林婷婷，陳超星，鮑娜娜，施克儉，董嬌嬌，劉樂(lè)

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015

布比卡因是臨床上常見(jiàn)的酰胺類局部麻醉藥，廣泛用于局部浸潤(rùn)麻醉、硬膜外麻醉、神經(jīng)阻滯等麻醉方法中[1]。但臨床上操作不當(dāng)致使布比卡因不慎入血或用量過(guò)大或機(jī)體高敏時(shí)，可能會(huì)引起嚴(yán)重的心臟毒性，造成循環(huán)衰竭甚至心臟停搏[2]。APJ受體是細(xì)胞膜上存在的一種七次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體，廣泛分布于全身多個(gè)重要臟器，隨后在1998年發(fā)現(xiàn)其特異性配體Apelin[3]。多年研究表明， Apelin/APJ系統(tǒng)有助于改善心力衰竭[4-5]、動(dòng)脈粥樣硬化[6]、心肌缺血再灌注損傷[7]、心律失常[8-9]、高血壓[10]、心肌肥厚[11-12]等多種心血管系統(tǒng)疾病。前期本團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)布比卡因誘導(dǎo)的在體大鼠心臟停搏模型中，Apelin-13 可明顯提高大鼠復(fù)蘇率及加快血流動(dòng)力學(xué)恢復(fù)[13]。但截至目前，Apelin逆轉(zhuǎn)布比卡因心肌毒性的具體機(jī)制尚未完全明確。本研究制備體外布比卡因誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞停搏模型，給予外源性（Pyr1）Apelin-13處理，觀察其細(xì)胞搏動(dòng)和線粒體改變情況，并探討Apelin/APJ系統(tǒng)在布比卡因心肌毒性中的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠新生1～3 d的乳鼠，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2020-0001。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 布比卡因（美國(guó)Sigma公司，B5274-5G）， （Pyr1）Apelin-13（美國(guó)Tocris公司，217082-60-5），大鼠Apelin-13酶聯(lián)免疫試劑盒（上海Boyun Biotech公司，BP-E20321），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A020-2），兔抗GAPDH抗體（美國(guó)CST公司，#5174），兔抗APJ受體（美國(guó)Abcam公司，ab214369），兔抗PI3K抗體（美國(guó)CST公司，#4292），兔抗p-PI3K抗體（美國(guó)Affinity公司，#AF3241），兔抗Akt抗體（美國(guó)CST公司，#9272），兔抗p-Akt抗體（美國(guó)CST公司，#4060）

1.1.3 心肌細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取SD大鼠乳鼠，用75%乙醇消毒后，剪開(kāi)胸骨，迅速取出心臟置于預(yù)冷PBS中清洗。剪碎心室組織，加入心肌細(xì)胞消化液移至37 ℃水浴機(jī)械攪拌8 min，收集組織上方消化液至含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液的離心管中終止消化，剩下組織再次加入消化液重復(fù)8次。收集的心肌細(xì)胞懸液進(jìn)行差速貼壁1 h，去除非心肌細(xì)胞。用含0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2× 106/mL接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）過(guò)夜培養(yǎng)，第2天更換新的培養(yǎng)液。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 提取心肌細(xì)胞后培養(yǎng)48 h觀察到心肌細(xì)胞互相融合，單層貼壁，細(xì)胞發(fā)生同步搏動(dòng)且搏動(dòng)率達(dá)80%～85%。記錄各組細(xì)胞10 s基礎(chǔ)自主搏動(dòng)次數(shù)后，隨機(jī)分成4組，按照以下藥物處理 6 h：空白培養(yǎng)基組（DMSO組）、布比卡因1 mmol/L組（Bup組）、 （Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L組（Apl組）和布比卡因1 mmol/L+（Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L組（BAp組）。藥物劑量及處理時(shí)間參考本團(tuán)隊(duì)先前研究[14]。

1.2.2 乳鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù) 通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)視野下10 s心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)次數(shù)。藥物處理完畢后時(shí)間記為T(mén)0，更換全新普通培養(yǎng)液，去除藥物后 1、2、4、8、12 h分別記為T(mén)1、T2、T4、T8、T12，記錄以上各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)，計(jì)算細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)搏動(dòng)次數(shù)與基礎(chǔ)搏動(dòng)次數(shù)的比值。

1.2.3 電鏡下觀察乳鼠心肌細(xì)胞線粒體形態(tài) T12時(shí)棄去培養(yǎng)液，胰酶消化收集細(xì)胞，低速離心細(xì)胞成團(tuán)，加入2.5%戊二醛固定細(xì)胞團(tuán)，4 ℃過(guò)夜。第2天細(xì)胞團(tuán)再用1%鋨酸固定1 h，1%醋酸鈾塊染2 h。通過(guò)乙醇梯度脫水10 min，純丙酮深度脫水10 min， 包埋液與丙酮1:1混合37 ℃烘箱2 h，包埋液與丙酮4:1 混合37 ℃烘箱過(guò)夜。加入純包埋液，45 ℃烘箱3 h，65 ℃烘箱48 h。干燥后制成半薄切片和超薄切片，經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛復(fù)染后在透射電鏡（日本HITACHI公司）下觀察其線粒體形態(tài)。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量 T12時(shí)收集各組培養(yǎng)液，低速低溫離心，留取上清液待測(cè)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)采用比色法檢測(cè)上清液中LDH含量。最后組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以DMSO組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與DMSO組的相對(duì)值。

1.2.5 心肌細(xì)胞中Apelin-13蛋白測(cè)定 T12時(shí)各組細(xì)胞低速低溫離心，棄去上清液，收集下層細(xì)胞團(tuán)待測(cè)。根據(jù)大鼠Apelin-13酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書(shū)采用雙抗體夾心原理檢測(cè)心肌細(xì)胞中Apelin-13蛋白。最后組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以DMSO組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與DMSO組的相對(duì)值。

1.2.6 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞APJ和PI3K/Akt通路蛋白的相對(duì)表達(dá)量 T12時(shí)棄去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS清洗，用含1% PMSF的培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取劑提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度并配置上樣蛋白。配制SDS-PAGE 10%分離膠，5%濃縮膠電泳，采用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。裁剪膜所需條帶，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，加入兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗APJ（1:500）、兔抗PI3K（1:1 000）、兔抗p-PI3K（1:1 000）、兔抗Akt（1:1 000）和兔抗p-Akt（1:1 000）、一抗液浸沒(méi)相應(yīng)條帶于4 ℃水平搖床過(guò)夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1:5 000）室溫孵育1 h，后加入ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）自動(dòng)顯影讀取條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。最后組間數(shù)據(jù)比較時(shí)，以DMSO組為對(duì)照組，計(jì)算其他組與DMSO組的相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 4組乳鼠心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)變化

與DMSO組比：aP ＜0.05；與Bup組比：bP ＜0.05；與Apl組比：cP ＜0.05。圖1 4組乳鼠心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)變化

單純布比卡因處理后，T0時(shí)全部心肌細(xì)胞停止搏動(dòng)，布比卡因誘導(dǎo)心肌細(xì)胞停搏模型制備成功。各組間細(xì)胞自主搏動(dòng)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與DMSO組比，Bup組搏動(dòng)次數(shù)全程減少；Apl組搏動(dòng)次數(shù)在T0、T1明顯增加；BAp組搏動(dòng)次數(shù)在T0、T1、T2明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組搏動(dòng)次數(shù)全程增加；BAp組搏動(dòng)次數(shù)在T0、T1、T2明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組搏動(dòng)次數(shù)在T0、T1、T2、T4明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 4組乳鼠心肌細(xì)胞電鏡下線粒體形態(tài)

DMSO組及Apl組線粒體呈圓形或卵圓形，結(jié)構(gòu)完整，嵴呈板層狀，排列整齊、致密；Bup組線粒體明顯腫脹，結(jié)構(gòu)破壞空泡化，嵴移向周圍，變短溶解；BAp組線粒體較Bup組結(jié)構(gòu)明顯改善，嵴變致密，空泡減少。見(jiàn)圖2。

圖2 4組乳鼠心肌細(xì)胞電鏡下線粒體形態(tài)

2.3 4組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量比較

與DMSO組比，Bup組和BAp組的細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 4組乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH含量變化

2.4 4組乳鼠心肌細(xì)胞Apelin/APJ表達(dá)

與DMSO組比較，Bup組心肌細(xì)胞Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，Apl組心肌細(xì)胞Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，BAp組心肌細(xì)胞Apelin-13 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組心肌細(xì)胞Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組心肌細(xì)胞Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 4組乳鼠心肌細(xì)胞Apelin/APJ表達(dá)

2.5 4組乳鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)

與DMSO組比較，Bup組心肌細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，Apl組心肌細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組心肌細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組心肌細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4組心肌細(xì)胞PI3K和Akt總蛋白表達(dá)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 4組乳鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)

3 討論

對(duì)于布比卡因所致的循環(huán)虛脫甚至心臟停搏這種危急情況，尋求安全有效的搶救藥具有極其重要的臨床價(jià)值。Apelin作為一種多肽類物質(zhì)，翻譯修飾過(guò)程中切割成不同活性片段，如Apelin-36、 Apelin-17和Apelin-13等，而（Pyr1）Apelin-13是焦谷氨酰胺形式的Apelin-13，因其較高的抗降解性、穩(wěn)定的生物活性而被廣泛用于體內(nèi)外研究中[4，15]。 乳鼠心肌細(xì)胞是一種具有自發(fā)性節(jié)律搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。LDH作為催化乳酸和丙酮相互轉(zhuǎn)化的同工酶，穩(wěn)定存在于動(dòng)物組織中，而在心臟組織中活性較高。當(dāng)心肌細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外，故檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量可判斷細(xì)胞受損程度。本研究制備布比卡因誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞停搏模型，給予（Pyr1）Apelin-13處理，結(jié)果表明（Pyr1）Apelin-13 可以加快心肌細(xì)胞搏動(dòng)的恢復(fù)，明顯改善布比卡因所致的線粒體損傷，顯著減少培養(yǎng)液中LDH含量。這結(jié)果與本團(tuán)隊(duì)先前在在體大鼠[13]實(shí)驗(yàn)中報(bào)道的相符合。這提示（Pyr1）Apelin-13可以逆轉(zhuǎn)布比卡因心肌毒性，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，給治療布比卡因心肌毒性提供了新的思路。

布比卡因通過(guò)抑制離子通道功能[16]、抑制能量代謝[17]和加劇氧化應(yīng)激[18]等方面作用于心肌細(xì)胞從而產(chǎn)生心肌毒性。近年來(lái)研究報(bào)道Apelin不僅可加快心臟的傳導(dǎo)[9]、增強(qiáng)離子通道電流[15，19]、增強(qiáng)心肌收縮力[5]，還能改善心肌細(xì)胞能量代謝[11]、 減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激[7]，這些表現(xiàn)都與布比卡因心肌毒性的機(jī)制相拮抗。本研究結(jié)果顯示：與DMSO組比較，Bup組心肌細(xì)胞Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)顯著下降；而B(niǎo)Ap組Apelin-13及APJ蛋白表達(dá)較Bup組明顯上調(diào)。這提示布比卡因可抑制內(nèi)源性 Apelin/APJ蛋白表達(dá)，而外源性（Pyr1）Apelin-13可啟動(dòng)心肌細(xì)胞Apelin/APJ系統(tǒng)，改善布比卡因?qū)ζ涞囊种谱饔谩?/p>

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110構(gòu)成，被認(rèn)為是最重要的調(diào)節(jié)蛋白之一。而Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激 酶，是PI3K的主要下游分子。PI3K/Akt通路在心肌細(xì)胞功能、大小和存活的調(diào)控中起核心作用[20]。越來(lái)越多的研究表明Apelin/APJ系統(tǒng)通過(guò)激活PI3K/Akt通路發(fā)揮心臟保護(hù)作用。LI等[8]報(bào)道在小鼠急性心肌梗死模型中，外源性Apelin預(yù)處理可減輕小鼠急性缺血性心律失常發(fā)生，而聯(lián)用PI3K抑制劑LY294002處理后，可消除Apelin的心肌保護(hù)作 用。另有研究報(bào)道體內(nèi)Apelin過(guò)表達(dá)的大鼠在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中可通過(guò)激活PI3K通路改善心功能、減少心肌損傷面積、減少心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激[7]。在H9C2心肌細(xì)胞研究中，Apelin-13 通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路減輕葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬[21]和苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大[12]。本研究中，與DMSO組比較，Bup組抑制心肌細(xì)胞中p-PI3K及p-Akt蛋白表達(dá)；而B(niǎo)Ap組p-PI3K及p-Akt蛋白表達(dá)較Bup組則顯著上調(diào)；但各組間PI3K及Akt蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與YE等[14]報(bào)道相符。這提示（Pyr1）Apelin-13也許通過(guò)激活PI3K/Akt磷酸化逆轉(zhuǎn)布比卡因誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞停搏。外源性（Pyr1）Apelin-13可逆轉(zhuǎn)布比卡因誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞停搏，其機(jī)制也許與激活PI3K/Akt磷酸化有關(guān)。