水樣的吸光度從曲線查出尿素質(zhì)量。

1.2.3 準(zhǔn)確度的測定方法

取相同的兩個實際樣品，其中一個裝的是尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，兩個實際樣品按照相同的實驗步驟同時測量[2]。加入標(biāo)準(zhǔn)品后的結(jié)果減去加入標(biāo)準(zhǔn)品前的結(jié)果，減去值與加入標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確值之差的比值即為樣品的標(biāo)準(zhǔn)回收率。

1.2.4 精密度的測定方法

取3 個（低、中、高）不同濃度的自制實際樣品，每個濃度平行測定6 次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示精密度。

1.2.5 檢出限

取空白樣品測定空白值，平行測定11 次，用質(zhì)量或濃度單位計算檢出限[3]。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 二乙酰一肟-氨基硫脲測定尿素的實驗條件

2.1.1 最大吸收波長的選擇

當(dāng)尿素的質(zhì)量濃度為5.00 mg/L 時，在可見分光光度計440～520 nm 波長之間，二乙酰一肟-氨基硫脲測定尿素吸收曲線波長440～500 nm 之間，最大吸收峰在480 nm 處，因此選擇480 nm 為最大吸收波長。

2.1.2 二乙酰一肟-氨基硫脲濃度對測定結(jié)果的影響

分別對2.00 mg/L 尿素溶液和5.00 mg/L 尿素溶液取不同用量，分別為0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL、4.00 mL、4 mL。在最大波長480 nm 處測定吸光度。當(dāng)二乙酰一肟-氨基硫脲的用量到2.00 ml 時吸光度最大，說明反應(yīng)程度完全。繼續(xù)增加二乙酰-氨基硫脲的用量，吸光度沒有什么變化，表示顯色穩(wěn)定。高低濃度的尿素溶液反應(yīng)結(jié)果一致。所以二乙酰一肟最大加入量選擇2.00 mL 最為合適。

2.1.3 酸度對測定結(jié)果的影響

當(dāng)確定二乙酰一肟-氨基硫脲的用量為2.00 mL 時，混酸溶液的加入量為2.00 mL、3.00 mL、5.00 mL、7.00 mL、9.00 mL、10.00 mL。在最大吸收波長480 nm 處測定吸光度，當(dāng)尿素質(zhì)量濃度為20 μg/20 mL、混酸溶液的加入量為5.00 mL 時，吸光度變化不大，所以選擇混酸溶液為5.00 mL。

2.1.4 顯色時間對測定結(jié)果的影響

當(dāng)二乙酰一肟-氨基硫脲的加入量為2.00 mL、混酸溶液為5.00 mL 時，顯色時間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。在最大吸收波長480 nm 處測定吸光度，可以看出，顯色反應(yīng)從加熱10 min 開始上升，每隔10 min 測定一次吸光度。加熱至20 min 后，再接著加熱，吸光度無明顯變化，表明加熱20 min 時顯色完全。繼續(xù)加熱后，雖然吸光度有所下降，但在40 min 內(nèi)吸光度相對穩(wěn)定，所以選擇20 min 為顯色時間。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列

在室溫下，按照二乙酰一肟-氨基硫脲測定尿素的實驗方法，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以水樣的吸光度從曲線查出尿素質(zhì)量。具體情況見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列

2.1.6 結(jié)果計算

水樣中尿素的濃度[4]：

2.1.7 精密度的測定

自制質(zhì)量濃度為1.00 mg/L、5.00 mg/L、7.00 mg/L 的樣品，各平行測定6 次。按照實驗方法，計算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用公式：

可以得知，對已知質(zhì)量濃度1.00 mg/L 的樣品進(jìn)行平行測定6 次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%，小于5%，表明精密度好；對已知質(zhì)量濃度5.00 mg/L 的樣品進(jìn)行平行測定6 次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.57%，小于5%，表明精密度好；對已知質(zhì)量濃度7.00 mg/L 的樣品進(jìn)行平行測定6 次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.43%，小于5%，表明精密度好。

2.1.8 準(zhǔn)確度的測定

自制質(zhì)量濃度為1.00 mg/L、3.00 mg/L、5.00 mg/L 的尿素樣品，按照實驗方法，以質(zhì)量對應(yīng)吸光度，計算加標(biāo)回收率，使用公式：

取0.5 mL 100 mg/L 的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入自制樣品1、2、3 中，定容至25.0 mL，此時加標(biāo)量為2 mg/L。分別對高、中、低三個濃度的水樣計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率在95.0%～104.2%之間，準(zhǔn)確度良好。

2.1.9 方法檢出限

按照樣品分析的全部步驟，重復(fù)n 次空白實驗，將各測定結(jié)果換算為樣品中的濃度或含量，計算n次平行測定結(jié)果對的標(biāo)準(zhǔn)偏差[5]。按公式5 計算方法檢出限。

方法檢出限測定結(jié)果得知標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.080 2，t（n-1，0.99）為2.764，取樣體積為10.0 mL，尿素檢出限為0.02 mg/L。

3 結(jié)論

室溫條件下，加入10.0 mL 水樣于上述25 mL比色管中，再依次加入二乙酰一肟-氨基硫脲溶液2.00 mL、混酸溶液5.00 mL，然后用純水分別稀釋至25.00 mL，混勻靜置。將上述各管放在沸水浴中加熱20 min，取出并在流動的水中冷卻2 min。立即以純水為對照，在480 nm 處用1 cm 比色皿比色。用二乙酰一肟-氨基硫脲測定游泳池水中的尿素。本實驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值均小于5 %，檢出限為0.02 mg/L，加標(biāo)回收率范圍在95.0%～104.2%之間，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

在最大吸收波長480 nm 處測定吸光度，二乙酰一肟-氨基硫脲溶液2.00 mL，混酸溶液5.00 mL，加熱20 min 為實驗條件，擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可以使測定效果具有加熱時間短、減少溶液消耗、顯色度好、不易褪色、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點。