李美 樓姣英

宮頸人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的主要病機為濕毒浸淫、結(jié)聚于子門,金哲教授抓住毒邪結(jié)聚這一病機關(guān)鍵,以攻毒散結(jié)為治法,研制出宮頸外用中藥清毒栓。前期課題研究發(fā)現(xiàn)清毒栓含藥血清通過調(diào)控P53基因表達(dá)[1]、調(diào)控P53泛素化降解途徑[2]、下調(diào)MDM2基因[3]、減少B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表達(dá)、增多Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X,Bax)表達(dá)而使人子宮頸鱗癌細(xì)胞(SiHa細(xì)胞)凋亡[4]等分子生物學(xué)機制,達(dá)到抑制腫瘤的目的。本課題體內(nèi)實驗結(jié)果表明,清毒栓可以抑制荷瘤小鼠外周血中Treg細(xì)胞,從而逆轉(zhuǎn)微環(huán)境中的免疫抑制[5]。為了驗證Treg細(xì)胞的改變是否與Zeste同源物增強子2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)調(diào)控的叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead boxP3,Foxp3)表達(dá)變化有關(guān),在前期基礎(chǔ)上,本實驗以jurkat細(xì)胞為研究對象,觀察清毒栓含藥血清對jurkat細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)影響,進一步探索清毒栓提取物治療宮頸HPV感染的免疫學(xué)機制,為該藥臨床應(yīng)用提供更充足的實驗學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細(xì)胞株

SPF級SD大鼠20只,體質(zhì)量280～300 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[京動許字(2000)第004號總049號]。人宮頸癌SiHa細(xì)胞、jurkat細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 實驗藥物

清毒栓(專利號:ZL201010109562.1),主要組成為紫草、莪術(shù)、黃柏等。本科研使用的試藥由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所制作,通過特定工藝制作清毒栓藥液,包括分別醇提紫草、油提莪術(shù)、水煎黃柏等。實驗藥物為中藥飲片提取制成清毒栓藥液,不是清毒栓提純。消毒栓藥液濃度相當(dāng)于中藥飲片4.2 g/mL,高溫消毒后于4℃冰箱密封保存。飲片均購自北京同仁堂藥店。

1.3 主要實驗儀器

超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司,SW-CJ-1FD);離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,HI650);低速離心機(Eppendorf,5702R);PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司,EDC-810);實時熒光定量PCR儀(ABI,7500);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(MD,Spectramac M3);流式細(xì)胞儀(Beckmancoulter,CytoFLEX)等。

1.4 主要實驗試劑

RNeasy MiniKit(Qiagen,74106)試劑盒;RNase-Free DNase Set(Qiagen,79254);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems,4368813);實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Step One Plus Real-Time PCR);Foxp3(1∶2 000,novus,NB100-39002SS);甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體(GAPDH antibody)(1∶2 500,Abcam ab9485);含PMSF(南京沃宏,329-98-6)的裂解液(碧云天公司,P0013B);樣品緩沖液(15 g SDS,15.6 mL 2 M Tris pH 6.8,57.5 g glycerol,16.6 mL b-mercaptoethanol);PVDF膜(Bio-Rad no.162-0177);Foxp3 antibody (1∶1 000,Affinity,BF0630);HRP二抗(1∶4 000;Dianova,Hamburg);ECL顯影液(Bio-Rad,170-5060)。

1.5 含藥血清制備

取SPF級雄性SD大鼠20只,隨機分為空白組和藥物組。分別用PBS磷酸鹽緩沖液和中藥(消毒栓藥液)對兩組大鼠進行灌胃,早晚各一次,每次灌胃劑量為10 mL/kg,連續(xù)灌胃3天。采血前12小時禁食,最后一次給藥后1～2小時采集全部血液(摘眼球取血,無菌操作)。分離含藥血清,于56℃水浴滅活30分鐘,以0.22 μm濾器滅菌消毒,置于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

SiHa細(xì)胞和jurkat細(xì)胞使用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基在37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。視細(xì)胞生長情況用0.25%胰蛋白酶每周傳代2次。當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定并進入對數(shù)生長期時開始用于實驗。

1.7 SiHa細(xì)胞和jurkat細(xì)胞上清液的收集

分別取宮頸SiHa細(xì)胞和jurkat細(xì)胞以107個/mL種植于175 cm3的培養(yǎng)瓶,細(xì)胞培養(yǎng)至融合度達(dá)80%～90%,然后用適量大小的無菌試管收集細(xì)胞上清液,放置于高速離心機中,13 000 r/min離心20分鐘,以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì);最后用10 mL無菌注射器吸取細(xì)胞上清液,并使用一次性針孔過濾器(0.22 μm)以去除上清液中可能含有的細(xì)菌。置于-80℃保存。于使用前1天將其轉(zhuǎn)移至4℃冰箱解凍,解凍的細(xì)胞上清液盡量在1周內(nèi)使用完。

1.8 免疫蛋白印跡法(Western Blot,WB)檢測SiHa細(xì)胞上清液處理對jurkat細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)水平的影響

收獲“1.6”步驟中培養(yǎng)的jurkat細(xì)胞以2.0×103個/孔,每孔200 μL細(xì)胞懸液種植于96孔板中,分為jurkat細(xì)胞上清液組與SiHa細(xì)胞上清液組,每組3個復(fù)孔。另設(shè)3個孔作為空白對照組,孔中均不含jurkat細(xì)胞。放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12小時、24小時、48小時后,棄去培養(yǎng)基,用PBS洗2遍,加入PMSF的裂解液提取蛋白,蛋白裂解液濃度利用Bradford法進行測量。10 μg組織裂解液與5×樣品緩沖液混合后,將樣品上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠中,SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含0.1%Tween的4%牛奶進行封閉后,加入Foxp3、GAPDH抗體,4℃孵育過夜。用含0.1% Tween的PBS溶液將膜洗3遍后,加入含0.1% Tween的4%牛奶以及HRP二抗在室溫條件下孵育2小時,在膜上滴加ECL顯影液并放入GelDoc成像系統(tǒng)進行拍照。實驗重復(fù)3次,蛋白表達(dá)水平用內(nèi)參蛋白GAPDH進行歸一化處理。

1.9 WB法檢測不同濃度含藥血清對jurkat細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)水平的影響

使用SiHa上清液處理jurkat細(xì)胞48小時來構(gòu)建Foxp3高表達(dá)的T細(xì)胞模型。經(jīng)處理的細(xì)胞以2.0×103個/孔,每孔200 μL細(xì)胞懸液種植于96孔板中,分為空白血清組與含藥血清組,每組設(shè)4個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次?？瞻籽褰M分別加入5%、10%、15%、20%空白血清,含藥血清組加入5%、10%、15%、20%含藥血清。采用WB法檢測各組細(xì)胞中的Foxp3蛋白表達(dá)水平,用內(nèi)參蛋白GAPDH進行歸一化處理。

1.10 使用15%的含藥血清進行jurkat細(xì)胞處理和機制探索

1.10.1 qRT-PCR法檢測jurkat細(xì)胞Foxp3轉(zhuǎn)錄水平 使用SiHa上清液處理jurkat細(xì)胞48小時來構(gòu)建Foxp3高表達(dá)的T細(xì)胞模型。實驗分為4組:空白對照組(jurkat細(xì)胞上清液+15%空白血清)、jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組(jurkat細(xì)胞上清液+15%含藥血清)、SiHa細(xì)胞上清液空白血清組(SiHa細(xì)胞上清液+15%空白血清)、SiHa細(xì)胞上清液含藥血清組(SiHa細(xì)胞上清液+15%含藥血清)。棄去培養(yǎng)基,用PBS洗2遍,根據(jù)RNeasy MiniKit試劑盒說明書提取RNA并對DNase進行消化。cDNA合成使用大容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒。按照使用手冊將預(yù)混SYBR Green I染料的樣本用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:Real-time PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定:95℃ 3分鐘,95℃ 30秒,62℃ 40秒,共40個循環(huán)。檢測Foxp3和的mRNA水平以GAPDH為對照,采用2-ΔΔct方法計算測定不同樣品中基因的相對表達(dá)量。Foxp3引物序列:正向引物:5’-CACTGCCCCTAGTCATGGTG-3’,反向引物:5’-GGTGCATGAAATGTGGCCTG-3’;GAPDH引物序列:正向引物:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向引物:5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.10.2 WB法檢測jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)水平 實驗分為4組,分組處理同“1.10.1”。采用WB法檢測jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)水平,用內(nèi)參蛋白GAPDH進行歸一化處理。實驗重復(fù)3次,具體檢測方法同上。

1.10.3 細(xì)胞流式檢測Foxp3細(xì)胞百分比 實驗分為4組,分組處理同“1.10.1”。取處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,消化后計數(shù);每流式小管加入1×106個細(xì)胞;離心(2 000 r/min,2分鐘,4℃)后以含0.5% BSA的PBS清洗2遍;每流式小管添加熒光一抗Foxp3-FITC,4℃孵育30分鐘;離心(2 000 r/min×2分鐘,4℃)后以含0.5% BSA的PBS清洗2遍;以含0.5% BSA的PBS 0.5 mL重懸后流式細(xì)胞儀檢測分析。細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%,每組設(shè)置4個復(fù)孔,實驗重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SiHa細(xì)胞上清液對jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)水平的影響

與jurkat細(xì)胞上清液組和空白對照組相比,SiHa細(xì)胞上清液組細(xì)胞中Foxp3蛋白相對表達(dá)量增加(P<0.05),且處理48小時效果最為顯著,故后續(xù)實驗采取48小時處理時間。見圖1,表1。

表1 處理48小時WB檢測各組jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白相對表達(dá)量比較

注:A為空白對照組;B為jurkat細(xì)胞上清液組;C為SiHa細(xì)胞上清液組。

2.2 不同濃度含藥血清對jurkat細(xì)胞中Foxp3蛋白表達(dá)水平的影響

使用SiHa上清液處理jurkat細(xì)胞48小時來構(gòu)建Foxp3高表達(dá)的T細(xì)胞模型后,分別以5%、10%、15%、20%含藥血清處理及相應(yīng)濃度的空白血清作為對照,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)下調(diào),且在含藥血清濃度為15%和20%時,Foxp3的蛋白表達(dá)量最低,且兩者無明顯差別,故后續(xù)實驗采用15%血清濃度。見圖2。

注:A為5%血清濃度;B為10%血清濃度;C為15%血清濃度;D為20%血清濃度。

2.3 15%含藥血清對jurkat細(xì)胞Foxp3轉(zhuǎn)錄水平的影響

SiHa細(xì)胞上清液空白血清組與空白對照組相比,jurkat細(xì)胞Foxp3的mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與空白對照組相比,jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組細(xì)胞Foxp3的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與SiHa細(xì)胞上清液空白血清組相比,SiHa細(xì)胞上清液含藥血清組細(xì)胞Foxp3的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 15%含藥血清條件下各組jurkat細(xì)胞Foxp3的mRNA表達(dá)情況

2.4 15%含藥血清對jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)水平的影響

SiHa細(xì)胞上清液空白血清組與空白對照組相比,jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與空白對照組相比,jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組細(xì)胞Foxp3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與SiHa細(xì)胞上清液空白血清組相比,SiHa細(xì)胞上清液含藥血清組細(xì)胞Foxp3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表3,圖3。

表3 15%含藥血清條件下各組jurkat細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)情況

注:A為空白對照組;B為jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組;C為SiHa細(xì)胞上清液空白血清組;D為SiHa細(xì)胞上清液含藥血清組。

2.5 15%含藥血清對SiHa細(xì)胞比例的影響

細(xì)胞流式檢測Foxp3陽性細(xì)胞占比30%,jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)較空白對照組顯著下降(P<0.05),SiHa細(xì)胞上清液空白血清組Foxp3陽性細(xì)胞較空白對照組顯著下降(P<0.05),SiHa細(xì)胞上清液含藥血清組Foxp3陽性細(xì)胞較SiHa細(xì)胞上清液空白血清組顯著下降(P<0.05),較jurkat細(xì)胞上清液含藥血清組顯著增加(P<0.05)。見圖4,表4。

表4 15%含藥血清對SiHa細(xì)胞比較的影響

圖4 15%含藥血清對Foxp3細(xì)胞比例的影響

3 討論

HPV感染是最常見的生殖道病毒性感染。宮頸癌是最常見的HPV感染相關(guān)疾病[6],也是唯一被認(rèn)為是人類腫瘤中可知病因的惡性腫瘤,在全球女性高發(fā)惡性腫瘤中位居第4,僅次于乳腺癌、乳腺癌和肺癌[7-8]。目前HPV疫苗接種為預(yù)防HPV病毒感染的有效途徑,同時也表明宮頸癌將成為第一個通過注射、篩查、早期診斷和早期治療來消除的惡性腫瘤[9]。一項統(tǒng)計研究表明,宮頸癌患者中,高危型HPV(high risk human papillomavirus,HR-HPV)亞型(HPV16、HPV18)感染率高達(dá)73.75%,顯著高于癌前病變和宮頸炎患者,可見宮頸癌的發(fā)生與HR-HPV感染密切相關(guān)[10]。HPV主要通過感染皮膚和宮頸鱗狀細(xì)胞的基底細(xì)胞產(chǎn)生損傷,其中大多數(shù)女性體內(nèi)的HPV會被自身免疫系統(tǒng)清除,并不產(chǎn)生病變,而一部分女性體內(nèi)的HPV會產(chǎn)生持續(xù)性感染。若不予以及時干預(yù),HPV將以環(huán)狀DNA方式自我復(fù)制,隨著病情進展整合到宿主細(xì)胞DNA中,免疫系統(tǒng)對HPV病毒的入侵產(chǎn)生免疫逃逸,造成宿主細(xì)胞異常分化引發(fā)癌變。這提示機體免疫力,尤其是宮頸局部免疫微環(huán)境對HPV的清除至關(guān)重要[11]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是具有免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用:一方面維持免疫穩(wěn)態(tài),避免機體過度免疫發(fā)生自身免疫性疾病,另一方面Treg可促進腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。本課題組前期動物實驗結(jié)果表明,清毒栓可以抑制荷瘤小鼠外周血中Treg細(xì)胞[5]。Treg可通過分泌抑制性細(xì)胞因子如白介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β、白介素-35等抑制機體免疫應(yīng)答[12]。宮頸癌模型小鼠外周血中白介素-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β顯著升高,經(jīng)清毒栓含藥血清干預(yù)后,兩種細(xì)胞因子顯著降低。Foxp3是控制Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一,是Treg細(xì)胞系的主要調(diào)節(jié)因子,它的發(fā)現(xiàn)是Treg免疫生物學(xué)重要的進步,為人們進一步了解Treg功能和作用機制打開了一扇“門”[13]。實驗表明,在體外或體內(nèi)誘導(dǎo)初始T細(xì)胞表達(dá)Foxp3后可以出現(xiàn)Treg樣的免疫抑制作用,表明Foxp3是介導(dǎo)免疫逃逸的關(guān)鍵因素[14]。因此,闡明Foxp3的分子靶點是透徹理解Treg細(xì)胞免疫抑制作用的必要條件之一。

為了驗證Treg細(xì)胞的改變是否與Foxp3表達(dá)變化有關(guān),實驗選取jurkat T細(xì)胞株進行研究。jurkat T細(xì)胞屬于急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系,由于jurkat細(xì)胞株懸浮生長的特點,培養(yǎng)方法簡單,性質(zhì)穩(wěn)定,容易獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于實驗,保留了人周圍血T淋巴細(xì)胞特性[15],常用于研究T細(xì)胞各種信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞因子的變化以及相關(guān)受體變化。本實驗采用Western Blot法檢測Foxp3蛋白表達(dá)水平、qRT-PCR法檢測Foxp3轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)SiHa上清液可以顯著增加jurkat細(xì)胞中Foxp3含量,且處理48小時時最為顯著。濃度15%和20%的含藥血清能顯著抑制jurkat細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)。經(jīng)15%濃度含藥血清處理后,jurkat細(xì)胞中Foxp3蛋白相對表達(dá)量、mRNA相對表達(dá)量及Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降顯著下降(P<0.05),說明15%含藥血清能顯著抑制T細(xì)胞中Foxp3轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),從而降低Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)。

綜上所述,Foxp3誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞免疫抑制作用在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,中藥清毒栓通過降低Foxp3的表達(dá)以及減少Treg細(xì)胞數(shù)目,從而抑制宮頸SiHa細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生,有利于宮頸癌的防治。