李鈺宇,郭雨悅,王雪梅,王卓靈,蘇夏雨,劉冰欣,韓繼明*,楊 夢(mèng),岳昌武*

(1.巴中市中醫(yī)院,四川 巴中 636000;2.延安大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 延安 716000;3.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610500)

濫用抗生素導(dǎo)致耐藥菌感染成為人類第3大死亡原因,也給后抗生素時(shí)代新抗生素開(kāi)發(fā)帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[1]。現(xiàn)階段抗生素的開(kāi)發(fā)需要在全新的策略指引下,綜合運(yùn)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)、組合生物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)以及各種現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)有目的地開(kāi)發(fā)重點(diǎn)菌株,才能有效提高新抗生素發(fā)現(xiàn)效率,避免低水平重復(fù)發(fā)現(xiàn)[2]。鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2是從貴州梵凈山土壤中分離的一株具有極大新型活性產(chǎn)物挖掘潛力的菌株,在該菌株中已先后發(fā)現(xiàn)了Zunyimycin A～C系列抗生素[3-4]、米爾貝霉素系列衍生物[5]、UK-78623[6]等多種活性產(chǎn)物?；蚪M分析表明, 鏈霉菌FJS31-2基因組中包含7類共計(jì)約23個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇,其中3個(gè)萜類基因簇、3個(gè)鐵離子載體類基因簇、2個(gè)Ⅱ型聚酮類基因簇、4個(gè)NRPS類基因簇、7個(gè)Ⅰ型聚酮類基因簇、3個(gè)羊毛硫抗菌肽類基因簇、1個(gè)ectoine基因簇,具有很大的挖掘潛力[7]。

作者通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化[8]、核糖體工程[9]對(duì)鏈霉菌FJS31-2外分泌物產(chǎn)生條件進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)其主要活性產(chǎn)物的成分進(jìn)行初步分析,并對(duì)其抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性進(jìn)行分析,以期為鏈霉菌活性產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)積累。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與試劑

鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2,從貴州梵凈山20 cm深地表土壤中分離得到,保存于中國(guó)普通菌種保存中心(菌保號(hào):CGMCC 4.7321)。

萃取用試劑乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇等均為分析純,成都科龍公司;抗生素,北京索萊寶公司;實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)品,西格瑪-奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;色譜用試劑,德國(guó)默克(Merck)集團(tuán);培養(yǎng)基,碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。

1.2 外分泌物產(chǎn)生條件優(yōu)化

1.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

在確定培養(yǎng)基種類后,通過(guò)調(diào)整碳源、氮源的組成和比例設(shè)計(jì)7種發(fā)酵培養(yǎng)基(表1),分別在培養(yǎng)7 d、14 d后觀察菌落形態(tài)、顏色及外分泌物積累情況,采用高效液相色譜法測(cè)定外分泌物產(chǎn)量,以確定鏈霉菌FJS31-2產(chǎn)生外分泌物的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表1 7種發(fā)酵培養(yǎng)基組成/(g·L-1)Tab.1 Components of 7 fermentation media/(g·L-1)

1.2.2 核糖體工程

核糖體工程激活活性產(chǎn)物生物合成。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察鏈霉菌FJS31-2對(duì)不同抗生素(鏈霉素、卡那霉素、利福平、慶大霉素,終濃度分別為5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1)的耐受量,最后選擇鏈霉素制備抗生素平板。在確定的最優(yōu)培養(yǎng)基中加入不同濃度(2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1)的鏈霉素,以優(yōu)化出可篩選出核糖體突變的亞致死量的最合適的鏈霉素濃度,劃線接種鏈霉菌FJS31-2,28 ℃靜置培養(yǎng),挑取在亞致死量抗生素平板上存活的單菌落(可能是核糖體突變的菌落),繼續(xù)在含合適濃度抗生素的培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng),繼代3代后大規(guī)模接種,28 ℃靜置培養(yǎng),分別在培養(yǎng)4 d、10 d時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)及外分泌物產(chǎn)生情況。每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

1.3 外分泌物發(fā)酵及純化

待菌落發(fā)酵后,在固體培養(yǎng)基中加入等量乙酸乙酯,抽提3次,旋蒸后得到固體浸膏,加入甲醇或丙酮并與硅膠粉混勻,使溶劑揮發(fā)呈細(xì)沙狀。濕法裝柱,二氯甲烷-丙酮(體積比10∶1)洗脫。外分泌物過(guò)Sephadex LHS20(MeOH)柱(內(nèi)徑2.5 cm,長(zhǎng)75 cm),甲醇洗脫。RP-HPLC(XBridge BEH C18 Prep column,130 ?,10 mm×250 mm,5 μm)純化,在純度達(dá)到98%時(shí),旋蒸,甲醇重溶。通過(guò)MS(Thermo-Finnigan LCQ DECA XP)和NMR(Bruker AV 600 MHz)對(duì)外分泌物進(jìn)行分析。

1.4 外分泌物抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性分析

收集鏈霉菌FJS31-2外分泌物,于冷凍干燥機(jī)中凍干,稱重,將凍干物溶于超純水中配制成2 mg·mL-1的母液,備用。然后將肝癌細(xì)胞MHCC97H以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度時(shí),分別加入終濃度為32 μg·mL-1和50 μg·mL-1的外分泌物,并以50 μg·mL-1的順鉑(cisplatin)為陽(yáng)性對(duì)照,分別于6 h、12 h、18 h、48 h、72 h、91 h測(cè)定細(xì)胞活性,考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外分泌物抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性的影響,確定最適的培養(yǎng)時(shí)間。

將肝癌細(xì)胞MHCC97H以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度時(shí)加入外分泌物,使終濃度分別為400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,在培養(yǎng)72 h時(shí)中止培養(yǎng),用顯微鏡觀察肝癌細(xì)胞MHCC97H形態(tài)及數(shù)量并拍照,采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法檢測(cè)細(xì)胞活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基對(duì)外分泌物的影響

鏈霉菌FJS31-2在7種培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)7 d、14 d后的菌落形態(tài)、顏色及外分泌物積累情況如圖1所示。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響Fig.1 Effect of different media on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由圖1可知,培養(yǎng)7 d,6#、7#培養(yǎng)基上的菌落顏色較1#～5#培養(yǎng)基上的明顯變黃(培養(yǎng)皿中黑點(diǎn)表示黃色或黃褐色菌落),同時(shí)菌落上開(kāi)始有少量淡黃色外分泌物出現(xiàn);培養(yǎng)14 d,6#、7#培養(yǎng)基上的菌落顏色變成明顯的黃褐色,同時(shí)菌落上開(kāi)始有大量的黃褐色外分泌物出現(xiàn),而2#～5#培養(yǎng)基上的菌落顏色沒(méi)有明顯變化,同時(shí)也未見(jiàn)外分泌物產(chǎn)生,1#培養(yǎng)基上的菌落開(kāi)始部分變黃,同時(shí)有少量淡黃色外分泌物出現(xiàn)。表明,6#、7#培養(yǎng)基可促進(jìn)鏈霉菌FJS31-2外分泌物的產(chǎn)生。

2.2 鏈霉素對(duì)外分泌物的影響

選擇7#培養(yǎng)基,分別添加2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1鏈霉素,分別培養(yǎng)4 d、10 d,考察鏈霉素對(duì)鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同濃度鏈霉素對(duì)鏈霉菌FJS31-2外分泌物的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Streptomycin on extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

由圖2可知,在不同濃度鏈霉素的脅迫下,鏈霉菌FJS31-2外分泌物的生成情況不一樣;在2 μg·mL-1鏈霉素的脅迫下,鏈霉菌FJS31-2菌落數(shù)量最多,且培養(yǎng)4 d就開(kāi)始有少量的淡黃色外分泌物出現(xiàn),培養(yǎng)10 d有大量的黃褐色外分泌物出現(xiàn)。表明,2 μg·mL-1鏈霉素脅迫可促進(jìn)鏈霉菌FJS31-2外分泌物的產(chǎn)生。

2.3 外分泌物的主要成分

將收集的鏈霉菌FJS31-2外分泌物用乙酸乙酯萃取,進(jìn)行高分辨質(zhì)譜(HRMS)分析(圖3),發(fā)現(xiàn)鏈霉菌FJS31-2外分泌物主要活性產(chǎn)物含有4種結(jié)構(gòu)類似物,初步推斷其譜學(xué)特征符合四環(huán)萜類化合物,分子式為C28H40O2。

圖3 鏈霉菌FJS31-2外分泌物主要活性產(chǎn)物的HRMS圖譜Fig.3 HRMS spectrum of main active products in extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2

2.4 外分泌物的抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性

將鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細(xì)胞MHCC97H共培養(yǎng)不同時(shí)間后,測(cè)定細(xì)胞活性,結(jié)果如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)外分泌物抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性的影響Fig.4 Effect of culture time on inhibition activity of extracellular secretion to hepatoma cell line MHCC97H

由圖4可知,外分泌物對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H的抑制率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,72 h后繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間,抑制率變化不大。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)72 h后中止培養(yǎng)。

將鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細(xì)胞MHCC97H共培養(yǎng),外分泌物終濃度分別為400 μg·mL-1、200 μg·mL-1、100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1,培養(yǎng)72 h后中止培養(yǎng),其顯微鏡照片如圖5所示,鏈霉菌FJS31-2外分泌物對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H的抑制率如圖6所示。

圖5 鏈霉菌FJS31-2外分泌物與肝癌細(xì)胞MHCC97H共培養(yǎng)72 h后的顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Microscopic photos of extracellular secretion from Streptomyces sp.FJS31-2 co-cultured with hepatoma cell line MHCC97H for 72 h

由圖5、6可知,不同濃度的鏈霉菌FJS31-2外分泌物均能抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的生長(zhǎng),且大致呈濃度依賴性,200 μg·mL-1外分泌物對(duì)肝癌細(xì)胞MHCC97H的抑制率達(dá)到了84%(圖6)。

2.5 討論

通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化、核糖體工程對(duì)潛力菌株鏈霉菌FJS31-2的外分泌物進(jìn)行了挖掘,盡管在其中發(fā)現(xiàn)了可能是新型結(jié)構(gòu)的分子式為C28H40O2的四環(huán)萜類化合物,但由于產(chǎn)物產(chǎn)量較低、化合物結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,其結(jié)構(gòu)的確定尚未完成;該化合物生物合成激活機(jī)制也有待進(jìn)一步闡明;化合物雖然表現(xiàn)出抗肝癌細(xì)胞MHCC97H活性,但其它生物活性和作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

利用培養(yǎng)基優(yōu)化、核糖體工程對(duì)鏈霉菌FJS31-2外分泌物進(jìn)行了挖掘,并通過(guò)HRMS技術(shù)初步獲得了分子式為C28H40O2的四環(huán)萜類化合物,該化合物可抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H的生長(zhǎng),并呈濃度依賴性。為從鏈霉菌FJS31-2中獲取新型抗生素奠定了基礎(chǔ)。