武金強, 谷若萌, 馬子安

廊坊市人民醫(yī)院口腔科,河北廊坊065000

慢性牙周炎是菌斑微生物導致的牙周組織慢性炎癥性疾病,持續(xù)激活的炎癥反應會導致牙周組織發(fā)生不可逆破壞,嚴重時會造成牙齒松動和脫落,其機制目前尚不十分清楚。牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎常見致病菌,局部組織中存在的模式識別受體能識別該病原菌,并通過下游信號通路激活炎癥反應、細胞凋亡及焦亡等,進而導致組織損傷和破壞[1-2]。NLRP3是一類模式識別受體,以NLRP3為核心的炎癥小體可介導炎癥反應和細胞焦亡,牙齦卟啉單胞菌導致的牙周膜細胞損害與激活NLRP3炎癥小體有關[3]。為深入認識NLRP3炎癥小體在牙齦卟啉單胞菌感染導致慢性牙周炎中的作用,本研究分析慢性牙周炎牙齦卟啉單胞菌感染患者NLRP3炎癥小體與炎癥反應及焦亡指標的相關性,為臨床提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇本院2020年2月—2022年2月收治的慢性牙周炎患者300例,按照牙齦卟啉單胞菌感染情況分為陽性組194例和陰性組106例。陽性組男101例、女93例,年齡(48.31±7.71)歲;輕度138例,重度56例,病程1～4年;發(fā)生全口牙牙槽骨吸收22例,磨牙牙槽骨吸收67例,前牙牙槽骨吸收72例。陰性組男64例、女42例,年齡(48.09±7.45)歲;輕度76例,重度30例,病程1～4年;發(fā)生全口牙牙槽骨吸收10例,磨牙牙槽骨吸收31例,前牙牙槽骨吸收40例。兩組一般資料比較差異無顯著性(P>0.05)。納入標準:①符合慢性牙周炎診斷標準[4];②均進行牙齦卟啉單胞菌檢測[4];③均通過正畸治療或拔除患牙獲得牙齦組織標本;④均留取齦溝液標本。排除標準:①近3個月接受過抗感染治療、免疫治療;②糖尿病、自身免疫性疾病;③惡性腫瘤;④妊娠或哺乳者。本研究獲得本院醫(yī)學倫理委員會批準,取得患者或家屬知情同意,簽署知情同意書。

1.2 牙周健康指標的評估

在治療前檢測兩組牙周健康指標菌斑指數(shù)(plaque index,PLI)、牙齦指數(shù)(gingival index,GI)、附著喪失(atachment loss,AL)、牙周袋深度(pocket depth,PD)。

1.3 熒光定量PCR檢測牙周組織NLRP3炎癥小體mRNA

提取牙周組織總RNA,將總RNA反轉錄為cDNA,采用熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化科技公司)對cDNA中的目標基因NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、Caspase-1進行熒光定量PCR擴增,按照試劑盒說明書操作,以β-actin為內參,計算NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平。

1.4 ELISA檢測齦溝液中炎癥因子水平

將無菌紙放置在牙周袋底部10 s,取出放入1 mL無菌生理鹽水中,室溫下洗脫40 min,4 ℃3 000×g離心5 min,收集上清液即為齦溝液。采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(上海西唐生物科技公司)檢測齦溝液中白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.5 Western blotting檢測牙周組織中焦亡標志基因蛋白水平

采用組織裂解液對牙周組織進行勻漿,提取蛋白,Western blotting檢測牙周組織中焦亡標志基因GSDMD-N蛋白水平。以β-tubulin為內參計算GSDMD-N蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組牙周健康指標的比較

陽性組PLI、GI、AL、PD高于陰性組(P<0.05;表1)。

表1 兩組牙周健康指標的比較

2.2 兩組NLRP3炎癥小體mRNA的比較

陽性組牙周組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平高于陰性組(P<0.05;表2)。

表2 兩組牙周組織中NLRP3炎癥小體mRNA的比較

2.3 兩組炎癥因子水平的比較

陽性組齦溝液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平高于陰性組(P<0.05;表3)。

表3 兩組齦溝液中炎癥因子水平的比較

2.4 兩組GSDMD-N蛋白水平的比較

陽性組牙周組織中焦亡標志基因GSDMD-N蛋白表達水平高于陰性組(P<0.05;圖1)。

圖1 兩組GSDMD-N蛋白水平的比較a為P<0.05,與陰性組比較。

2.5 NLRP3炎癥小體與牙周健康指標、炎癥因子、焦亡標志基因的相關性

NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達水平與PLI、GI、AL、PD、IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N蛋白表達水平均呈正相關(P<0.05;表4)。

表4 NLRP3炎癥小體與牙周健康指標、炎癥因子、焦亡標志基因的相關性

3 討 論

牙齦卟啉單胞菌是促進慢性牙周炎的致病菌,相關研究證實,牙齦卟啉單胞菌的菌毛、莢膜、膜內成分及其釋放的脂多糖、外膜蛋白等參與炎癥反應、細胞凋亡及焦亡、氧化應激、內質網(wǎng)應激等生物學環(huán)節(jié)的調控[5],但具體的生物學機制尚不清楚。

病原菌調控宿主細胞炎癥反應、凋亡及焦亡的過程涉及模式識別受體對病原菌成分的識別及細胞內信號轉導[6-7]。NLRP3是具有廣泛生物學活性的模式識別受體,其與細胞內ASC、Caspase-1共同組成炎癥小體,一方面直接參與細胞炎癥反應及焦亡的調控,另一方面通過復雜的生物信號轉導網(wǎng)絡參與氧化應激、內質網(wǎng)應激、凋亡等的調控。慢性牙周炎發(fā)病過程中NLRP3炎癥小體表達增加已有相關報道[8];另有細胞實驗證實牙齦卟啉單胞菌感染能夠激活牙周膜細胞中NLRP3炎癥小體[4]。本研究證實,合并牙齦卟啉單胞菌感染的慢性牙周炎牙周組織中NLRP3炎癥小體的表達高于未感染牙齦卟啉單胞菌的牙周組織,并且NLRP3炎癥小體的表達與牙周炎病情指標PLI、GI、AL、PD呈正相關,提示慢性牙周炎發(fā)病過程中牙齦卟啉單胞菌感染對NLRP3炎癥小體具有激活作用,并且這一激活作用可能造成牙周炎病情加重。

NLRP3炎癥小體在識別病原菌的多種成分后通過細胞內ASC招募Caspase-1,后者一方面能夠促進IL-1β、IL-18的成熟和釋放,進而介導炎癥反應激活,增加其他炎癥因子如TNF-α釋放[9];另一方面能夠裂解GSDMD的氨基末端、生成GSDMD并介導細胞焦亡[10]。在慢性牙周炎的多種模型中均存在炎癥反應和細胞焦亡的過度激活[11-12]。本研究證實,合并牙齦卟啉單胞菌感染的慢性牙周炎齦溝液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平及牙周組織中GSDMD-N水平高于未感染牙齦卟啉單胞菌的牙周組織,提示牙齦卟啉單胞菌感染加重了慢性牙周炎的炎癥反應和細胞焦亡。本研究進一步通過相關性分析證實,NLRP3炎癥小體表達與IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N水平呈正相關,這一結果符合NLRP3炎癥小體介導炎癥反應和細胞焦亡的生物學特性,進而也提示激活NLRP3炎癥小體與牙齦卟啉單胞菌感染加重慢性牙周炎的炎癥反應和細胞焦亡有關。

本研究僅僅通過臨床樣本的檢測結果展開討論分析,雖然能夠初步揭示NLRP3炎癥小體在牙齦卟啉單胞菌感染加重慢性牙周炎病情、炎癥反應和細胞焦亡中的作用,但未能通過細胞實驗、動物實驗獲得NLRP3炎癥小體對牙周組織健康狀況影響的直接證實。此外,牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎常見的致病菌,除此之外也存在其他致病菌,今后可進一步探索牙周炎發(fā)病過程中不同類型致病菌激活NLRP3的特點,進而有助于全面認識牙周炎的分子生物學機制。