楊肖翠 劉清華 程效增 黃 薇 李 靜

肺炎是呼吸科常見疾病，癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽、胸痛等，病情進展較快［1］。肺炎病原菌包含病毒、細菌、支原體等類型，其中肺炎支原體肺炎在5～15 歲的兒童中多發(fā)，屬于原發(fā)性非典型肺炎，為小兒呼吸道感染的常見病，占30%以上，支原體屬于細胞內(nèi)的微生物，一旦感染后想要清除非常困難，肺炎支原體肺炎除具有本身的肺炎特征外，極易導致并發(fā)癥，再加上小兒自身免疫能力較差，對兒童的身體健康造成了嚴重影響［2-3］。miRNA 在肺炎支原體肺炎中發(fā)揮的作用也已被證實［4］。微小核糖核酸-143-3p（microRNA-143-3p，miR-143-3p）在增殖、凋亡等細胞活動中發(fā)揮重要作用［5］，研究顯示，miR-143-3p 對肺炎支原體肺炎小鼠細胞凋亡具有抑制作用，且可降低小鼠肺部炎癥因子［6］。猜測miR-143-3p 可能與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有關。微小核糖核酸-509-5p（microRNA-509-5p，miR-509-5p）在綿羊肺炎支原體肺炎的耐藥性中發(fā)揮關鍵作用，其可調(diào)控炎癥反應［7］，其是否在肺炎支原體肺炎患兒中發(fā)揮作用仍未見研究。因此，本研究旨在分析血清miR-143-3p、miR-509-5p 與肺炎支原體肺炎患兒疾病嚴重程度的關系，并分析血清miR-143-3p、miR-509-5p 對患兒預后的鑒別能力，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年5 月至2022 年4 月邯鄲市婦幼保健院收治的肺炎支原體肺炎患兒135 例作為肺炎支原體肺炎組，其中男患兒71 例，女患兒64例；年齡2～14 歲，平均（7.58±2.25）歲。根據(jù)疾病嚴重程度［9］，分為輕癥組84 例和重癥組51 例。另選取同期體檢健康兒童130 例作為對照組，其中男患兒68例，女患兒62 例；年齡2～14 歲，平均（7.62±2.24）歲。肺炎支原體肺炎組與對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。納入標準：①符合第7 版《實用兒科學》中肺炎支原體肺炎［8］診斷標準者；②配合肺功能測定者；③家屬知情同意。排除標準：①合并先天性疾病者；②合并免疫系統(tǒng)疾病者；③合并惡性腫瘤者；④入組前使用糖皮質(zhì)激素與免疫調(diào)節(jié)劑者。排除標準：既往免疫性疾病兒童及入組前2 周內(nèi)具有呼吸道感染、過敏性疾病兒童。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（審批號：2020416-02）。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 肺炎支原體肺炎患兒入院次日、對照組體檢時分別抽取5 mL 空腹肘靜脈血，血液經(jīng)離心后，留取上清，-20℃冰箱保存待測。

1.2.2 實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）法測定血清miR-143-3p 與miR-509-5p 水平 RNA 提取試劑盒提取血清RNA，將一定量RNA 反轉錄為cDNA。采用CFX384 Touch?定量PCR儀（美國Bio-Rad 公司）對miR-143-3p 與miR-509-5p進行擴增。反應條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40 個循環(huán)。miR-143-3p、miR-509-5p 與內(nèi)參U6 的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 肺功能測定 檢查當天清理鼻腔分泌物，精確測量患兒體質(zhì)量，選擇合適面罩罩于面部，保證無漏氣，調(diào)節(jié)肺功能儀參數(shù)，觀察患兒呼吸頻率（respiratory rate，RR）、潮氣量（tidal volume，VT）、呼氣時間（expiratory time，Te）、達峰時間（peak time，TPTEF）、達峰容積（peak volume，VPTEF）、計算TPTEF/Te、VPTEF/VT。

1.2.4 預后情況 根據(jù)病情好轉情況，將肺炎支原體肺炎患兒分為預后良好組（81 例）與預后不良組（54例）。其中，癥狀、體征、實驗室指標提示病情加重，即體溫未明顯下降，咳嗽和肺部癥狀加重，X 線胸片提示肺部病灶為吸收或加重或需患兒轉入上級醫(yī)院治療者，為預后不良；患兒體溫正常，咳嗽和哮喘癥狀明顯緩解，X 線胸片顯示肺部病灶吸收或消失，如滿足上述一項或多項指標，則為預后良好。

1.3 觀察指標 觀察兩組對象血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。觀察不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒肺功能指標、血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。分析患兒血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平與肺功能指標相關性。觀察不同預后情況患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平。分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平對重癥肺炎支原體肺炎以及預后不良的預測價值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson 法分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平與肺功能指標相關性；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-143-3p 和miR-509-5p 對重癥肺炎支原體肺炎以及預后不良的預測價值；以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對照組與肺炎支原體肺炎組血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比較 與對照組相比，肺炎支原體肺炎組miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對照組與肺炎支原體肺炎組血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

表2 對照組與肺炎支原體肺炎組血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

注：miR-143-3p為微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p為微小核糖核酸-509-5p。

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2.2 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒肺功能比較與輕癥組相比，重癥組肺炎支原體肺炎患兒RR 升高，VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒肺功能比較（）

表3 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒肺功能比較（）

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2.3 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比較 與輕癥組相比，重癥組肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低（P＜0.05）。見表4。

表4 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

表4 不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

注：miR-143-3p為微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p為微小核糖核酸-509-5p。

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2.4 肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p 和miR-509-5p水平與肺功能相關性分析 肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p 與RR 無相關性（P＞0.05），與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 均呈正相關（P＜0.05）。見表5。

表5 肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p與肺功能相關性分析

2.5 不同預后情況患兒血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平比較 與預后良好組相比，預后不良組肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 不同預后情況患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

表6 不同預后情況患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p水平比較（）

注：miR-143-3p為微小核糖核酸-143-3p，miR-509-5p為微小核糖核酸-509-5p。

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2.6 血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平對重癥患兒以及預后的預測價值 以患兒嚴重程度（輕癥組=0，重癥組=1）為狀態(tài)變量，血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平為檢驗變量，繪制ROC 曲線。結果顯示，血清miR-143-3p 預測重癥患兒的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.820，靈敏度為82.4%，特異度為83.3%，截斷值為0.235；血清miR-509-5p 預測重癥患兒的AUC 為0.849，靈敏度為72.5 %，特異度為92.9 %，截斷值為0.355。以患兒預后情況（預后良好=0，預后不良=1）為狀態(tài)變量，血清miR-143-3p 和miR-509-5p 水平為檢驗變量，繪制ROC 曲線。結果顯示，血清miR-143-3p 預測預后不良的AUC 為0.735，靈敏度為79.6%，特異度為63.0%，截斷值為0.245；血清miR-509-5p 預測預后不良的AUC 為0.859，靈敏度為81.5%，特異度為87.3%，截斷值為0.345。見圖1、2 和表7、8。

圖1 血清miR-143-3p和miR-509-5p預測重癥肺炎支原體肺炎的ROC曲線

圖2 血清miR-143-3p和miR-509-5p預測預后不良的ROC曲線

表7 miR-143-3p、miR-509-5p對重癥肺炎支原體肺炎的預測價值

表8 miR-143-3p、miR-509-5p對肺炎支原體肺炎患兒預后不良的預測價值

3 討論

支原體誘發(fā)的肺炎是兒科常見呼吸道疾病，以發(fā)熱、咳嗽為主要癥狀，易被認為是普通感冒，未規(guī)范治療易損傷患者心、肺等臟器，甚至威脅生命。因此及時篩查重癥患者及預后不良患者，給予相應防治措施對于挽救患者生命健康至關重要。

免疫紊亂、炎癥反應是參與肺炎支原體肺炎進展的關鍵，二者相互促進，構成反饋調(diào)節(jié)，加重肺炎支原體肺炎的進展［10-11］。miRNA 在免疫調(diào)節(jié)與炎癥反應中發(fā)揮重要作用，其在肺炎支原體肺炎患者體內(nèi)異常表達［12-14］。本研究結果顯示，肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p 水平低于體檢健康兒童，與劉沛等［15］研究結果相反，可能原因為miR-143-3p 表達存在組織特異度，肺炎支原體肺炎重癥組與輕癥組間存在差異，提示miR-143-3p 可能參與肺炎支原體肺炎的發(fā)展。支原體感染可引發(fā)氣道炎癥反應，損傷肺功能，肺部檢查是判斷疾病嚴重程度的手段。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p與肺功能相關指標VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 均呈正相關，進一步提示miR-143-3p 與疾病嚴重程度相關，經(jīng)ROC 曲線分析，血清miR-143-3p 水平低于0.235 時，重癥發(fā)生的可能性更高。此外，miR-143-3p 水平對于區(qū)分預后情況也有幫助，預后不良組miR-143-3p 水平低于預后良好組，當血清miR-143-3p 水平低于0.245時，預后不良的可能性高，截斷值在數(shù)值上與重癥患兒接近，但略有升高，意味著重癥患兒與預后不良患兒具有較高的交叉性，但仍有少部分輕癥患兒預后不良。提示miR-143-3p 在兒童肺炎支原體肺炎的病情評估以及預后中具有重要價值。

miR-509-5p 在癌癥中研究較多［16-17］。人囊性纖維化與非囊性纖維化氣道上皮細胞中miR-509-3p 水平不同，人囊性纖維化氣道上皮中miR-509-3p 水平升高，miR-509-3p 可調(diào)節(jié)人囊性纖維化上皮細胞的炎性介質(zhì)［18］。另外，miR-509-5p 在綿羊肺炎支原體肺炎的耐藥性中發(fā)揮關鍵作用，miR-509-5p 可調(diào)控綿羊炎癥反應［7］。本研究中，肺炎支原體肺炎患兒血清miR-509-5p 水平低于對照組，且重癥組血清miR-509-5p水平低于輕癥組，預后不良組血清miR-509-5p 水平低于預后良好組，miR-509-5p 與VT、TPTEF/Te、VPTEF/VT 呈正相關，提示miR-509-5p 水平與肺炎支原體肺炎嚴重程度以及預后相關，經(jīng)ROC 曲線分析，當肺炎支原體肺炎患兒血清miR-509-5p 水平低于0.355 時，發(fā)生重癥的可能性較高，此時AUC 為0.735，當血清miR-509-5p 水平低于0.345，預后不良的可能性高，AUC 為0.859，靈敏度和特異度均較高，提示血清miR-509-5p 水平對判斷肺炎支原體肺炎的嚴重程度以及預后具有重要價值。已有許多研究報道CRP 和D二聚體水平與肺炎支原體肺炎病情發(fā)展有關［19-20］，但本研究未進行二者水平檢測，未能研究二者與miR-143-3p 和miR-509-5p 之間的關系，此為本研究不足之處，后續(xù)本研究將進一步擴大樣本量深入研究miR-143-3p 和miR-509-5p 與CRP 和D 二聚體的關系以及與疾病進展關系，為二者作為臨床病情評估標志物提供理論依據(jù)。

綜上所述，肺炎支原體肺炎患兒血清miR-143-3p、miR-509-5p 水平降低，二者均對肺炎支原體肺炎的嚴重程度與預后具有判別價值，有望作為臨床病情評估以及預后判斷的指標。但本研究對miR-143-3p、miR-509-5p 影響肺炎支原體肺炎進展的機制仍不明晰，尚需進行細胞實驗探討。