黃穎鵬，張珂，吳芳全，施迪邦，韓千年，王方巖

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其高發(fā)病率和高病死率使其成為世界第五大癌癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球有超過100萬例胃癌新發(fā)病例，約占確診的癌癥總數(shù)的5.6%[1]。在我國，每年約有679 100例胃癌患者確診[2]，由于早期診斷技術(shù)的普及不足，約有80%患者在診斷時(shí)已是腫瘤進(jìn)展階段。手術(shù)切除腫瘤是早期胃癌最主要的治療方法[3]，而對(duì)于晚期胃癌患者，目前以化療和靶向治療為主[4]。然而，接受化療的晚期胃癌患者仍面臨耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)等問題[5]，因此，深入研究有效的新型治療藥物及其相關(guān)作用機(jī)制具有重要意義。

丁酸是人體內(nèi)主要由腸道菌群代謝產(chǎn)生的一種短鏈脂肪酸[6]，是腸道上皮細(xì)胞重要能量來源，具有抗炎、保護(hù)腸道屏障的功能[7-8]。目前已有越來越多研究發(fā)現(xiàn)丁酸在抗腫瘤治療中的作用[9-11]，尤其是消化道腫瘤。HAGUE等[12]發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉通過抑制組蛋白去乙酰化、激活p53依賴性的p21表達(dá)，從而體外抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞生長。在胃癌中，已有初步研究表明丁酸鈉能夠通過多種途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[13-14]。丁酸鈉作為人體來源的天然代謝產(chǎn)物，其低毒性的特點(diǎn)為其臨床應(yīng)用提供了巨大優(yōu)勢(shì)。丁酸鹽能夠有效減少全身使用毒性的同時(shí)降低治療劑量，這種天然優(yōu)勢(shì)是丁酸在臨床上治療胃癌的重要依據(jù)。因此，研究丁酸鈉在胃癌治療中全新潛在機(jī)制，對(duì)于探索胃癌新型治療方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 細(xì)胞 人胃癌BGC-823細(xì)胞和AGS細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要藥物和試劑 丁酸鈉（上海阿拉丁公司）；EdU Apollo567 試劑盒（廣州銳博生物公司）；琥珀?；贵w（杭州景杰生物公司）；GAPDH抗體（杭州華安生物公司）；FITC-IgG抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；SYBR Green Master Mix（美國Roche公司）；線粒體熒光探針MitoTracker Red CMXRos（上海翌圣生物公司）。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；正置顯微鏡（美國Nikon公司）；酶標(biāo)儀、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823在37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。生長至融合度約80%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期BGC-823、AGS細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中。丁酸處理組加入5 mmol/L丁酸鈉培養(yǎng)48 h[15-16]，對(duì)照組加入等量磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。加入含 50 μmol/L EdU的培養(yǎng)基，孵育2 h后按試劑生產(chǎn)商說明進(jìn)行固定、中和、通透、染色等操作，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 向BGC-823、AGS細(xì)胞中加入5 mmol/L丁酸鈉培養(yǎng)48 h，對(duì)照組加入等量PBS。待處理完成后，將細(xì)胞消化，按5×104個(gè)/孔加入Transwell上室并用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。同時(shí)，下室加入含有10% FBS的培養(yǎng)基。孵育24 h后，取出小室，棄去上層培養(yǎng)基，固定后使用0.4%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入5 mmol/L丁酸鈉處理不同時(shí)間（對(duì)照組加入等體積PBS）后棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞并提取蛋白，經(jīng)濃度測(cè)定后行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)試劑生產(chǎn)商說明進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后使用對(duì)應(yīng)一抗及二抗孵育以及曝光。在凝膠成像儀中進(jìn)行顯像。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè) 使用TRIzol RNA分離試劑從細(xì)胞中分離總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR采用SYBR Green Master Mix II作為熒光標(biāo)記，在高通量熒光定量PCR儀上以上95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s的程序進(jìn)行40～45個(gè)循環(huán)及定量。運(yùn)行結(jié)束后結(jié)合內(nèi)參Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.6 免疫熒光染色 向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 5 mmol/L丁酸鈉處理不同時(shí)間（對(duì)照組加入等體積PBS）后棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞30 min后用PBS洗滌2次，加入0.5 Triton X-100通透15 min，用5%山羊血清進(jìn)行室溫封閉15 min。加入相應(yīng)抗體后放入濕盒內(nèi)4 ℃過夜孵育。室溫靜置30 min后，PBS洗滌3次，分別用FITC偶聯(lián)的抗兔或抗鼠IgG抗體（1:500）檢測(cè)特異性結(jié)合的一抗。PBS洗滌后用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，在Nikon正置熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁酸抑制胃癌細(xì)胞增殖能力

使用5 mmol/L丁酸鈉處理胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和BGC-823 48 h后通過EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，兩種胃癌細(xì)胞在丁酸處理后密度均有所降低，同時(shí)丁酸處理組EdU染色陽性的增殖細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），見圖1A、圖1B。此 外，丁酸鈉處理48 h后細(xì)胞遷移能力的Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，丁酸鈉處理能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞AGS和BGC-823的遷移（P＜0.01），見圖1C、圖1D。

圖1 丁酸鈉處理后胃癌細(xì)胞的增殖和遷移情況

2.2 丁酸顯著影響B(tài)GC-823細(xì)胞能量代謝組

使用5 mmol/L丁酸鈉處理胃癌細(xì)胞系BGC-823 48 h并收集細(xì)胞代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析。KEGG富集分析結(jié)果顯示，丁酸處理后的胃癌細(xì)胞中代謝途徑主要富集到三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等生物主要代謝途徑（圖2A），表明丁酸在影響細(xì)胞代謝中發(fā)揮了極其重要的影響作用。丁酸處理后胃癌細(xì)胞中的代謝物變化結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，丁酸處理組L-蘋果酸、琥珀酰輔酶A、延胡索酸、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）顯著上調(diào)，而草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）、還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）顯著下調(diào)（圖2B、圖2C）。

圖2 丁酸處理后胃癌細(xì)胞BGC-823代謝特征變化

2.3 丁酸促進(jìn)BGC-823的蛋白質(zhì)琥珀?；?/h3>

BGC-823細(xì)胞中的琥珀酰化蛋白水平隨丁酸處理時(shí)間延長而上升（圖3A）。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)果顯示隨著丁酸處理時(shí)間延長，BGC-823細(xì)胞中位于胞質(zhì)中的琥珀?；鞍谉晒鈴?qiáng)度增加，并與線粒體具有共定位關(guān)系（圖3B）。同時(shí)，探針標(biāo)記的維持正常膜電位的線粒體隨丁酸處理而減少。

圖3 丁酸處理后BGC-823細(xì)胞中琥珀酰化修飾水平變化

2.4 丁酸上調(diào)SUCLG1促進(jìn)BGC-823蛋白琥珀?；?/h3>

胃癌細(xì)胞BGC-823中琥珀?；嚓P(guān)基因RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，丁酸處理48 h后，介導(dǎo)蛋白琥珀?；腟UCLG1、SUCLG2和SUCLA2的mRNA水平顯著升高（P＜0.01），其中SUCLG1呈現(xiàn)丁酸處理時(shí)間依賴性上調(diào)，而介導(dǎo)去琥珀?；腟IRT5表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 丁酸對(duì)胃癌細(xì)胞中琥珀酰輔酶A合成酶表達(dá)的影響

3 討論

丁酸屬于四碳飽和短鏈脂肪酸，主要由腸道的革蘭陽性厭氧菌通過乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶途徑或磷酸轉(zhuǎn)丁?；负投∷峒っ竿緩疆a(chǎn)生[6]。丁酸的主要生理功能是作為腸道尤其是結(jié)腸上皮的能量來源，供細(xì)胞產(chǎn)能，并起到穩(wěn)定腸道上皮的作用[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)丁酸作為組蛋白去乙?；敢种苿┌l(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[17]，此外，丁酸鈉也被證實(shí)在結(jié)直腸 癌[17]、乳腺癌[18]、肝癌[19]等多種惡性腫瘤中對(duì)細(xì)胞分化、增殖、遷移侵襲有明顯的抑制作用。本研究使用丁酸鈉處理胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示丁酸鈉顯著抑制了BGC-823、AGS細(xì)胞的增殖及遷移能力，表明丁酸在胃癌的治療應(yīng)用中具有一定前景。

代謝重編程是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要事件[20]，在正常細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)變的過程中，為了滿足自身代謝需求，細(xì)胞會(huì)通過各種代謝途徑調(diào)整自身生物能量合成，以滿足腫瘤增殖和生存所需。丁酸作為人體部分細(xì)胞的能量來源，與細(xì)胞能量代謝密不可分，丁酸通過促進(jìn)丙酮酸激酶磷酸化和四聚體化，從而重編程結(jié)腸癌細(xì)胞代謝過程，抑制腫瘤Warburg效應(yīng)[21]。為了進(jìn)一步探索丁酸對(duì)胃癌細(xì)胞代謝功能的影響，我們對(duì)丁酸處理后的胃癌細(xì)胞BGC-823進(jìn)行了代謝組學(xué)測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化途徑在丁酸處理后顯著富集，多種代謝底物包括琥珀酰輔酶A在丁酸處理后顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明丁酸處理可顯著激活胃癌細(xì)胞中的有氧呼吸，一定程度上發(fā)揮抑制Warburg效應(yīng)的作用。

除了作為三羧酸循環(huán)的重要底物外，琥珀酰輔酶A能夠充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)琥珀?；w，通過酶學(xué)或非酶學(xué)方式將琥珀酰基共價(jià)結(jié)合到賴氨酸殘基上完成蛋白修飾[22]。琥珀?；侵匾牡鞍踪|(zhì)翻譯后修飾方式，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮了關(guān)鍵作 用[23]。因此，我們通過Western blot和免疫熒光染色檢測(cè)了丁酸處理后胃癌細(xì)胞BGC-823中的琥珀酰化程度，結(jié)果顯示丁酸處理能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)總體琥珀?；揎椝?，由于丁酸處理 48 h顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少，因此將丁酸處理36 h作為最大處理時(shí)間進(jìn)行免疫熒光的檢測(cè)。值得注意的是，目前研究表明胃癌細(xì)胞中乳酸脫氫酶的賴氨酸222（LADH-K222）位置[24]以及鈣結(jié)合蛋白S100A10的賴氨酸47（S100A10-K47）位置[25]的琥珀酰化能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長和遷移，然而，在這兩個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子量位置（30 kDa 和10 kDa）并未觀察到丁酸處理前后琥珀?；阶兓▓D3A），因此我們推測(cè)，丁酸介導(dǎo)的蛋白琥珀?；峭ㄟ^其他靶蛋白發(fā)揮抑癌作用，但其具體效應(yīng)蛋白及修飾位點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。

SIRT5是哺乳動(dòng)物中主要的去琥珀?；?，能夠逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)琥珀?；揎梉26]，而SUCLG1、SUCLG2和SUCLA2分別編碼琥珀酰輔酶A合成酶的不同亞基，其表達(dá)水平和蛋白琥珀?；潭瘸收嚓P(guān)[27]。為了更深入地探索丁酸促進(jìn)胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)琥珀?；臋C(jī)制，我們分別檢測(cè)了丁酸鈉處理后胃癌細(xì)胞中上述基因表達(dá)，結(jié)果顯示SUCLG1、SUCLG2以及SUCLA2表達(dá)水平在丁酸處理48 h后均顯著上調(diào)，其中SUCLG1水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)。而SIRT5的mRNA水平在丁酸處理前后均無顯著差異，以上證據(jù)足以表明丁酸通過上調(diào)SUCLs表達(dá)以促進(jìn)胃癌細(xì)胞BGC-823中的蛋白質(zhì)琥珀?；?。本研究結(jié)果表明，丁酸能夠通過激活琥珀酰輔酶A合成酶編碼基因，促進(jìn)琥珀酰輔酶A合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)琥珀酰化水平上調(diào)。

綜上所述，本研究明確了丁酸可抑制胃癌細(xì)胞增殖及遷移，并探討了其對(duì)胃癌細(xì)胞代謝途徑以及蛋白琥珀酰化的影響途徑，后期本課題組還將進(jìn)一步深入研究丁酸促進(jìn)胃癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)琥珀?；木唧w作用位點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制。胃癌嚴(yán)重危害人體健康，丁酸有望成為胃癌治療的新方向。