王曉武，朱仙懂，王永強(qiáng)，吳志炫，溫知楷，吳大洲，陳吉彩

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.肝膽胰外科；2.甲狀腺外科；3.乳腺外科；4.疝與腹壁外科

皮瓣移植是修復(fù)外傷、腫瘤切除、下肢血管性潰瘍或糖尿病引起的皮膚缺損的重要外科技 術(shù)[1-3]，但是移植后的皮瓣壞死仍是問題[4-5]；而目前國內(nèi)外的主流觀點(diǎn)是認(rèn)為皮瓣的壞死是由血流再灌注不足、回流阻塞以及缺血再灌注損傷所引起的，而后者會(huì)引發(fā)皮瓣組織循環(huán)障礙、活性氧物質(zhì)大量生成等系列問題[5]。這將會(huì)影響皮瓣組織和細(xì)胞的形態(tài)和功能，以及細(xì)胞“微環(huán)境”-細(xì)胞因子的變化。機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，每種因子的作用不可忽視，因此探討每種因子的作用將有助于多層次的了解缺血隨意皮瓣存活與生長因子的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）能促進(jìn)不同類型皮瓣的存活，并能促進(jìn)移植皮瓣感覺恢復(fù)[6]，但是具體分子機(jī)制仍不詳。本研究以大鼠糖尿病缺血隨意皮瓣為代表模型，通過動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討NGF改善糖尿病大鼠隨意皮瓣缺血壞死的分子機(jī)制，為NGF應(yīng)用于糖尿病缺血隨意皮瓣存活和防治提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物造模與分組 實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物來自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0017。6～8周的240～320 g健康雄性Wistar大鼠40 只。飼養(yǎng)環(huán)境：5 只/籠，SPF環(huán)境（溫度20～24 ℃，濕度50%～60%）下，用蒸餾水和優(yōu)質(zhì)實(shí)驗(yàn)飼料喂養(yǎng)。使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后展開后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（WYYY-AEC-2023-036）。建立I型糖尿病大鼠模型，40只大鼠注射1%鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ，65 mg/kg）[7]。在STZ注射前1天及注射后第3、5、7天，通過監(jiān)測(cè)尾靜脈血液中的血糖濃度是否超過16.67 mmol/L證實(shí)模型成功與否。I型糖尿病模型穩(wěn)定后，隨機(jī)分為DM組（20 只）、DM+NGF組（20只）。在I型糖尿病模型上，對(duì)2組大鼠建立改良McFarlane皮瓣模型[8]。建模流程：將所有大鼠利用異氟烷誘導(dǎo)和維持麻醉，將每只大鼠俯臥置于塑料板上，固定肢體，用剃刀進(jìn)行背部備皮，范圍為3 cm×9 cm，用亞甲藍(lán)標(biāo)記矩形隨機(jī)皮瓣范圍（寬3 cm、長9 cm）進(jìn)行皮瓣模型建立，而皮瓣手術(shù)均由熟悉皮瓣移植的同一人完成。具體手術(shù)步驟：將皮膚和淺筋膜與深筋膜完全剝離，保留真皮下毛細(xì)血管網(wǎng)，保留蒂部并結(jié)扎蒂部雙側(cè)髂動(dòng)脈；采用4-0醫(yī)用縫合線將皮瓣修復(fù)至原位。術(shù)后DM+NGF組在皮瓣固定點(diǎn)處注射10 nmol/（mL·kg）NGF[9]，DM組注射等量0.9%氯化鈉溶液7 d，完成相應(yīng)實(shí)驗(yàn)并收集組織標(biāo)本后用1%～3%劑量的異氟烷和氧氣混合氣體麻醉大鼠，使大鼠安樂死。

1.1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）由上海iCell公司提供。使用ECM完全培養(yǎng)基，配置體系為500 mL ECM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5 mL內(nèi)皮生長添加物+5 mL青霉素/鏈霉素溶液，按比例配置完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)環(huán)境為：37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。待HUVEC融合度達(dá)到85%～90%，細(xì)胞呈鵝卵石 狀，狀態(tài)良好，培養(yǎng)基無污染，用胰酶-EDTA（含0.25%胰酶）消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞建模和實(shí)驗(yàn)。為確認(rèn)HUVEC高糖模型的糖濃度，向ECM完全培養(yǎng)基中添加不同濃度的10%葡萄糖溶液使 培養(yǎng)基最終糖濃度為5.5、15、25、37.5 mmol/L， 通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC的活性，最終確認(rèn)細(xì)胞高糖模型的葡萄糖濃度為25 mmol/L，并與ECM完全培養(yǎng)基配制成高糖ECM完全培養(yǎng)基，作為后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。基于該模型，將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞模型組（DM組）和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（DM+NGF）組。為確定NGF對(duì)高糖環(huán)境下HUVEC活力影響的最適合濃度，在高糖ECM完全培養(yǎng)基中加入不同濃度NGF溶液，使得NGF最終濃度為0、12.5、25、50、100、200 ng/mL，將其置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理24 h，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力和增殖情況。

1.1.3 主要耗材與試劑 NGF購自武漢海特生物制藥股份有限公司；STZ和Triton X-100購自由美國Sigma公司；基質(zhì)膠和transwell小室購自美國Corning公司；TRIzol試劑、SYBR Green和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購自美國Thermo Fisher公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司；抗熒光淬滅封片液、DAPI染色液、4%細(xì)胞固定液、0.1%結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒由美國Biolite公司提供；4%多聚甲醛、DAB顯色試盒和HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫（H2O2）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CD31一抗（兔源）購自英國Abcam公司；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、糖基化終未產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation products,RAGE）和微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein 2, MCM2）一抗（兔源）購自美國Affinity公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自中國Bioworld公司；Cora?Lite 488熒光二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；其余試劑和生物化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 皮瓣壞死存活的測(cè)量 術(shù)后第7天（POD7），使用高級(jí)攝影照相機(jī)對(duì)所有皮瓣進(jìn)行評(píng)估。肉眼觀察皮瓣顏色；是否結(jié)痂、出血、分泌物滲出；毛發(fā)發(fā)育和顏色。用拓印紙拓印皮瓣壞死和存活面積，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ImageJ軟件測(cè)量并評(píng)估存活皮瓣的面積。計(jì)算公式：皮瓣存活百分比（%）=存活區(qū)范圍/整個(gè)皮瓣。

1.2.2 HE染色 用手術(shù)器械采集大鼠背部皮瓣的皮瓣組織，在4%多聚甲醛中固定24 h。第2天取出組織樣本，修整至0.5 cm×0.5 cm大小，然后沖洗、脫水并用組織包埋機(jī)將其包埋在石蠟中，再用組織切片機(jī)將皮瓣蠟塊切成4～5 μm厚的組織石蠟切片。根據(jù)HE染色試劑盒的說明書對(duì)組織切片進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察隨機(jī)多視野下拍照。

表1 引物序列

1.2.3 免疫組化染色 將組織石蠟切片進(jìn)行烘干、脫蠟、水化處理，按照先前工作流程以及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)探索地染色條件進(jìn)行組織切片的染色、脫水、透明和封片[10]。不同的是本實(shí)驗(yàn)的一抗為CD31（1:200）和VEGF（1:400）。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并在隨機(jī)多視野下拍照。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 根據(jù)不同濃度的NGF（0、12.5、25、50、100和200 ng/mL）設(shè)置組別，每組至少3個(gè)孔。往96孔板中添加細(xì)胞（5 000個(gè)細(xì)胞/孔），用25 mmol/L糖濃度ECM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24 h，待其貼壁，24 h后，移去舊培養(yǎng)基，加入不同濃度的NGF，培養(yǎng)24 h。再向每孔加入10 μL的10% CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中黑暗孵育1～4 h，然后用酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）在450 nm測(cè)定OD值，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 消化、重懸和計(jì)數(shù)良好長勢(shì)的細(xì)胞，向96孔板中的每個(gè)孔中加入3 500個(gè)細(xì)胞。在高糖ECM完全培養(yǎng)基上，設(shè)定組別為NGF（0、50、100和200 ng/mL），每組至少3個(gè)孔。之后流程按照先前工作進(jìn)行[10]，用不同濃度的NGF培養(yǎng)1、3、5 d，在固定時(shí)間點(diǎn)消化各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)。最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 MCM2+細(xì)胞免疫熒光 設(shè)置細(xì)胞DM組和DM+NGF組。首先，往含有圓形爬片的12孔板中加入細(xì)胞（10 000～20 000個(gè)細(xì)胞/孔），搖勻細(xì)胞、待細(xì)胞貼壁。之后DM+NGF組加入含NGF的高糖ECM完全培養(yǎng)基，兩組均培養(yǎng)24 h。然后，根據(jù)先前工作流程進(jìn)行后續(xù)操作[10]，以MCM2抗體為一抗。最后用免疫熒光顯微鏡在隨機(jī)多視野下對(duì)MCM2+細(xì)胞進(jìn)行拍攝。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板接種相同濃度的細(xì)胞量并晃勻。待細(xì)胞融合度達(dá)到100%時(shí)，用200 μL的黃色槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS洗去脫落細(xì)胞，DM組中加入2 mL的（內(nèi)含2%血清+25 mmol/L葡萄糖，不含內(nèi)皮生長添加物）ECM培養(yǎng)基，而在DM+NGF組中加入上述ECM培養(yǎng)基并添加100 ng/mL NGF，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在0、24 h時(shí)間點(diǎn)在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍攝圖片。結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 將30 000個(gè)細(xì)胞加入上室中。向DM+NGF組中加入100 ng/mL NGF，向?qū)φ战M中加入PBS。將800 μL（內(nèi)含20%血清+25 mmol/L葡萄糖，不含內(nèi)皮生長添加物）ECM培養(yǎng)基加入到下室中，將其在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后流程按照先前工作進(jìn)行[10]，最后在倒置顯微鏡下隨機(jī)視野拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.9 血管形成實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)凝膠從-20 ℃的冰箱中取出，將其包埋在干冰中，使其成為液體狀態(tài)。將50 μL/孔的基質(zhì)凝膠加入到96孔板中，搖動(dòng)凝膠使其均勻分布。將其放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱3～4 h讓膠固化。將同一瓶中的細(xì)胞消化并在離心機(jī)中離心以獲得兩管沉淀的細(xì)胞團(tuán)，然后將它們加入到含有或不含有NGF的高糖ECM完全培養(yǎng)基中，再重新懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將35 000個(gè)細(xì)胞/100 μL細(xì)胞懸液加入到96孔板中，并將該板轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在0和6 h時(shí)用倒置顯微鏡拍攝血管生成的照片。使用ImageJ軟件對(duì)獲得的圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.10 NGF與常見血管生成相關(guān)因子的關(guān)系 將NGF和常見的血管生成相關(guān)基因[VEGF、表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor, EGF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）血小板衍生生長因子A（platelet derived growth factor A, PDGFA）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（stromal cell derived factor 1α, SDF1α）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）]輸入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫建立PPI，并分析這些基因的GO和KEGG功能富集情況。

1.2.11 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)過程參考以前的工作[10]。HUVEC的總RNA提取按照總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。7500 Fast系統(tǒng)（American Applied Biology Systems, USA）用于RT-qPCR分析。采用上海捷瑞生物工程有限公司研發(fā)的mRNA特異性引物檢測(cè)VEGF、PDGFA、SDF1α、HIF-1α、EGF、Arg-1、bFGF的表達(dá)。采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

1.2.12 RNA-seq 測(cè)序數(shù)據(jù)集包含6個(gè)HUVEC樣本，分為兩組：DM組（25 mmol/L高糖正常組，3個(gè)樣本）和DM+NGF組（25 mmol/L高糖+24 h NGF處理組，3 個(gè)樣本）。收獲細(xì)胞團(tuán)低溫保存并運(yùn)送至上海前程生物科技有限公司進(jìn)行RNA-seq操作和分析。使用RNAmini試劑盒（Qiagen, Germany）從細(xì)胞中提取總RNA。mRNA的富集、片段化、反轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建、Illumina Novaseq 6000和數(shù)據(jù)分析由Tenk Genomics進(jìn)行。利用R軟件的DESeq2軟件包分析后，根據(jù)|log2FC|≥1和P＜0.05選擇差異表達(dá)mRNAs。然后在Reactome數(shù)據(jù)庫中分析差異表達(dá)的mRNAs的功能富集情況。

1.2.13 Western blot實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)方法參考本課題組前期研究成果[10]。根據(jù)細(xì)胞分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和預(yù)處理后收集細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)；根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的分組分別獲取相應(yīng)的動(dòng)物皮瓣蛋白并進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。使用的抗體如下：CD31、p-ERK1/2（1:1 000）；VEGF、RAGE（1:1 000）；絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、p-AKT、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K，1:1 000）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用Graphpad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGF對(duì)糖尿病大鼠隨意皮瓣存活面積率的影響

在皮瓣移植模型后的第7天，DM組所有大鼠在所有皮瓣的I區(qū)（遠(yuǎn)端區(qū)）的大部分皮瓣中形成痂，沒有毛發(fā)生長。在皮瓣II區(qū)（中間部分）和III區(qū)（蒂部區(qū)）的傷口邊緣有散在的痂和變黑。DM+NGF組I區(qū)少數(shù)大鼠皮瓣呈棕褐色和暗紅色，其余皮瓣區(qū)無黑色痂，有少量毛發(fā)生長，而I、II、III區(qū)其余大鼠皮瓣無黑色硬痂，有少量毛發(fā)生長。與DM組比，DM+NGF組皮瓣存活率更高。術(shù)后第7天發(fā)現(xiàn)DM+NGF組皮瓣存活率高達(dá)85%～90%，而DM組為70%～75%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 術(shù)后第7天NGF對(duì)I型糖尿病大鼠缺血隨意皮瓣存活的影響

2.2 NGF促進(jìn)糖尿病缺血隨機(jī)皮瓣的血管生成

與DM組比，DM+NGF組皮瓣中有更多的新生微血管，且DM+NGF組中CD31+微血管的密度比DM組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2A。免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，皮瓣組織DM+NGF組CD31和VEGF表達(dá)水平高于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2B、圖2C。

圖2 皮瓣組織HE染色、CD31/VEGF指標(biāo)免疫組化染色及CD31/VEGF相應(yīng)蛋白表達(dá)量的結(jié)果

2.3 移植皮瓣的存活和血管生成與AGE-RAGE/MAPKERK1/2信號(hào)通路的關(guān)系

與DM組比，10 μg/mL NGF的DM+NGF組RAGE蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而MAPKERK1/2信號(hào)通路中p-ERK1/2的蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 移植皮瓣存活和血管生成與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路的關(guān)系

2.4 NGF促進(jìn)高糖環(huán)境中HUVEC的活力和增殖

HUVEC的活性隨著葡萄糖濃度增加而降低；與5.5 mmol/L濃度比，在25.0 mmol/L和37.5 mmol/L濃度下HUVEC的活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但25.0 mmol/L和37.5 mmol/L間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能達(dá)到HUVEC細(xì)胞可以耐受的最高葡萄糖濃度，見圖4A。因此，用25 mmol/L葡萄糖建立細(xì)胞高糖模型。不同濃度的NGF對(duì)25 mmol/L 葡萄糖中HUVEC活性的影響，在0～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，HUVEC活性隨NGF濃度的增加而增加，NGF在100 ng/mL時(shí)增殖最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖4B。100 ng/mL的NGF作用6 d也是增殖效果最顯著的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4C。與DM組比，DM+NGF組的MCM2+陽性細(xì)胞數(shù)較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4D。

圖4 NGF對(duì)在高糖環(huán)境下HUVEC增殖的影響

2.5 NGF促進(jìn)高糖環(huán)境中HUVEC的遷移和血管生成

在25 mmol/L葡萄糖濃度下，DM+NGF組在24 h內(nèi)的愈合面積比DM組大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5A。DM+NGF組較DM組遷移細(xì)胞數(shù)多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5B。25 mmol/L葡萄糖濃度下，100 ng/mL NGF組6 h內(nèi)血管形成的總長度、總分支長度和總分段長度均大于DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5C。

圖5 在25 mmol/L葡萄糖環(huán)境中100 ng/mL NGF對(duì)HUVEC遷移和血管生成的影響

2.6 NGF上調(diào)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)

NGF與常見血管生成因子的關(guān)系及功能富極化分析結(jié)果：NGF與VEGF、PDGFA、EGF、HIF-1α、SDF1α、Arg-1、bFGF、TGF-β相互作用；這些基因的GO分析結(jié)果主要富集到了內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、表皮生長因子信號(hào)通路、傷口愈合、生長因子受體激活和調(diào)控、血管生成和PI3K分子調(diào)控相關(guān)的功能（P＜0.05），見圖6A-D。KEGG分析的結(jié)果主要涉及MAPK信號(hào)通路和AGE-RAGE信號(hào)通路。與DM組比，DM+NGF組的VEGF、PDGFA、HIF-1α、Arg-1和bFGF的mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6E-K。與血管生成相關(guān)的主要因子VEGF在DM+NGF組中比DM組蛋白相對(duì)表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6L。

圖6 NGF與常見血管生成相關(guān)因子的互作、功能富極化分析和表達(dá)調(diào)節(jié)的結(jié)果

2.7 HUVEC的RNA-seq的結(jié)果

DM+NGF組中MMP-2、ZNF33B、TPP1等基因表達(dá)量高于DM組，ZNF330、LIME1等基因表達(dá)量低于DM組，見圖7A、圖7B。在Reactome數(shù)據(jù)庫中，這些差異基因 主要富含與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的代謝通路，見圖7C。

圖7 HUVEC的RNA-seq的結(jié)果

2.8 HUVEC表型與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路的關(guān)系

在25 mmol/L葡萄糖濃度下，100 ng/mL NGF促進(jìn)了HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。與DM組比，DM+NGF組中RAGE的蛋白表達(dá)降低，MAPK信號(hào)通路中的p-ERK1/2的蛋白表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖8。

圖8 HUVEC表型與AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路間關(guān)系

3 討論

近年來，隨著糖尿病相關(guān)的慢性難愈合性創(chuàng)面（chronic refractory wounds, CRWs）或其他CRWs[11]的發(fā)病率不斷增加，隨意皮瓣移植的應(yīng)用也將顯著增加，但隨意皮瓣存活和壞死問題仍未解決。而影響皮瓣存活與壞死的關(guān)鍵因素之一是血管狀態(tài)，它也是皮瓣存活與壞死之間的橋梁[12]。本研究創(chuàng)新性地關(guān)注NGF與糖尿病隨意缺血皮瓣成活及血管生成的關(guān)系，首次通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NGF通過影響AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病缺血隨意皮瓣血管生成，而益于皮瓣成活。以往的研究表明，大鼠缺血皮瓣的存活與細(xì)胞因子途徑有關(guān)[13]。然而，據(jù)報(bào)道細(xì)胞因子在糖尿病皮膚中經(jīng)常被混淆和缺乏表達(dá)，常見的因子包括 bFGF、VEGF和NGF等[14]。NGF是一種最常見的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其主要結(jié)構(gòu)是由三個(gè)α 2βγ 2亞基組成的復(fù)合體，β亞基是NGF發(fā)揮生物學(xué)功能的主要結(jié)構(gòu)[15]。有報(bào)道稱，NGF除了本身有營養(yǎng)神經(jīng)的功能之外，還有很強(qiáng)抗炎作用[15]、促進(jìn)血管生成[16]，修復(fù)創(chuàng) 面[14]、減少氧化應(yīng)激損傷[17]等作用，NGF還能促進(jìn)不同類型皮瓣的存活，但機(jī)制不詳。本研究為了探討NGF對(duì)糖尿病缺血隨意皮瓣成活的影響，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DM+NGF組皮瓣成活面積比DM組多10%～20%。DM+NGF組中CD31+標(biāo)記的微血管數(shù)量和CD31相對(duì)蛋白表達(dá)水平均高于DM組；但DM+NGF組和DM組中VEGF的整體表達(dá)水平非常低，這可能是VEGF抗體結(jié)合不良的原因，但并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)論。與DM組比，DM+NGF組中皮瓣組織蛋白中VEGF的高表達(dá)也證實(shí)了這一點(diǎn)。上述結(jié)果表明NGF能促進(jìn)糖尿病皮瓣血管生成，有利于皮瓣成活。

血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中內(nèi)皮細(xì)胞受血管生成相關(guān)的促進(jìn)和抑制因子的調(diào)節(jié)，并涉及多種信號(hào)通路的參與[18]。這一過程中常見的調(diào)節(jié)因子有VEGF、HIF-1α、bFGF、PDGFA、EGF等。其中，VEGF是促進(jìn)血管生成的主要因子；而與血管生成相關(guān)的常見信號(hào)通路包括p38 MAPK-ERK1/2信號(hào)通路和PI3K-AKT信號(hào)通路[19-20]。本研究結(jié)果表明，在 25 mmol/L葡萄糖環(huán)境中，100 ng/mL NGF可刺激HUVEC分泌VEGF、PDGFA、HIF-1α、Arg-1和bFGF等與血管生成相關(guān)的因子，促進(jìn)血管生成。許多研究報(bào)告稱，在糖尿病皮膚中發(fā)現(xiàn)許多因子缺乏，包括NGF[14]。結(jié)合糖尿病皮膚結(jié)構(gòu)中微血管的減少和周圍神經(jīng)的損傷，推測(cè)NGF可能是導(dǎo)致糖尿病因子紊亂和缺乏的關(guān)鍵因素。關(guān)于NGF的促進(jìn)血管生成作用，有研究[21]發(fā)現(xiàn)NGF促進(jìn)血管生成與直接和間接影響VEGF表達(dá)有關(guān)；但HAN等[22]發(fā)現(xiàn)，NGF促血管生成作用不受VEGF抑制劑的抑制，或許這與NGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌bFGF等其他血管生成相關(guān)的促進(jìn)因子有關(guān)。NGF向細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)提供信號(hào)并促進(jìn)血管生成。內(nèi)皮細(xì)胞首先影響皮瓣的微環(huán)境和微環(huán)境中的細(xì)胞狀態(tài)。在NGF的刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管生成因子，如VEGFA。VEGFA通過激活多種酶，如VEGFR2、VEGFA相關(guān)的絲裂原活化激酶和激活MAPKERK1/2通路，可產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖、遷移和血管生成的生物學(xué)效應(yīng)[7]。此外，NGF還可刺激bFGF在內(nèi)的其他因子通過其下游靶分子信號(hào)促進(jìn)血管生成。總之，NGF影響內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管生成相關(guān)的生長因子，這些因子在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成中發(fā)揮協(xié)同作用，導(dǎo)致缺血皮瓣血管生成增加，改善皮瓣的缺血，促進(jìn)其存活。

在探討何種機(jī)制時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)了NGF與AGERAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。至于與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號(hào)通路，其主要與兩個(gè)主要分子AGEs和RAGE有關(guān)。AGEs是糖基化末端物質(zhì)，主要是原糖與蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)生的不可逆的穩(wěn)定產(chǎn)物，它們通常在糖尿病患者中高度表達(dá)[23]。至于RAGE，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的膜上。在血管損傷領(lǐng)域，AGEs與RAGE結(jié)合后會(huì)內(nèi)化到內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中，導(dǎo)致血管基底膜的形態(tài)和功能發(fā)生劇烈變化，從而導(dǎo)致血管的功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。兩者結(jié)合可以通過NF-κB[24]信號(hào)通路刺激多種下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥因子和氧自由基產(chǎn)物的產(chǎn)量增多，引起了包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境的變化和細(xì)胞損傷甚至死亡。這種變化在宏觀上體現(xiàn)之一為皮瓣血管狀態(tài)的改變，類似于皮瓣缺血再灌注損傷過程中活性氧的產(chǎn)生、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和炎癥因子的瀑布式爆發(fā)導(dǎo)致的血管改變。更糟糕的是氧自由基產(chǎn)物增加了糖酵解途徑中的中間產(chǎn)物數(shù)量，相應(yīng)地增加了AGEs的數(shù)量，從而引發(fā)炎癥的惡性循環(huán)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，NGF降低了高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞RAGE的表達(dá)，從而抑制了這種惡性循環(huán)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高表達(dá)的p-ERK1/2 還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，這與本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即 100 ng/mL的NGF能促進(jìn)含25 mmol/L葡萄糖的高糖環(huán)境中HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，這些表型與MAPK-ERK1/2通路有關(guān)[26]。這一點(diǎn)也與細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MAPK信號(hào)通路有關(guān)相符合。

綜上所述，本研究首次通過細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NGF通過影響AGE-RAGE/MAPK-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)糖尿病缺血隨意皮瓣血管生成而益于皮瓣成活，為糖尿病缺血皮瓣的研究做好鋪墊，也為皮瓣存活和防治壞死提供了理論支持。