古麗切合熱·依布拉音,李艷紅,塔吉古麗·阿不里克木,付建紅,阿迪拉·吐爾遜塔依

(新疆師范大學生命科學學院 新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室 干旱區(qū)植物逆境生物學實驗室,新疆 烏魯木齊 830054)

白癜風(vitiligo)是一種不明原因引起的色素脫失性皮膚疾病,病程長、易復發(fā),臨床特征為皮膚、黏膜出現(xiàn)白色斑片及毛發(fā)變白,發(fā)病率為0.5%～2.0%,目前仍沒有安全有效的治療方法。白癜風雖然不危害生命,但其突發(fā)的容貌變化和慢性病程往往會給患者帶來心理壓力,降低生活質(zhì)量[1]。因此,很有必要探索安全有效的新型藥物。

由于黑色素細胞能夠直接反映黑色素與白癜風之間的關系,因此對白癜風發(fā)病機制和治療的研究重點往往集中于黑色素細胞,而忽略了角質(zhì)形成細胞(HaCaT)的重要性。研究表明,HaCaT細胞在黑色素細胞的凋亡過程中扮演著重要角色[2]。HaCaT細胞是人體表皮細胞中數(shù)量最多的細胞,約占80%,與黑色素細胞存在直接或間接相互作用,影響黑色素細胞的增殖、分化、凋亡和功能[3-4]。自1988年Halaban首次成功建立HaCaT細胞和黑色素細胞體外共培養(yǎng)體系以來,因其能夠較好地模擬皮膚的生理狀況而被眾多學者廣泛采用并改進,進行了HaCaT細胞和黑色素細胞的相互作用、色素的轉(zhuǎn)移和分布、移植治療白癜風、篩選和驗證藥物等研究。

圣草酚(eriodictyol),又名北美圣草素,化學名3′,5,4′,7-四羥基黃酮烷,單體為淡黃色結晶粉末,易溶于甲醇,是具有抗炎、抗氧化和抗癌活性[5-6]的天然黃酮類化合物。作者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn),驅(qū)蟲斑鳩菊[Vernoniaanthelmintica(L.) Willd]黃酮類組分中主要成分紫鉚素、紫鉚因、圣草酚及甘草素對氧化應激損傷的HaCaT細胞有保護作用,其中圣草酚的保護作用最強。因此,作者在此建立HaCaT細胞和黑色素瘤細胞(B16)體外共培養(yǎng)體系,分別采用MTT法測定細胞增殖率、多巴氧化速率法測定細胞酪氨酸酶激活率、氫氧化鈉裂解法測定細胞黑色素合成率、實時熒光定量PCR法測定酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相關蛋白1(TRP-1)、酪氨酸相關蛋白2(TRP-2)的基因相對表達量,以進一步研究圣草酚對黑色素合成的影響。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

HaCaT細胞、B16細胞,中國科學院上海細胞庫;DMEM完全培養(yǎng)基,美國BI公司;MEM完全培養(yǎng)基,武漢普諾賽生命科技有限公司。

圣草酚(純度≥98%,色譜純)、MTT試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、DEPC水,索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清、雙抗/青鏈霉素合劑、胰蛋白酶、PBS緩沖液,美國BI公司;DMSO、L-DOPA,美國Sigma公司;Trizol Reagent,美國Ambion公司;氫氧化鈉、三氯甲烷、異丙醇,分析純,成都科隆化工有限公司;cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,日本Takara公司。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;BDS400型倒置顯微鏡,重慶奧特光學儀器有限責任公司;MCO-20AIC型細胞培養(yǎng)箱,日本SANYO;液氮生物容器,成都液氮容器廠;L-550型臺式低速離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;Fresco21型超低溫高速離心機、1530型酶標儀,芬蘭Thermo;BCD-215KS型-20 ℃冰箱,海爾;MDF-U880V型-80 ℃冰箱、SIM-F140BDL型制冰機,日本Panasonic;TC20型細胞計數(shù)儀,美國Bio-Red;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;MK2000-2型干式恒溫器、Nano-400A型超微量核酸分析儀,杭州奧盛儀器有限公司;FQD-96C型熒光定量PCR儀,杭州博日科技股份有限公司;無核酶槍尖、無核酶EP管、無核酶八連管,上海科進生物技術有限公司;細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板、凍存管,無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

從液氮生物容器中取出HaCaT細胞和B16細胞,立即置于37 ℃水浴鍋中溶解,去除凍存液后,將HaCaT細胞接種于含有15%胎牛血清和1%雙抗的MEM完全培養(yǎng)基,將B16細胞接種于含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基;置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用倒置顯微鏡觀察生長情況并定期更換新鮮的完全培養(yǎng)基;待貼壁細胞密度達到85%～90%時傳代,選擇對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 共培養(yǎng)體系的建立

按2∶1比例混合接種HaCaT細胞和B16細胞建立共培養(yǎng)體系[7-8]。取對數(shù)生長期的HaCaT細胞,用胰蛋白酶消化10 min,接種至直徑10 cm的細胞培養(yǎng)皿中,使HaCaT細胞數(shù)量為6×105個,置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使細胞貼壁;取對數(shù)生長期的B16細胞,用胰蛋白酶消化1～2 min,接種至上述HaCaT細胞貼壁生長的培養(yǎng)皿中,使B16細胞數(shù)量為3×105個,置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)使細胞貼壁。

1.4 細胞增殖率的測定

在共培養(yǎng)體系中,實驗組用完全培養(yǎng)基配制的濃度(μmol·L-1)分別為1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100的圣草酚干預,對照組(HaCaT細胞與B16細胞共培養(yǎng)體系)和空白組(不含細胞,只含相同體積的培養(yǎng)基)不加藥,每組設置4個復孔;干預24 h后去除舊液,用PBS緩沖液清洗,每孔加入100 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)于37 ℃避光培養(yǎng)4 h;棄上清液,每孔加入100 μL DMSO溶液振蕩10 min,使甲瓚完全溶解,用酶標儀測定490 nm處吸光度。按式(1)計算細胞增殖率(%):

(1)

1.5 細胞酪氨酸酶激活率的測定

在6孔板中建立共培養(yǎng)體系,實驗組用濃度(μmol·L-1)分別為6.25、12.5、25、50的圣草酚干預,空白對照組(HaCaT細胞與B16細胞共培養(yǎng)體系)不加藥,陽性對照組用50 μmol·L-1的8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)干預,陰性對照組用50 μmol·L-1的VC干預,每組設3個復孔;干預48 h后[9-10],收集樣品,冰上操作吸棄培養(yǎng)基,用PBS緩沖液清洗2次,每孔加入100 μL RIPA裂解液,-80 ℃裂解30 min;在4 ℃溶解后,于4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min;取上清液10 μL用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度;取上清液90 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中,加入10 μL L-DOPA(10 mmol·L-1),于37 ℃孵育至淺棕褐色出現(xiàn),迅速測定490 nm處吸光度。按式(2)計算酪氨酸酶含量,按式(3)計算酪氨酸酶激活率(%):

(2)

(3)

1.6 細胞黑色素合成率的測定

采用氫氧化鈉裂解法測定細胞黑色素合成率。按1.5方法分組,干預48 h后,收集樣品,冰上操作[11]吸棄培養(yǎng)基,用PBS緩沖液清洗2次,每孔加入100 μL RIPA裂解液;冰上裂解后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,4 ℃混勻40 min,于4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min;用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中蛋白濃度;沉淀中加入190 μL NaOH裂解液(4%NaOH,10%DMSO),80 ℃水浴1 h使黑色素溶解,上下顛倒數(shù)次,取150 μL測定405 nm處吸光度。按式(4)計算黑色素含量,按式(5)計算黑色素合成率(%):

(4)

(5)

1.7 TYR、TRP-1、TRP-2的基因相對表達量測定

采用實時熒光定量PCR法測定TYR、TRP-1、TRP-2的基因相對表達量。采用Trizol法提取細胞總RNA,用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(perfect real time)試劑盒進行cDNA的合成,操作均嚴格按說明書進行;用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行實時熒光定量PCR分析,檢測相關mRNA的表達。以GAPDH作為內(nèi)參對照,用2-ΔΔCt方法計算并進行數(shù)據(jù)分析,所有引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗至少重復3次,結果以平均值±標準誤差表示。用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)。組間差異:P<0.05為差異顯著;P<0.01為差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞增殖的影響(圖1)

圖1 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞增殖的影響(100×)Fig.1 Effect of eriodictyol on cell proliferation in co-culture system(100×)

由圖1可見,與對照組比較,1.563～100 μmol·L-1圣草酚干預組的細胞數(shù)量增加,共培養(yǎng)體系中HaCaT細胞與B16細胞相互連接,B16細胞樹突變長。

采用MTT法測定共培養(yǎng)體系中細胞增殖率,結果如圖2所示。

注:與對照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.0001;其它圖同。圖2 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞增殖率的影響Fig.2 Effect of eriodictyol on proliferation rate of cells in co-culture system

由圖2可見,圣草酚在低濃度下對共培養(yǎng)體系中的細胞無毒性作用,而且有明顯的促增殖作用;在圣草酚濃度為6.25 μmol·L-1時,細胞增殖率達到最高,為147.13%,與對照組比較,細胞增殖率極顯著提高(P<0.001);在圣草酚濃度為100 μmol·L-1時,細胞增殖率為29.71%,對細胞毒性最大(P<0.0001);經(jīng)計算,圣草酚半抑制濃度(IC50)為62.635 μmol·L-1。因此,選取濃度為6.25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1的圣草酚進行后續(xù)實驗。

2.2 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶活性的影響(圖3)

圖3 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶激活率的影響Fig.3 Effect of eriodictyol on tyrosinase activation rate of cells in co-culture system

由圖3可見,與空白對照組比較,12.5～50 μmol·L-1圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶活性有激活作用(P<0.001),并呈劑量依賴性。在圣草酚濃度為12.5 μmol·L-1時,酪氨酸酶激活率為132.31%;濃度為25 μmol·L-1時,酪氨酸酶激活率為135.21%;濃度為50 μmol·L-1時,酪氨酸酶激活率為183.47%。陽性對照8-MOP的濃度為50 μmol·L-1時,酪氨酸酶激活率為137.62%。總體而言,圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶活性的激活作用優(yōu)于8-MOP。

2.3 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞黑色素含量的影響(圖4)

圖4 圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞黑色素合成率的影響Fig.4 Effect of eriodictyol on melanin synthesis rate of cells in co-culture system

由圖4可見,與空白對照組比較,12.5～50 μmol·L-1圣草酚能顯著提高細胞黑色素合成率(P<0.01或P<0.0001)。在圣草酚濃度為25 μmol·L-1時,黑色素合成率為258.92%,促黑色素合成作用最強(P<0.0001);陽性對照8-MOP的濃度為50 μmol·L-1時,黑色素合成率為204.08%?？傮w而言,圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞的促黑色素合成作用優(yōu)于8-MOP。

2.4 圣草酚對共培養(yǎng)體系中TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達的影響(圖5)

圖5 圣草酚對共培養(yǎng)體系中TYR(a)、TRP-1(b)、TRP-2(c)基因相對表達量的影響Fig.5 Effect of eriodictyol on relative gene expression level of TYR(a),TRP-1(b),and TRP-2(c) in co-culture system

由圖5可見,圣草酚能促進TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達,其中TYR、TRP-1的基因相對表達量呈劑量依賴性增加。與空白對照組比較,12.5～50 μmol· L-1圣草酚能顯著提高共培養(yǎng)體系中TYR的基因相對表達量(P<0.01或P<0.001),25～50 μmol·L-1圣草酚能顯著提高TRP-1、TRP-2的基因相對表達量(P<0.01)。

2.5 討論

黑色素生成減少及黑色素細胞破壞被認為是白癜風發(fā)生的主要原因,黑色素在黑色素細胞內(nèi)合成,傳遞到鄰近的HaCaT細胞,并隨HaCaT細胞轉(zhuǎn)移至表皮層,影響皮膚顏色[12-14]。TYR是一種多亞基含銅氧化還原酶,具有獨特的雙重催化功能,是生物體內(nèi)黑色素合成的關鍵酶,TYP活性降低會導致黑色素合成反應十分緩慢。酪氨酸家族基因TRP-1、TRP-2負責色素沉著的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[15]。

驅(qū)蟲斑鳩菊是治療白癜風的特色藥物[16]。20世紀70年代,驅(qū)蟲斑鳩菊針劑就被用于治療白癜風,并證明有促進復色的作用[17-19]。驅(qū)蟲斑鳩菊植物中治療白癜風的有效成分主要為黃酮類和咖啡酸類等化合物[20-21],其中黃酮類化合物是研究重點。圣草酚是驅(qū)蟲斑鳩菊黃酮類化合物。本研究通過考察不同濃度圣草酚作用于HaCaT細胞和B16細胞共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)低濃度圣草酚可明顯促進共培養(yǎng)體系中細胞增殖、酪氨酸酶活性提升、黑色素合成,并顯著提高TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達量。

HaCaT細胞和B16細胞共培養(yǎng)體系能較好地模擬表皮微環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)圣草酚可能通過提高TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達來促進共培養(yǎng)體系中細胞的酪氨酸酶活性提升和黑色素合成,為開發(fā)治療白癜風的新型藥物提供了一定的科學依據(jù)。調(diào)節(jié)TYR、TRP-1、TRP-2的基因表達以及影響HaCaT細胞和B16細胞之間的相互作用,可能是圣草酚治療白癜風的作用機制之一,但圣草酚促進共培養(yǎng)體系中細胞黑色素合成是通過哪些細胞內(nèi)信號通路進行調(diào)節(jié)、HaCaT細胞在白癜風發(fā)生發(fā)展中如何發(fā)揮作用、有哪些外泌體以及相關成分參與、是否能促進黑色素小體的轉(zhuǎn)運、分泌哪些細胞因子等問題尚不明確,需要進一步研究。

3 結論

建立了HaCaT細胞與B16細胞體外共培養(yǎng)體系模擬“表皮黑色素形成單位”,分別用不同濃度圣草酚干預共培養(yǎng)體系,發(fā)現(xiàn)圣草酚在低濃度下對共培養(yǎng)體系中的細胞無毒性作用,而且有明顯的促增殖作用;12.5～50 μmol·L-1圣草酚對共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶活性有激活作用(P<0.001),并呈劑量依賴性;12.5～50 μmol·L-1圣草酚能顯著提高共培養(yǎng)體系中細胞黑色素合成率(P<0.01或P<0.0001);12.5～50 μmol·L-1圣草酚能顯著提高共培養(yǎng)體系中TYR的基因相對表達量(P<0.01或P<0.001),25～50 μmol·L-1圣草酚能顯著提高共培養(yǎng)體系中TRP-1、TRP-2的基因相對表達量(P<0.01)。圣草酚可能通過促進TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA表達來促進共培養(yǎng)體系中細胞酪氨酸酶活性提升和黑色素合成。