吳松, 唐海林

中山大學(xué)腫瘤防治中心,廣東廣州510060

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性人群發(fā)病率最高的腫瘤,嚴(yán)重威脅著全球女性的健康[1]。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡率最高的亞型,在BC中所占比例為10%～20%[2]。TNBC的特征為不表達(dá)雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2);由于TNBC特殊的分子分型,TNBC對內(nèi)分泌治療或分子靶向治療并不敏感[3]。由于目前仍缺乏有效的TNBC治療方案,早期發(fā)現(xiàn)和有效的靶向治療對于TNBC患者尤為重要。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是以共價鍵形式形成閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)單鏈RNA,缺乏5′端帽子和3′poly(A)尾,被證實可參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和腫瘤等[4-5]。研究表明,環(huán)狀RNA的異常表達(dá)可通過影響TNBC細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程,最終調(diào)控TNBC的進(jìn)程[6]。因此,環(huán)狀RNA可能是TNBC潛在的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。本文主要闡述了環(huán)狀RNA的形成、作用機(jī)制和對TNBC潛在的臨床意義,為未來的臨床應(yīng)用提供有效的信息。

1 環(huán)狀RNA的形成

與信使RNA(messenger RNA,mRNA)的線性剪接相比,環(huán)狀RNA的形成主要依賴于前體mRNA的反向剪接機(jī)制,即前體mRNA下游5′剪接位點(diǎn)(剪接供體)與上游3′剪接位點(diǎn)(剪接受體)通過3′-5′磷酸二酯鍵連接形成反向剪接位點(diǎn)[7]。根據(jù)組成成分的不同,環(huán)狀RNA可分為外顯子環(huán)狀RNA(exonic circRNA,ecircRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(circular intronic RNA,ciRNA)、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(exonic-intron circRNA,EIciRNA)和融合基因來源的環(huán)狀RNA等4種類型[8]。研究表明,4種環(huán)化機(jī)制與ecircRNA和EIciRNA的生成相關(guān),包括內(nèi)含子配對驅(qū)動環(huán)化、套索驅(qū)動環(huán)化、依賴RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding-protein,RBP)驅(qū)動環(huán)化和依賴小核核糖核蛋白驅(qū)動環(huán)化機(jī)制[6]。ciRNA主要的產(chǎn)生機(jī)制是,反向互補(bǔ)的特定內(nèi)含子配對環(huán)化形成含有3′-5′磷酸二酯鍵的RNA套索,隨后切除3′尾巴并形成ciRNA。ciRNA和EIciRNA定位在細(xì)胞核中。環(huán)狀RNA如何從細(xì)胞核運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)中的機(jī)制尚不明確。此外,m6A修飾也被報道會影響環(huán)狀RNA的核輸出[9]。環(huán)狀RNA的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以有效抵抗核酸外切酶的降解,所以比線性RNA擁有更長的半衰期[10]?？傊?環(huán)狀RNA的穩(wěn)態(tài)豐度是生成效率、核輸出率和降解率三者平衡的結(jié)果。

2 環(huán)狀RNA的作用機(jī)制

研究表明,環(huán)狀RNA在基因表達(dá)的過程中具有重要作用[11]。環(huán)狀RNA可調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接、作為微小RNA(microRNA,miRNA)海綿、與蛋白質(zhì)結(jié)合以及作為翻譯模板,進(jìn)而影響基因表達(dá)。

2.1 調(diào)控轉(zhuǎn)錄和剪接

環(huán)狀RNA可參與轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接的調(diào)控過程。位于細(xì)胞核中的ciRNA和EIciRNA可通過結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ(RNA Pol Ⅱ)復(fù)合體調(diào)控基因表達(dá)。circANKRD52和circSIRT7聚集在其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn),通過與RNA Pol Ⅱ復(fù)合物相互作用從而上調(diào)親本基因的轉(zhuǎn)錄[12]。Guarnerio等[13]發(fā)現(xiàn),circPOK在細(xì)胞核中結(jié)合并激活LIF2/3復(fù)合體,從而在間充質(zhì)腫瘤中發(fā)揮促癌作用。研究表明,剪接因子可調(diào)控環(huán)狀RNA的生成和選擇性剪接之間的平衡[14]。circMBL由MBL基因的第2外顯子反向剪接生成,該過程與MBL的選擇性剪接互相競爭。circMBL和circMBL的側(cè)翼內(nèi)含子均具有保守的MBL蛋白結(jié)合位點(diǎn),這些位點(diǎn)可被MBL牢固而特異地結(jié)合。高表達(dá)的MBL與circMBL側(cè)翼內(nèi)含子結(jié)合,促進(jìn)circMBL的反向剪接而抑制MBL mRNA的表達(dá),同時circMBL也會與增加的MBL結(jié)合,使其含量趨于穩(wěn)定[14]。

2.2 與miRNA結(jié)合

環(huán)狀RNA可通過作為miRNA海綿參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。miRNA通過與mRNA 3′非編碼區(qū)堿基直接配對,降低mRNA穩(wěn)定性和抑制翻譯,從而負(fù)性調(diào)控mRNA的基因表達(dá)。環(huán)狀RNA含有不同類型的miRNA反應(yīng)元件,可通過堿基互補(bǔ)配對原則競爭性結(jié)合miRNA,解除miRNA對靶基因的抑制作用,進(jìn)而上調(diào)靶基因的表達(dá),即形成circRNA/miRNA/mRNA調(diào)控軸;該作用機(jī)制研究最充分的例子是環(huán)狀RNA CDR1as,它與miR-7有70多個保守的結(jié)合位點(diǎn),并被miRNA結(jié)合蛋白AGO蛋白緊密結(jié)合[15]。劉睿涵等[16]報道,環(huán)狀RNA結(jié)合miRNA后在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。本團(tuán)隊近期發(fā)現(xiàn),circROBO1通過競爭性結(jié)合miR-217-5p上調(diào)KLF5的表達(dá),形成circROBO1/miR-217-5p/KLF5調(diào)控軸,并通過抑制BECN1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制afadin的選擇性自噬[17]。

2.3 與蛋白質(zhì)結(jié)合

環(huán)狀RNA具有RBP的結(jié)合位點(diǎn),可通過與蛋白質(zhì)相互作用來發(fā)揮功能。環(huán)狀RNA不僅可作為支架將不同蛋白質(zhì)招募或阻滯到特定亞細(xì)胞器,也可與其他RNA和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,從而調(diào)節(jié)信號通路。環(huán)狀RNA FECR1與TET1結(jié)合并可招募到FLI1的啟動子區(qū)域,還可結(jié)合并下調(diào)DNMT1,最終導(dǎo)致CpG島的DNA去甲基化并激活FLI1轉(zhuǎn)錄[18]。位于細(xì)胞質(zhì)中的circFoxo3與抗衰老蛋白ID1、E2F1以及抗應(yīng)激蛋白FAK、缺氧誘導(dǎo)因子-1α相互作用,阻止這些蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,使其滯留在細(xì)胞質(zhì)中,從而促進(jìn)細(xì)胞衰老和應(yīng)激[19]。研究表明,circFoxo3能夠結(jié)合CDK2和p21,形成circFoxo3-p21-CDK2三元復(fù)合物,阻斷細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期,從而阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程[20]。環(huán)狀RNA也可以作為競爭元件阻斷RBP功能。位于細(xì)胞質(zhì)的circPABPN1可通過與RBP HuR結(jié)合,阻斷HuR與PABPN1 mRNA結(jié)合,進(jìn)而抑制PABPN1的蛋白翻譯過程[21]。

2.4 作為翻譯模板

環(huán)狀RNA具有翻譯成蛋白質(zhì)或者多肽的潛能。一些具有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)的環(huán)狀RNA可以利用起始密碼子,以不依賴帽子結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行翻譯。本團(tuán)隊發(fā)現(xiàn),circFBXW7不僅作為內(nèi)源競爭RNA競爭性結(jié)合miR-197-3p而抑制TNBC生長,還可翻譯一種新型蛋白FBXW7-185aa,FBXW7-185aa蛋白可增加FBXW7的豐度和促進(jìn)c-Myc降解,最終抑制TNBC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。不依賴于帽子結(jié)構(gòu)的蛋白翻譯是低效的,但是在饑餓和熱休克等壓力條件下,環(huán)狀RNA的翻譯效率得到提升[23]。此外,m6A修飾也可啟動環(huán)狀RNA翻譯。Wen等[24]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA富集m6A motif,且一個m6A位點(diǎn)就能夠啟動翻譯的起始過程。m6A啟動的翻譯需要起始因子eIF4G2和m6A識別蛋白YTHDF3,同時能被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14加強(qiáng),能被去甲基化酶FTO抑制,也能被激活上調(diào)。該團(tuán)隊進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),m6A驅(qū)動的環(huán)狀RNA翻譯廣泛存在,有數(shù)百個內(nèi)源性環(huán)狀RNA都具有翻譯潛能[24]。

3 環(huán)狀RNA在TNBC的生物學(xué)功能

隨著高通量測序和芯片技術(shù)的高速發(fā)展,越來越多環(huán)狀RNA在TNBC中的功能和潛在機(jī)制被報道。環(huán)狀RNA通過直接或間接調(diào)控腫瘤相關(guān)信號通路,在TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡、自噬、血管生成和化療耐藥等方面發(fā)揮重要作用[25]。

3.1 調(diào)控TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖

環(huán)狀RNA可作為促癌或抑癌分子參與TNBC腫瘤細(xì)胞的增殖和生長過程。上調(diào)的環(huán)狀RNA一般被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的促癌基因,同時可以抑制細(xì)胞周期和凋亡。研究發(fā)現(xiàn),circGFRA1、circEPSTI1、circKIF4A、circRAD18、circPLK1和circGNB1在TNBC細(xì)胞和組織中均上調(diào)[26],能夠在小鼠體內(nèi)外研究中促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長。circ_0004676通過miR-377-3p/E2F6/PNO1軸在體外實驗可顯著加速細(xì)胞周期,促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和遷移,在小鼠體內(nèi)試驗可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[27]。circSEPT9在TNBC組織中表達(dá)上調(diào),與較差的臨床分期和預(yù)后相關(guān)。E2F1和EIF4A3介導(dǎo)生成的circSEPT9可通過miR-637的海綿調(diào)控LIF的表達(dá),激活LIF/STAT3信號通路,從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,抑制TNBC細(xì)胞凋亡和自噬[28]。

3.2 調(diào)控TNBC的侵襲和轉(zhuǎn)移

環(huán)狀RNA在TNBC的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[25]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是以上皮細(xì)胞極性和黏附能力喪失,間充質(zhì)增加為特征的過程,該過程可通過增強(qiáng)移動性、侵襲性和對凋亡刺激的抵抗,賦予腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性。circKIF4A[29]和circPLK1[30]等環(huán)狀RNA通過不同的分子機(jī)制最終靶向EMT信號通路,從而促進(jìn)TNBC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。circNR3C2在TNBC中顯著下調(diào),其表達(dá)與TNBC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)外實驗進(jìn)一步表明,circNR3C2/miR-513a-3p/HRD1軸通過誘導(dǎo)多泛素介導(dǎo)的波形蛋白降解,抑制TNBC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT過程[31]。曾凱旋[32]發(fā)現(xiàn),circANKS1B通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231在體內(nèi)外的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,而對腫瘤的增殖和生長無影響。在機(jī)制上,circANKS1B通過競爭性吸附miR-148a-3p和miR-152-3p,增加了轉(zhuǎn)錄因子USF1的表達(dá),激活轉(zhuǎn)化生長因子-β1/Smad信號通路,最終促進(jìn)EMT。劉慶等[33]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA circ0000799可經(jīng)miR-1287-5p/GPX4軸調(diào)控鐵死亡促進(jìn)三陰乳腺癌腦轉(zhuǎn)移。

3.3 調(diào)控TNBC的耐藥

化療是TNBC患者的關(guān)鍵治療方案。TNBC常用的化療藥物包括環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素(adriamycin,ADM)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)等。早期TNBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為新輔助化療后手術(shù)。對于復(fù)發(fā)或難治性TNBC患者,目前還沒有標(biāo)準(zhǔn)的化療方案。晚期TNBC患者可用的治療方法包括抗代謝物卡培他濱和吉西他濱、非紫杉烷微管動力學(xué)抑制劑艾瑞布林和DNA交聯(lián)鉑類藥物[34]。而化療耐藥是目前臨床治療的主要限制因素。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA在TNBC化療耐藥過程中發(fā)揮重要作用。circKDM4C[35]被發(fā)現(xiàn)在TNBC中與ADM耐藥相關(guān)。circGFRA1[36]被報道可能是導(dǎo)致TNBC細(xì)胞對PTX耐藥的重要因素。circHER2編碼一種新型蛋白質(zhì)HER2-103,因為HER2-103與HER2 CR1結(jié)構(gòu)域具有大部分相同的氨基酸序列,所以HER2-103可被HER2抗體帕妥珠單抗拮抗。帕妥珠單抗能顯著降低circ-HER2/HER2-103陽性TNBC細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性,但對不表達(dá)circ-HER2/HER2-103的TNBC細(xì)胞無影響[37]。

4 環(huán)狀RNA在TNBC的臨床意義

4.1 TNBC的診斷和預(yù)后標(biāo)志物

早期篩查和診斷可提高TNBC的療效,降低TNBC患者的死亡率。環(huán)狀RNA存在以下特征:①因其末端的閉環(huán)結(jié)構(gòu),環(huán)狀RNA比線性RNA更為穩(wěn)定;②在組織中廣泛表達(dá),部分環(huán)狀RNA的表達(dá)水平比其親本基因的mRNA更高;③存在組織以及階段的特異性,部分環(huán)狀RNA的組織特異性比其親本基因的mRNA更高。由于環(huán)狀RNA在構(gòu)象、穩(wěn)定性、豐度、時空特異性表達(dá)和免疫原性上都不同于mRNA,與其他標(biāo)志物相比,環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)志物可能具有更好的分析有效性[38]。研究報道,TNBC患者的乳腺組織標(biāo)本和體液中可檢測到不同的特異性環(huán)狀RNA,這些環(huán)狀RNA有可能作為理想的TNBC診斷標(biāo)志物,在TNBC活檢方面有極大的應(yīng)用前景[39]。此外,與生存期和臨床病理特征相關(guān)的環(huán)狀RNA可能是TNBC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。研究證實,環(huán)狀RNA的表達(dá)與TNBC的臨床參數(shù)顯著相關(guān),包括腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、TNM分期、總生存期和無病生存期等,已有報道21種環(huán)狀RNA對TNBC患者具有預(yù)后價值[25]。馮晴等[40]發(fā)現(xiàn),血清miR-21、miR-30b對乳腺癌患者術(shù)后曲妥珠單抗靶向治療心臟毒性具有很好的預(yù)測價值。本團(tuán)隊發(fā)現(xiàn),circKIF4A與腫瘤分級、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),是TNBC的獨(dú)立預(yù)后因素,而circFBXW7的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[29]。

4.2 TNBC的潛在治療靶點(diǎn)

環(huán)狀RNA通過扮演促癌因子或抑癌因子的角色,參與了TNBC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡,以及TNBC血管生成和耐藥等過程[25]。因此,環(huán)狀RNA可作為TNBC的潛在治療靶點(diǎn)。針對促癌的環(huán)狀RNA反向剪接位點(diǎn)設(shè)計小干擾RNA和互補(bǔ)的反義寡核苷酸,使用CRISPR-Cas9編輯來誘導(dǎo)促癌環(huán)狀RNA失活,或者通過遞送含有重復(fù)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)狀RNA增加抑癌環(huán)狀RNA的含量,將可能產(chǎn)生顯著的抑癌作用。He等[41]證明,尾靜脈注射靶向ciRS-7的小干擾RNA可以抑制TNBC細(xì)胞在體內(nèi)肝和肺轉(zhuǎn)移,這表明促癌的ciRS-7有可能成為TNBC治療的潛在治療靶點(diǎn);隨著技術(shù)的發(fā)展,細(xì)胞外囊泡和納米粒子可用于增強(qiáng)環(huán)狀RNA在體內(nèi)的導(dǎo)入或傳遞過程。對于編碼蛋白的環(huán)狀RNA,可以在其開放閱讀框前加入IRES元件,極大地提高編碼蛋白的表達(dá)水平,具有產(chǎn)生腫瘤抑制蛋白、腫瘤特異性抗體或免疫刺激細(xì)胞因子等潛力[42]。干擾耐藥相關(guān)環(huán)狀RNA也可能影響TNBC患者對化療的敏感性。circGFRA1通過TLR4通路促進(jìn)TNBC對PTX的耐藥。在PTX處理的TNBC PDX小鼠模型中,與對照組小鼠相比,敲低circGFRA1組小鼠的TLR4表達(dá)量降低,腫瘤的體積也縮小[36]。

5 結(jié)語與展望

環(huán)狀RNA參與TNBC的發(fā)生發(fā)展及耐藥過程。但由于環(huán)狀RNA的研究進(jìn)展大多發(fā)生在近十年間,其作用機(jī)制和功能尚存在疑點(diǎn)和爭議,合成技術(shù)和研究方法存在局限性,與腫瘤驅(qū)動基因之間的關(guān)系仍未明確。此外,有學(xué)者提出,那些低豐度的環(huán)狀RNA很可能是剪接過程的副產(chǎn)物,且?guī)缀鯖]有功能[43];但這些低豐度環(huán)狀RNA存在序列同源折疊,這給目前的環(huán)狀RNA的檢測和定量方法帶來了挑戰(zhàn)。盡管天然環(huán)狀RNA的作用和合成的環(huán)狀RNA生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步探索,但目前環(huán)狀RNA作為一類新興的腫瘤生物標(biāo)記物、RNA治療藥物和疫苗已展示出廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的發(fā)展及臨床試驗的進(jìn)行,基于環(huán)狀RNA的應(yīng)用將得以開展,為TNBC患者帶來可靠的生物標(biāo)記物和新的治療靶點(diǎn)。