孫增紅,張 莎,王麗娃,宮海燕,田樹革*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830017;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院,廣東 東莞 523710)

齲齒是人類最常見的感染病,其發(fā)生發(fā)展與某些慢性系統(tǒng)性疾病有關(guān),如肥胖癥、糖尿病、心血管疾病等。齲齒是細(xì)菌在牙齒表面形成生物膜(牙菌斑)、通過碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸而引起的,可進(jìn)一步溶解牙齒硬組織,最終導(dǎo)致牙齒潰爛。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是一種主要的致齲細(xì)菌[1],通過產(chǎn)生糖基轉(zhuǎn)移酶合成不溶性胞外多糖,糖基轉(zhuǎn)移酶黏附在牙齒表面形成細(xì)菌生物膜。臨床治療齲齒的傳統(tǒng)方法多采用氟化物和抗生素,雖然有一定療效,但長期使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性,并產(chǎn)生其它藥物毒副反應(yīng)。研究表明,口腔組織中含有的大量自由基也會(huì)增加牙周病和齲齒的患病幾率,對(duì)傷口的愈合也會(huì)造成影響,而天然化合物即外源性抗氧化劑可以抑制細(xì)菌代謝活動(dòng),保護(hù)菌斑菌群免受口腔惡劣環(huán)境的影響[2],且具有廣泛的藥理作用和良好的生物相容性,可以作為抗菌藥物的重要來源應(yīng)用于口腔抗菌領(lǐng)域[3-4]。

黃蜀葵花是錦葵科秋葵屬草本植物黃蜀葵[Abelmoschicorolla(L.) Medik.]的花,具有消腫解毒、清熱清濕等功效[5],民間應(yīng)用歷史悠久。黃蜀葵花提取物(Abelmoschicorollaextracts,ACE)作為原材料或中間體被廣泛應(yīng)用于化妝品、藥物和保健食品等領(lǐng)域[6]。黃酮類和多酚類化合物是重要的植物次生代謝物,具有抗氧化活性,兩者的含量成為植物抗氧化能力的重要指標(biāo)之一,其中,多酚類化合物是通過直接清除活性氧(ROS)、金屬螯合、再生體內(nèi)高效抗氧化劑等來發(fā)揮抗氧化活性,羥基是其最主要的清除自由基的化學(xué)基團(tuán)[7];而黃酮類化合物因?yàn)楹蟹恿u基能與自由基發(fā)生反應(yīng),即失去或得到氫后生成較穩(wěn)定的半醌式自由基,使得自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得以終止,從而發(fā)揮抗氧化活性[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃蜀葵花主要含有黃酮類和多酚類化合物,如金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素等,它們均具有抑菌、抗氧化等作用[9-11]。但有關(guān)黃蜀葵花對(duì)S.mutans的抑制作用的報(bào)道較少,因此,作者通過測定ACE中總黃酮和總多酚的含量,探討其對(duì)S.mutans的抑制作用和抗氧化活性,為其進(jìn)一步應(yīng)用于口腔抗菌領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

黃蜀葵花(Abelmoschicorolla):選取安徽(亳州市源升堂藥業(yè)有限公司)、河北(安國市藥源商貿(mào)有限公司)、陜西(樺甸市山緣參茸有限公司)3個(gè)產(chǎn)地,均為干品,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室徐海燕教授鑒定為錦葵科秋葵屬草本植物黃蜀葵[Abelmoschicorolla(L.) Medik.]的花;變異鏈球菌(S.mutans,ATCC 76100),新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

瓊脂粉、腦心浸出液(BHI)、2,2-聯(lián)氮-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),分析純,北京索萊寶科技有限公司;金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)HR18604B1),純度≥98%,寶雞辰光生物科技有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)100050-200707),純度≥98%,中國藥品生物制品檢定所;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)MUST-11122813,純度≥98%)、福林酚試劑(分析純),成都科龍化工試劑廠;維生素C(VC),分析純,天津精細(xì)化工開發(fā)中心。

ME204E型電子天平,梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司;KQ3200DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;SW-GJ-2FD型超凈工作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀,美國Thermo Scientific公司;150 mm游標(biāo)卡尺,上海錫豐標(biāo)準(zhǔn)件有限公司。

1.2 ACE的制備

將干燥黃蜀葵花粉碎,過50目篩;稱取1.0 g,按料液比1∶50(g∶mL)加入70%乙醇,90 ℃恒溫水浴回流提取0.5 h;過濾,即得ACE樣品溶液(若未標(biāo)注產(chǎn)地,均為安徽ACE)。

同法將濾液蒸干至浸膏狀,即得ACE干浸膏,供抑菌實(shí)驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)用。

1.3 菌懸液的制備

將保存于-80 ℃冰箱的S.mutans菌株用BHI液體培養(yǎng)基稀釋,并在5%CO2、37 ℃厭氧條件下復(fù)蘇48 h,采用平板劃線法將其接種到BHI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時(shí)間,計(jì)數(shù),用BHI培養(yǎng)液稀釋成菌濃為1×108CFU·mL-1的菌懸液。使用時(shí)按需調(diào)整菌濃。

1.4 總黃酮含量的測定

參照文獻(xiàn)[12],以金絲桃苷為對(duì)照品,采用紫外分光光度法測定ACE中總黃酮含量。精確稱取8.11 mg金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,得0.081 1 mg·mL-1金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液;再依次精密量取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL至25 mL容量瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,靜置15 min,以不加金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白組,測定360 nm處吸光度。以濃度(x,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取ACE樣品溶液,加入70%乙醇稀釋1倍后,精密量取1 mL至25 mL容量瓶中,按上述方法靜置15 min后測定360 nm處吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

1.5 總多酚含量的測定

參照文獻(xiàn)[13],以沒食子酸為對(duì)照品,采用福林酚法測定ACE中總多酚含量。精確稱取25.0 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品置于250 mL容量瓶中,加水至刻度,得0.1 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液;再依次精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL、1.50 mL至10 mL容量瓶中,加入福林酚試劑1 mL和10%Na2CO3溶液2 mL,加水定容至刻度,搖勻,室溫下避光反應(yīng)1 h,以不加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為空白組,測定765 nm處吸光度。以濃度(x,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密量取ACE樣品溶液1 mL至50 mL容量瓶中,按上述方法測定765 nm處吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算總多酚含量。

1.6 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.6.1 抑菌圈的測定

采用瓊脂打孔法測定不同產(chǎn)地、不同濃度ACE的抑菌圈直徑[14]。制備50 mg·mL-1的不同產(chǎn)地ACE水溶液,無菌濾過后,用兩倍稀釋法將ACE水溶液稀釋成25 mg·mL-1和12.5 mg·mL-1的樣品溶液。用移液槍吸取100 μL濃度為1×106CFU·mL-1的菌懸液至BHI固體培養(yǎng)基上,用無菌涂菌棒涂勻,晾干,用打孔器在BHI固體培養(yǎng)基上打5個(gè)直徑為6 mm的孔,孔中分別加入40 μL的樣品溶液、復(fù)方氯己定溶液(陽性對(duì)照)、無菌水(陰性對(duì)照),于5%CO2、37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,使用毫米游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,重復(fù)3次,取平均值。

1.6.2 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

采用微量稀釋法測定ACE對(duì)S.mutans的MIC和MBC[15]。制備50 mg·mL-1的ACE水溶液,無菌濾過后,用無菌超純水將ACE水溶液稀釋成50～1 mg·mL-1梯度濃度。將100 μL(1×107CFU·mL-1)菌懸液與100 μL梯度濃度安徽ACE水溶液/無菌水(空白對(duì)照)加至96孔板中,混勻,于5%CO2、37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,每組設(shè)置3個(gè)平行;24 h后取出,觀察并記錄孔內(nèi)無細(xì)菌生長時(shí)的ACE最低濃度,即為MIC。然后用無菌移液槍移取適量96孔板中濃度≥MIC的菌懸液,接種至新的BHI固體培養(yǎng)基上,于5%CO2、37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,記錄BHI固體培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長時(shí)的ACE最低濃度,即為MBC。

1.6.3 ACE對(duì)S.mutans生長的影響

在無菌96孔板中分別加入100 μL(1×107CFU·mL-1)菌懸液與100 μL含有不同濃度(2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC)ACE的BHI液體培養(yǎng)基,以未加ACE為空白對(duì)照,每組設(shè)置3個(gè)平行,于5%CO2、37 ℃厭氧培養(yǎng),分別于0 h、2 h、4 h、6 h、9 h、12 h、26 h、30 h、36 h時(shí)測定OD600值?？紤]到ACE溶液本身顏色對(duì)結(jié)果的影響,以不同時(shí)期混合液的△OD600值作為評(píng)價(jià)指標(biāo),繪制S.mutans的生長曲線[16]。

1.7 抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.7.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

配制50 mg·mL-1的DPPH溶液;以無水乙醇為溶劑配制10 mg·mL-1的ACE母液,然后稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01的樣品溶液。參照文獻(xiàn)[17],設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)組,于室溫避光反應(yīng)30 min,測定520 nm處吸光度,平行測定3次。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率:

(1)

式中:A2為實(shí)驗(yàn)組,150 μL DPPH溶液+50 μL樣品溶液的吸光度;A1為對(duì)照組,150 μL無水乙醇+50 μL樣品溶液的吸光度;A0為標(biāo)準(zhǔn)組,150 μL DPPH溶液+50 μL無水乙醇的吸光度。

同法測定VC、金絲桃苷和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.7.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)

避光稱取96.05 mg ABTS粉末和16.56 mg K2S2O8,分別置于2個(gè)25 mL容量瓶中,加超純水至刻度,按體積比1∶1混合,制備ABTS自由基母液,于4 ℃冷藏14～16 h,備用;使用前,用無水乙醇將其稀釋至吸光度在0.70±0.02范圍內(nèi)。以無水乙醇為溶劑,將10 mg·mL-1的ACE母液稀釋成濃度(mg·mL-1)分別為0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01的樣品溶液。參照文獻(xiàn)[18],設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)組,避光反應(yīng)30 min后,測定734 nm處吸光度,平行測定3次。按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率:

(2)

式中:A2為實(shí)驗(yàn)組,150 μL ABTS溶液+50 μL樣品溶液的吸光度;A1為對(duì)照組,150 μL無水乙醇+50 μL樣品溶液的吸光度;A0為標(biāo)準(zhǔn)組,150 μL ABTS溶液+50 μL無水乙醇的吸光度。

同法測定VC、金絲桃苷和蘆丁對(duì)ABTS自由基的清除率。

1.7.3 FRAP法測定總抗氧化能力

參照文獻(xiàn)[19],采用鐵離子還原/抗氧化能力分析(FRAP)法測定ACE的總抗氧化能力。以無水乙醇為溶劑,分別制備ACE、VC、金絲桃苷和蘆丁母液,濃度均為10 mg·mL-1,然后將上述母液稀釋成不同濃度樣品溶液;將180 μL的FRAP工作液與20 μL不同濃度樣品溶液輕輕混合,靜置5 min,測定593 nm處吸光度(x),平行測定3次。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品溶液替代樣品溶液與FRAP工作液反應(yīng),繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線,用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(y)表示FRAP值,依據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.6323x-0.0291(R2=0.9996)分別計(jì)算ACE、VC、金絲桃苷和蘆丁的FRAP值。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 ACE中總黃酮、總多酚的含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別按1.4、1.5方法繪制金絲桃苷和沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合得線性回歸方程為:金絲桃苷y=29.382x+0.0437(R2=0.9991);沒食子酸y=87.029x-0.004(R2=0.9978)。

可以看出,金絲桃苷濃度在3.24～19.46 μg·mL-1范圍、沒食子酸濃度在2.50～15.00 μg·mL-1范圍與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 方法學(xué)考察

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):精密量取金絲桃苷和沒食子酸對(duì)照品溶液1.0 mL,分別按1.4、1.5方法,在0 min、20 min、40 min、60 min、80 min測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。結(jié)果顯示,金絲桃苷和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在80 min內(nèi)均穩(wěn)定,其RSD值分別為0.318%和1.040%。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精密稱取6份1.0 g的ACE粉末(過50目篩),分別按1.4、1.5方法測定ACE中的總黃酮和總多酚含量,其RSD值分別為0.532%和1.448%,表明2種測定方法的重復(fù)性均良好。

精密度實(shí)驗(yàn):精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品8.11 mg,置于10 mL容量瓶中,加入適量50%甲醇,超聲溶解,再加入50%甲醇至刻度,混勻;精密量取2 mL置于25 mL容量瓶中,加入50%甲醇定容,混勻;然后精密吸取6份上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各4.0 mL,分別置于25 mL容量瓶中,用50%甲醇定容,混勻,按1.4方法測定360 nm處吸光度,RSD值為0.868%;同一標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定5次,RSD值為0.426%,表明該方法精密度良好。精密量取6份0.1 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL,按1.5方法測定765 nm處吸光度,RSD值為0.220%,同一標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定5次,RSD值為0.553%,表明該方法精密度良好。

加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn):取已知含量的黃蜀葵花粉末,平行精密稱取6份,分別加入金絲桃苷和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,按1.4、1.5方法測定總黃酮和總多酚含量,計(jì)算得到加標(biāo)回收率分別為98.53%和101.46%,RSD值分別為1.13%和2.43%(表1)。

表1 加標(biāo)回收率測定結(jié)果(n=6)Tab.1 Determination results of recovery(n=6)

2.1.3 樣品測定

按1.2方法制備安徽、陜西和河北等3個(gè)產(chǎn)地ACE樣品溶液,采用比色法測定其中的總黃酮和總多酚含量,結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地ACE中的總黃酮和總多酚含量(n=3)Tab.2 Contents of total flavonoids and total polyphenols in ACE from different origins(n=3)

由表2可知,安徽ACE中的總黃酮含量最高,為(4.68±0.37) mg·g-1,陜西ACE中的總多酚含量最高,為(1.48±0.11) mg·g-1。

2.2 ACE的體外抑菌活性

2.2.1 不同產(chǎn)地ACE對(duì)S.mutans的抑菌圈直徑

以抑菌圈直徑進(jìn)行敏感性判斷:抑菌圈直徑大于20 mm為高敏,10～20 mm為中敏,10 mm以下為不敏感。50 mg·mL-1的不同產(chǎn)地ACE、不同濃度安徽ACE的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,不同產(chǎn)地、不同濃度ACE的抑菌圈直徑見表3。

A.安徽ACE B.陜西ACE C.河北ACE N.陰性對(duì)照 Y.陽性對(duì)照b.50 mg·mL-1安徽ACE c.25 mg·mL-1安徽ACE d.12.5 mg·mL-1安徽ACE圖1 50 mg·mL-1不同產(chǎn)地ACE(a)、不同濃度安徽ACE(b～d)的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Antibacterial experiment results of 50 mg·mL-1 ACE from different origins(a) and Anhui ACE with different concentrations(b-d)

表3 不同產(chǎn)地、不同濃度ACE的抑菌圈直徑/mm(n=3)Tab.3 Diameter of inhibition circle of ACE with different concentrations from different origins/mm(n=3)

由表3可知,當(dāng)3個(gè)產(chǎn)地ACE的濃度為50 mg·mL-1時(shí),其抑菌圈直徑均大于20 mm,達(dá)到高敏,且均接近復(fù)方氯己定陽性對(duì)照組的抑菌圈直徑(P<0.01);當(dāng)濃度為25 mg·mL-1和12.5 mg·mL-1時(shí),ACE對(duì)S.mutans的抑制作用均達(dá)到中敏;隨著濃度的降低,不同產(chǎn)地ACE的抑菌圈直徑均逐漸減小,且呈濃度依賴性;相同濃度下,不同產(chǎn)地ACE的抑菌圈直徑大小依次為:安徽ACE>河北ACE>陜西ACE。

2.2.2 ACE對(duì)S.mutans的MIC和MBC

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ACE濃度大于3 mg·mL-1時(shí),96孔板中的溶液是透明的,可見底部,所以ACE對(duì)S.mutans的MIC為3 mg·mL-1;ACE濃度為 6 mg·mL-1時(shí),BHI固體培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長,因此,確定ACE對(duì)S.mutans的MBC為6 mg·mL-1。

2.2.3 ACE對(duì)S.mutans生長的影響

不同濃度(2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC)ACE對(duì)S.mutans生長的影響如圖2所示。

圖2 ACE對(duì)S.mutans生長的影響Fig.2 Effect of ACE on growth of S.mutans

由圖2可知,不同濃度ACE對(duì)S.mutans的生長均有一定的抑制作用,36 h內(nèi),不同濃度ACE組的生長速率均低于空白對(duì)照組,△OD600值與空白對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。空白對(duì)照組菌體在4 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,12 h后生長速率逐漸減慢;高濃度(2MIC、MIC)ACE對(duì)S.mutans的生長具有明顯的抑制作用,菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期的時(shí)間明顯延后;中濃度(1/2MIC)ACE對(duì)S.mutans生長的抑制作用較高濃度ACE弱;低濃度(1/4MIC)ACE相較于空白對(duì)照組表現(xiàn)出輕微的抑制作用,僅在8 h和36 h有顯著性差異。推測原因可能是,低濃度ACE中的總黃酮和總多酚含量較低,導(dǎo)致其抗氧化活性較低;隨著ACE濃度的增加,其中的總黃酮和總多酚含量相應(yīng)增加,其對(duì)S.mutans的抑制作用隨之增強(qiáng)。表明,ACE對(duì)S.mutans的抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。

2.3 ACE的抗氧化活性

2.3.1 ACE對(duì)DPPH自由基的清除率(圖3)

圖3 ACE對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radicals by ACE

由圖3可知,隨著濃度的增加,ACE對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸升高,在濃度為0.10～0.35 mg·mL-1時(shí),DPPH自由基清除率基本穩(wěn)定在23.96%～33.15%之間,低于VC對(duì)DPPH自由基的清除率(93.61%～95.87%)(P<0.01);在濃度為0.01～0.35 mg·mL-1時(shí),金絲桃苷和蘆丁對(duì)DPPH自由基的清除率均與濃度呈正相關(guān),即隨著濃度的增加,DPPH自由基清除率逐漸升高。

2.3.2 ACE對(duì)ABTS自由基的清除率(圖4)

圖4 ACE對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS free radicals by ACE

由圖4可知,ACE、VC、金絲桃苷、蘆丁對(duì)ABTS自由基的清除率均隨濃度增加逐漸升高,且呈顯著的正相關(guān)。當(dāng)VC和蘆丁濃度分別增至0.10 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1時(shí),ABTS自由基清除率基本穩(wěn)定,說明VC和蘆丁對(duì)ABTS自由基的清除作用達(dá)到飽和;當(dāng)金絲桃苷濃度為0.40 mg·mL-1時(shí),其對(duì)ABTS自由基的清除率為86.10%;而當(dāng)ACE濃度為0.40 mg·mL-1時(shí),其對(duì)ABTS自由基的清除率則達(dá)到了96.50%。表明,ACE對(duì)ABTS自由基具有較好的清除能力。

2.3.3 ACE的總抗氧化能力(圖5)

圖5 ACE的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of ACE

由圖5可知,ACE、VC、金絲桃苷、蘆丁的總抗氧化能力(FRAP值)均隨濃度增加逐漸增強(qiáng),且呈顯著的量效關(guān)系。當(dāng)VC和金絲桃苷濃度分別增至0.15 mg·mL-1和0.25 mg·mL-1時(shí),FRAP值基本保持不變,說明VC和金絲桃苷的總抗氧化能力(FRAP值)達(dá)到飽和;在濃度為0.01～0.35 mg·mL-1時(shí),總抗氧化能力(FRAP值)大小依次為:VC>金絲桃苷>蘆丁>ACE。

3 結(jié)論

天然藥物具有資源豐富、使用相對(duì)安全、藥理作用廣和實(shí)用價(jià)值大等優(yōu)勢,已成為研究者獲取理想防齲藥物的重要資源。以安徽、陜西、河北等地的ACE為研究對(duì)象,分別測定了總黃酮和總多酚的含量,其中,安徽ACE中的總黃酮含量最高,為(4.68±0.37)mg·g-1,陜西ACE中的總多酚含量最高,為(1.48±0.11) mg·g-1。ACE能夠顯著抑制S.mutans的生長,且呈較好的濃度依賴性,最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)分別為3 mg·mL-1和6 mg·mL-1;ACE具有良好的清除DPPH、ABTS等自由基的能力和抗氧化活性,且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。表明,不同產(chǎn)地ACE中的總黃酮和總多酚含量差別較小,ACE具有一定的體外抑菌和抗氧化活性。該研究為ACE應(yīng)用于齲齒預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為ACE作為醫(yī)藥、保健食品和化妝品的原料或中間體提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法除抑菌實(shí)驗(yàn)外,其余實(shí)驗(yàn)均使用了酶標(biāo)儀和微孔板(具有短時(shí)間同時(shí)測定樣本和大幅降低試劑消耗的優(yōu)點(diǎn)),具有快速、微量化和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),但有關(guān)ACE抑制S.mutans的具體機(jī)制和自由基損傷口腔組織的確切機(jī)理仍有待更深入的研究。