鄭文濤,楊 林,王 浩

(1.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,云南 大理 671000;2.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,昆明 650500)

血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是介于腦組織和血液之間的一種天然屏障[1]。BBB通過選擇性地在腦實質(zhì)和血液之間轉(zhuǎn)移物質(zhì),在保護腦組織中起著關(guān)鍵作用。BBB的完整性被破壞是中樞神經(jīng)病變的重要病理機制之一[2]。例如:腦組織缺血后可以誘發(fā)炎癥反應(yīng),釋放的炎癥因子可以增加BBB通透性,而BBB通透性的增加又可以加劇血液中白細胞在腦組織的浸潤,進一步加重炎癥反應(yīng)。有文獻報道,抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能是保護BBB完整性和治療相關(guān)神經(jīng)疾病的潛在靶點[3]。褪黑素(MT)是一種在松果體中合成和釋放的神經(jīng)激素,其在改善睡眠障礙、情緒障礙以及增強學(xué)習(xí)和記憶等方面有著積極作用[4]。

MT通過釋放到血液和腦脊液中而發(fā)揮重要的生理生化功能[5]。例如,MT可以抗氧化應(yīng)激、抗炎癥,還可以作為免疫調(diào)節(jié)分子,在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[6]。MT及其代謝產(chǎn)物也能作為清除劑,清除各種自由基。有研究結(jié)果顯示,在大腦發(fā)生缺血損害時,MT可以通過激活褪黑素受體(MTs)發(fā)揮神經(jīng)保護作用,MT通過與不同的MTs結(jié)合后激活多個信號傳導(dǎo)級聯(lián),起到抗氧化、抗炎、抗凋亡及抑制自噬的作用,進而發(fā)揮細胞保護的作用[7]。

雷美替胺(Ramelteon)是首個被用于治療失眠的MT受體激動劑[8]。相比MT,Ramelteon對MTs具有更高的親和力和選擇性,在臨床中具有更好的療效和更高的安全性[9]。本研究探討了Ramelteon對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠腦損傷炎癥反應(yīng)、BBB完整性受損的影響,旨在探討Ramelteon對BBB的保護作用及其潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為育齡6～8周的健康C57BL/6實驗小鼠(SPF級,雄性),共24只,體重20～25 g。實驗小鼠由大理大學(xué)動物實驗管理處所提供[使用編號:SYXK(滇)2018-0002],研究嚴格遵照中國國家動物福利法規(guī)定。

1.2 儀器

PF5000型激光多普勒血流儀(上海然哲儀器設(shè)備有限公司);KW-DWY-S型腦立體定位儀(南京卡爾文生物科技有限公司);YP-96A型酶聯(lián)免疫檢測分析儀(山東優(yōu)云譜光電科技有限公司);NX50型冷凍切片機(美國Thermo Fisher公司);WSB-300型光學(xué)顯微鏡(廣州微域光學(xué)儀器有限公司);HM-P16型熒光免疫PCR檢測儀(山東恒美電子科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

Ramelteon(武漢普洛夫生物科技有限公司);LPS(美國Sigma-aldrich公司);伊文思藍(上海創(chuàng)賽科技有限公司);白細胞介素1β(IL-1β,廣州奧瑞達生物科技有限公司);單核細胞趨化蛋白1(MCP-1,泉州市九邦生物科技有限公司);山羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,上?？瞥尉S生物科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,上海博湖生物科技有限公司);小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3內(nèi)皮細胞,武漢普諾賽生命科技有限公司);人核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)抗體、細胞計數(shù)法-8(CCK-8)試劑盒(愛必信上海生物科技有限公司);人緊密連接蛋白1(ZO-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(天津肽鏈生物科技有限公司);IL-1β抗體、MCP-1,均購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;AMPK抑制劑Compound C(武漢科斯坦生物科技有限公司);熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(上海源葉生物科技有限公司);Nrf2 ELISA試劑盒(上?；钌锟萍加邢薰?;醌氧化還原酶1(NQO1)ELISA試劑盒(上海心語生物科技有限公司);丙二醛(MDA)檢測試劑盒-硫代巴比妥酸(TBA)法(上海尚寶生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.4 分組與給藥

對照組(0.9%氯化鈉溶液)、Ramelteon組、LPS組和LPS+Ramelteon組,每組6只C57BL/6雄性小鼠。其中Ramelteon組和LPS+Ramelteon組小鼠腹腔注射Ramelteon[3 mg/(kg·d)],1日1次,連續(xù)注射7 d。對照組小鼠腹腔注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液,1日1次,連續(xù)注射7 d。在第7日結(jié)束的時候,LPS組和LPS+Ramelteon組在Ramelteon注射2 h后,向小鼠腹腔內(nèi)注射LPS(1 mg/kg),并將老鼠處死,取腦組織以備用。

1.5 小鼠神經(jīng)功能缺損評分

Ramelteon組、LPS組和LPS+Ramelteon組注射藥物24 h后,三組各取6只小鼠進行神經(jīng)功能評分。(1)木條平衡法(木條1.5 cm寬):0分,小鼠失去平衡能力,從木條上跌落;1分,小鼠緊緊握住木條或用四肢鉤住木條>60 s;2分,小鼠在60 s內(nèi)保持穩(wěn)定的平衡姿勢,但未在木條上移動;3分,小鼠在木條上自由行走,并可以自由轉(zhuǎn)動。(2)鼠尾懸掛法:0分,小鼠肢體下垂,不能彎曲;1分,小鼠前肢在原位掙扎;2分,小鼠前肢可以彎曲,后肢不能;3分,小鼠掙扎后后肢可彎曲;4分,小鼠掙扎后能向尾部彎曲;5分,小鼠在15 s內(nèi)彎曲到尾部。將2種神經(jīng)功能評估方法的評分相加,得出神經(jīng)功能評分,評分越高,神經(jīng)功能缺損程度越輕。

1.6 伊文思藍分析

伊文思藍是一種非膜的滲透性染料,在神經(jīng)病學(xué)領(lǐng)域,可作為示蹤劑觀察BBB的完整性。正常生理條件下血漿蛋白是無法透過BBB的,由于其與血漿蛋白有很強的親和力,所以與血漿蛋白結(jié)合的伊文思藍也無法透過BBB,通過觀察伊文思藍泄露可以了解BBB完整性的損傷情況[10]。經(jīng)Ramelteon治療后,將伊文思藍溶液(2 mg,1%溶于0.9%氯化鈉溶液)經(jīng)小鼠尾靜脈注射,循環(huán)30 min后將小鼠斬首,然后在冰上快速分離腦組織并保存。

1.7 bEnd.3內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

將bEnd.3細胞置于DMEM培養(yǎng)基中生長,并在培養(yǎng)基中添加4.5 g/L葡萄糖、3.7 g/L碳酸氫鈉、4 g/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素,所有細胞培養(yǎng)物均在37 ℃和5%CO2/95%室內(nèi)空氣的潮濕培養(yǎng)箱中保存。需要經(jīng)過藥物處理的Ramelteon組和LPS+Ramelteon組,將細胞以1.0×104個/cm2的密度接種于組織培養(yǎng)皿中,分別在Ramelteon藥物濃度梯度為30、60 nmol/L的情況下,使用LPS(1 μg/mL)處理細胞。然后,將部分細胞加入六孔板中,培養(yǎng)24 h后,等待細胞快鋪滿六孔板后,加入1 mmol/L的二甲雙胍處理細胞1 d,促進AMPK磷酸化的激活。最后,為了敲除bEnd.3細胞中的Nrf2,用完全不含抗菌藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞并用LPS和Ramelteon處理,檢測Nrf2的含量以評估Nrf2的敲除效率。

1.8 CCK-8細胞活力的測定

使用CCK-8試劑盒評估細胞活力。將20 000個bEnd.3細胞接種在96孔板中,并在LPS和Ramelteon處理之前溫育24 h。為了確定存活力,分別于0、24、48、72和96 h后在每個孔位中加入10 μL的CCK-8溶液,在(37 ℃,5%CO2)恒溫箱中下培養(yǎng)小鼠,最后使用全自動定量繪圖酶標儀在450 nm處測量吸光度。

1.9 BBB通透性的測定

熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖是由熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)葡聚糖形成的一種標志物,是由不同長度的支鏈葡萄糖分子組成的被標記的多糖,可根據(jù)所使用的葡聚糖的大小來測定BBB的溶質(zhì)、離子和蛋白質(zhì)滲透性。將100 μL含有500 μg/mL熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖的溶液涂于細胞單層頂端表面并在PBS中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,然后從細胞基底外側(cè)室取出約20 μL樣品,并按1∶5的比例用PBS緩沖液稀釋。隨后,在490/520 nm處進行熒光光譜法測定。

1.10 其他常規(guī)生物學(xué)及組織學(xué)方法

采用免疫染色和蛋白質(zhì)印跡法檢測腦組織和內(nèi)皮細胞中ZO-1和閉合蛋白(Occludin)的表達。采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測炎癥因子IL-1β和MCP-1水平的表達。用硫代巴比妥酸法檢測腦組織和內(nèi)皮細胞中MDA的濃度。用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞核中Nrf2和NQO1的表達情況。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)小鼠大腦通透性的影響

采用伊文思藍法檢測BBB的通透性,結(jié)果見圖1。與對照組的16.1 μg/g相比,LPS組小鼠大腦通透性顯著升至36.6 μg/g;而相比于LPS組,LPS+Ramelteon組小鼠大腦通透性顯著下降為25.6 μg/g,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

與對照組比較,***P<0.05;與LPS+Ramelteon組比較,##P<0.05。

2.2 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)功能的影響

模型制備后6、12 h,與對照組比較,LPS組小鼠神經(jīng)功能評分顯著降低;與LPS組比較,LPS+Ramelteon組小鼠神經(jīng)功能評分明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠神經(jīng)功能評分比較

2.3 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)小鼠ZO-1和Occludin的影響

與對照組相比,Ramelteon組小鼠ZO-1和Occludin蛋白表達水平顯著上調(diào),LPS組表達水平顯著下調(diào);與LPS組相比,LPS+Ramelteon組小鼠ZO-1和Occludin蛋白表達水平有所升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

與對照組比較,**P<0.05,***P<0.01;與LPS組比較,^^P<0.05。

2.4 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)小鼠血管IL-1β和MCP-1的影響

與對照組相比,LPS組小鼠IL-1β、MCP-1 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);與LPS組相比,LPS+Ramelteon組IL-1β、MCP-1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3。

A.IL-1β mRNA表達;B.MCP-1 mRNA表達;C.IL-1β蛋白表達;D.MCP-1蛋白表達;與對照組比較,***P<0.05;與LPS組比較,##P<0.05。

A.小鼠腦血管中Nrf2表達;B.小鼠腦血管中NQO1的表達;C.小鼠腦血管中MDA水平;與對照組比較,**P<0.05,^^^P<0.05;與Ramelteon組比較,***P<0.01;與LPS組比較,##P<0.01。

2.5 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激的影響

與對照組相比,Ramelteon組小鼠Nrf2和NQO1表達顯著上調(diào)(P<0.05),而LPS組小鼠Nrf2和NQO1表達顯著下調(diào)(P<0.05);與Ramelteon組比較,LPS組小鼠Nrf2和NQO1表達顯著下調(diào)(P<0.05);與LPS組相比,LPS+Ramelteon組小鼠Nrf2和NQO1的表達顯著上調(diào),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,LPS組小鼠MDA水平升高;與LPS組相比,LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)組小鼠MDA水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

2.6 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的bEnd.3腦內(nèi)皮細胞通透性和細胞活力影響

LPS組bEnd.3細胞存活率的僅為67%;LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)組bEnd.3細胞存活率分別達到了85%和96%,相較LPS組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與LPS組相比,LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)組內(nèi)皮細胞通透性明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

A.細胞活力;B.內(nèi)皮通透性;與對照組比較,***P<0.01;與LPS組比較,##P<0.05。

2.7 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的bEnd.3腦內(nèi)皮細胞中ZO-1和Occludin降低的影響

改為LPS組內(nèi)皮細胞ZO-1和Occludin的mRNA、蛋白水平較對照組顯著下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);LPS+Ramelteon(30、60 nmol/L)組內(nèi)皮細胞ZO-1和Occludin的mRNA、蛋白水平較LPS組顯著提升,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6。

2.8 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的bEnd.3腦內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激影響

LPS組Nrf2和NQO1在bEnd.3腦內(nèi)皮細胞的表達水平較對照組顯著降低(P<0.05);LPS+Ramelteon(30、60 nmol/L)組Nrf2和NQO1在bEnd.3腦內(nèi)皮細胞中的表達水平較LPS組顯著升高,且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

A.Nrf2蛋白水平;B.內(nèi)皮細胞通透性;C.ZO-1和Occludin的mRNA水平;與對照組比較,**P<0.05;與LPS組比較,^^P<0.05;與LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組比較,###P<0.05。

A.Nrf2相對蛋白表達量;B.ROS相對生成量;C.細胞活力;與對照組比較,***P<0.01;與LPS組比較,##P<0.05;與LPS+Ramelteon組(60 nmol/L)比較,^^P<0.05。

2.9 Nrf2基因敲除對Ramelteon對bEnd.3內(nèi)皮細胞的保護作用影響

在轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA細胞中Nrf2的表達顯著降低,建立Nrf2基因沉默細胞成功,見圖8(A)。與對照組相比,LPS組bEnd.3內(nèi)皮細胞通透性明顯增加(P<0.05);與LPS組比較,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組內(nèi)皮細胞通透性明顯降低(P<0.05);在Nrf2基因敲除后,相比Ramelteon(60 nmol/L)組,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2組內(nèi)皮細胞通透性明顯升高(P<0.05),上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比,LPS組ZO-1和Occludin表達水平明顯降低(P<0.05);與LPS組比較,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組ZO-1和Occludin表達水平升高(P<0.05);在Nrf2基因敲除后,相比于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2組ZO-1和Occludin表達水平降低(P<0.05),上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖8。

2.10 Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的BBB損傷的影響

與對照組比較,LPS組Nrf2相對蛋白表達量降低(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組Nrf2相對蛋白表達量升高(P<0.05);而LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2組、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2組相較于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組Nrf2蛋白表達量降低(P<0.05),上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較,LPS組檢測到活性氧(ROS)相對生成量明顯升高(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組ROS相對生成量降低(P<0.05);LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2組、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2組相較于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組ROS相對生成量升高(P<0.05),上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。LPS組細胞活力較對照組顯著降低(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組細胞活力升高;LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2組、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2組相較于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)組細胞活力降低(P<0.05),上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖9。

3 討論

本研究旨在探討Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的體外BBB模型通透性升高的保護作用及其機制。研究結(jié)果表明,加入Ramelteon治療后受LPS影響的小鼠神經(jīng)功能評分有所提高。同時,本研究觀察到Ramelteon改善了LPS誘導(dǎo)小鼠大腦通透性升高,且降低了炎癥相關(guān)因子IL-1β和MCP-1的表達,提示Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的腦血管炎癥反應(yīng)有抑制作用,這表明Ramelteon對BBB的損傷具有一定的保護作用。

BBB的主要功能是維持中樞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,為神經(jīng)系統(tǒng)信號傳導(dǎo)提供一個穩(wěn)定的離子空間,以確保大腦正常的工作[11]。BBB由內(nèi)皮細胞及其細胞間的緊密連接、完整的基膜、周細胞、小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞以及圍成的神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成[12]。目前,尚不了解BBB完整性的損傷是否與MT水平下降有關(guān),但有研究報道,MT能夠改善LPS誘導(dǎo)的BBB損傷[13],通過阻止LPS引起的Occludin以及claudin-5降解實現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn),在LPS的刺激下,小鼠大腦和體外bEnd.3內(nèi)皮細胞的BBB通透性均顯著增加,同時伴有ZO-1、Occludin的下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明BBB的完整性受到LPS刺激的損害,通過Ramelteon治療可顯著逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)BBB通透性增加和ZO-1、Occludin表達降低,提示Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的BBB損傷具有保護作用。

有文獻報道,炎癥反應(yīng)可參與腦損傷的過程[14]。大腦缺血缺氧后會激活炎癥細胞,增加炎癥因子的表達,如MCP-1、IL-1β等,激活的炎癥細胞進入腦組織再次釋放更多的炎癥因子,形成級聯(lián)反應(yīng)從而破壞BBB。本研究觀察到,在受到LPS刺激后腦血管炎癥因子的釋放顯著升高,但在經(jīng)過Ramelteon治療,明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的腦血管炎癥反應(yīng),提示Ramelteon對LPS誘導(dǎo)的腦血管炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

氧化應(yīng)激與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制相關(guān),當機體ROS成分與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破時,氧化應(yīng)激將會發(fā)生一系列的適應(yīng)性反應(yīng)[15]。氧化應(yīng)激主要是由于過量的ROS分泌產(chǎn)生的,當ROS的活性高于抗氧化防御時即可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。LPS在激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶后會誘導(dǎo)機體產(chǎn)生過多的ROS,ROS過度積累引起氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致BBB完整性的損傷[17-19]。因此,ROS的過度積累誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)與BBB完整性受損誘發(fā)的疾病發(fā)病機制有關(guān)。據(jù)相關(guān)研究報道,ROS是受Nrf2信號通路調(diào)控的[20]。本研究觀察到,LPS能引起B(yǎng)BB模型血管內(nèi)皮中的Nrf2和NQO1表達顯著下降,同時MDA產(chǎn)生增加,提示LPS可以激活氧化應(yīng)激;在加入了Ramelteon后,氧化應(yīng)激反應(yīng)被明顯抑制。

為了進一步證實Ramelteon在對LPS誘導(dǎo)腦血管的保護作用,我們研究了Ramelteon在體外bEnd.3內(nèi)皮細胞通透性的作用。Nrf2基因沉默后,Ramelteon失去了對LPS誘導(dǎo)的ZO-1和Occludin減少以及內(nèi)皮細胞單層通透性增加的保護作用,提示Ramelteon對BBB的保護作用可能是通過激活Nrf2信號通路介導(dǎo)的。

MT除了具有催眠的藥理作用,MT還具有一定的抗炎作用[21]。MT及其代謝物能清除各種氧自由基,且能夠通過激活A(yù)MPK以及抑制gp91 phox蛋白表達,改善LPS誘導(dǎo)的BBB損傷[22]。因此,本研究加入了AMPK的抑制劑Compound C,結(jié)果顯示,在加入了Compound C后,Nrf2蛋白表達有所下調(diào)。與LPS+Ramelteon組相比,加入Compound C后檢測到ROS的含量有所增加,細胞活力也顯著下調(diào)。因此,本研究結(jié)果表明,Ramelteon可能通過激活A(yù)MPK-Nrf2信號通路改善LPS誘導(dǎo)的BBB通透性升高。