黃麗, 龔豪, 張春蓮

十堰市太和醫(yī)院 1.婦科,2.腎病內(nèi)科,湖北十堰442000

宮頸癌是常見的婦科癌癥之一,全球每年有60多萬新增病例,并造成約34萬女性死亡[1],宮頸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是宮頸癌患者的主要死亡原因,研究該機(jī)制可為宮頸癌治療提供新見解。miRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá),miRNA表達(dá)失調(diào)參與宮頸癌進(jìn)展[2]。miR-519b-3p被認(rèn)為是結(jié)直腸癌、肺腺癌的腫瘤抑制劑,其上調(diào)可降低腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力,抑制腫瘤發(fā)生[3-4]。然而,miR-519b-3p在宮頸癌中的功能及其作用機(jī)制尚不清楚。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是由免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生的多效細(xì)胞因子,可激活I(lǐng)L-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transduction and transcription activating factor 3,STAT3)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)過程[5-6]。下調(diào)IL-6/STAT3通路可通過抑制宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)和增殖、誘導(dǎo)凋亡來抑制宮頸癌進(jìn)展[7-8]。據(jù)此,本研究以IL-6/STAT3通路為切入點(diǎn),探討miR-519b-3p對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,以期為宮頸癌治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本、細(xì)胞和試劑

收集本院2020年3月—2022年3月63例宮頸癌手術(shù)患者(年齡48～68歲,其中宮頸鱗癌55例,宮頸腺癌8例)的宮頸癌標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織,并置于-80 ℃保存。所有患者在術(shù)前未接受任何治療,且簽署書面知情同意書。本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了本研究。

宮頸癌SiHa細(xì)胞購自無錫欣潤生物公司;TRIzol試劑、Annexin V-FITC/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、兔E-鈣黏蛋白(E-cadherin)多抗(abs130068)購自上海愛必信生物公司;miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA通用SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物公司;miR-519b-3p模擬物及模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)購自上海吉滿生物科技公司;重組人IL-6(recombinant human IL-6,RhIL-6)蛋白(ab101044)、羊抗兔IgG(ab205718)、兔B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)多抗(ab196495)、兔STAT3多抗(ab226942)、兔p-STAT3單抗(ab267373)、兔Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)多抗(ab263897)、兔GAPDH多抗(ab37168)、兔N-cadherin單抗(ab18203)購自上海艾博抗生物公司。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-519b-3p表達(dá)

用TRIzol試劑分離宮頸癌組織和癌旁組織總RNA,用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再用miRNA通用SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR。miR-519b-3p上游引物5′-GGTCAAGTGACACCGTCG-3′,下游引物5′-TGCAGCTGGGGGTCAG-3′;U6上游引物5′-GTGATCACTCCCTGCCTGAG-3′,下游引物5′-GGACTTCACTGGACCAGACG-3′。采用2-ΔΔCT方法定量miR-519b-3p表達(dá)水平。

1.3 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)和分組

采用含1%青霉素和鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM,在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育SiHa細(xì)胞。每周換液2～3次,1∶3傳代。在24孔板中接種1×104個(gè)/孔對(duì)數(shù)期SiHa細(xì)胞,用Lipo2000將40 nmol/L miR-519b-3p模擬物、40 nmol/L miR-NC分別轉(zhuǎn)染50%匯合度細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染48 h的SiHa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染miR-519b-3p模擬物、轉(zhuǎn)染miR-NC的SiHa細(xì)胞分別記為miR-519b-3p組、miR-NC組;用5 g/L RhIL-6[8]處理轉(zhuǎn)染miR-519b-3p模擬物或轉(zhuǎn)染miR-NC的SiHa細(xì)胞,分別記為miR-519b-3p+RhIL-6組、miR-NC+RhIL-6組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組SiHa細(xì)胞,在預(yù)冷PBS中重懸,室溫1 000 r/min離心5 min,然后用含5 μL AnnexinV-FITC和5 μL碘化丙啶的500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,室溫避光孵育15 min。通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

將含10%胎牛血清的500 μL DMEM置于24孔板下室,將用無血清DMEM重懸的200 μL細(xì)胞懸液加入到包被(侵襲)或未包被(遷移)基質(zhì)膠的Transwell板上室。培養(yǎng)24 h后,用甲醇固定遷移或侵襲細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.6 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白水平

用RIPA法提取細(xì)胞中總蛋白,通過SDS-PAGE分離等量蛋白質(zhì),然后將樣品濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。封閉膜后,與一抗(E-cadherin、STAT3和Bcl-2為1∶2 000稀釋,N-cadherin、p-STAT3、Bax和GAPDH為1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜,然后與二抗(1∶3 000稀釋)在室溫下孵育1 h,化學(xué)發(fā)光試劑盒使蛋白條帶顯色。Image-ProPlus軟件分析目的條帶相對(duì)灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-519b-3p在宮頸癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織比較,宮頸癌組織miR-519b-3p表達(dá)下調(diào)(P<0.05;圖1)。

圖1 宮頸癌組織和癌旁組織miR-519b-3p表達(dá)的比較a為P<0.05,與癌旁組織比較。

2.2 miR-519b-3p轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

與轉(zhuǎn)染miR-NC比較,轉(zhuǎn)染miR-519b-3p模擬物后SiHa細(xì)胞miR-519b-3p表達(dá)顯著升高(3.21±0.25比1.00±0.14;P<0.05),表明轉(zhuǎn)染miR-519b-3p模擬物能夠促進(jìn)miR-519b-3p表達(dá)。

2.3 各組SiHa細(xì)胞凋亡率的比較

與miR-NC組比較,miR-519b-3p組SiHa細(xì)胞凋亡率升高,miR-NC+RhIL-6組細(xì)胞凋亡率降低;與miR-519b-3p組比較,miR-519b-3p+RhIL-6組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05;圖2)。

圖2 各組宮頸癌SiHa細(xì)胞凋亡率的比較1為miR-NC組;2為miR-519b-3p組;3為miR-NC+RhIL-6組;4為miR-519b-3p+RhIL-6組。a為P<0.05,與miR-NC組比較;b為P<0.05,與miR-519b-3p組比較。

2.4 各組SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的比較

與miR-NC組比較,miR-519b-3p組SiHa細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少,miR-NC+RhIL-6組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加;與miR-519b-3p組比較,miR-519b-3p+RhIL-6組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)增加(P<0.05;圖3)。

圖3 各組宮頸癌SiHa細(xì)胞遷移、侵襲的比較(結(jié)晶紫染色,200×)1為miR-NC組;2為miR-519b-3p組;3為miR-NC+RhIL-6組;4為miR-519b-3p+RhIL-6組。a為P<0.05,與miR-NC組比較;b為P<0.05,與miR-519b-3p組比較。

2.5 各組SiHa細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

與miR-NC組比較,miR-519b-3p組Bax和E-cadherin蛋白水平升高,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平降低;miR-NC+RhIL-6組Bax和E-cadherin蛋白水平降低,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05);與miR-519b-3p組比較,miR-519b-3p+RhIL-6組Bax和E-cadherin蛋白水平降低,Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平升高(P<0.05;圖4)。

圖4 各組宮頸癌SiHa細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較1為miR-NC組;2為miR-519b-3p組;3為miR-NC+RhIL-6組;4為miR-519b-3p+RhIL-6組。a為P<0.05,與miR-NC組比較;b為P<0.05,與miR-519b-3p組比較。

3 討 論

miRNA是具有調(diào)控作用的小RNA分子,其通過靶向下游信使RNA或調(diào)節(jié)多種信號(hào)途徑影響細(xì)胞過程參與癌癥進(jìn)展,恢復(fù)腫瘤中抑癌miRNA水平或降低致癌miRNA水平是一種有前景的癌癥替代治療策略[9]。多項(xiàng)研究揭示了miR-519b-3p在結(jié)直腸癌中的作用,通過上調(diào)miR-519b-3p表達(dá)可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,抑制其侵襲和增殖,提高直腸癌細(xì)胞體外放化療的反應(yīng)性[10-12]。miR-519b-3p在喉癌組織中低表達(dá),并通過下調(diào)COX-2蛋白水平抑制癌細(xì)胞生長[13]。此外,有報(bào)道發(fā)現(xiàn),氧化槐果對(duì)宮頸癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)和遷移抑制作用可能與上調(diào)miR-519b-3p水平有關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-519b-3p在宮頸癌組織中低表達(dá),過表達(dá)miR-519b-3p導(dǎo)致SiHa細(xì)胞凋亡水平升高,遷移和侵襲能力降低,同時(shí)伴隨著抗凋亡Bax蛋白水平上調(diào)和促凋亡Bcl-2蛋白水平下調(diào),證實(shí)miR-519b-3p在宮頸癌中發(fā)揮凋亡促進(jìn)和遷移侵襲抑制作用。EMT賦予癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力,在此過程中上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞,上皮細(xì)胞標(biāo)志物(如E-cadherin)表達(dá)減少,而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如N-cadherin)表達(dá)增加[15]。為進(jìn)一步揭示miR-519b-3p抗遷移和侵襲機(jī)制,本研究探討miR-519b-3p在宮頸癌EMT中的功能發(fā)現(xiàn),與細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果一致,過表達(dá)miR-519b-3p顯著下調(diào)N-cadherin表達(dá),上調(diào)E-cadherin表達(dá)。

IL-6家族在調(diào)控人類癌癥的發(fā)生、進(jìn)展和復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用,炎癥細(xì)胞因子IL-6可激活STAT3調(diào)控細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和凋亡[16]。據(jù)報(bào)道,IL-6/STAT3通路組分的表達(dá)水平與肺癌患者的預(yù)后相關(guān)[17]。IL-6/STAT3信號(hào)通路通過靶向腫瘤干細(xì)胞介導(dǎo)肝癌對(duì)索拉非尼的耐藥性[18]。敲除長鏈非編碼RNA THOR可抑制IL-6/STAT3通路從而抑制卵巢癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[19]。另外,在宮頸癌中長鏈非編碼-UICC通過激活I(lǐng)L-6/STAT3通路在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[20]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-519b-3p過表達(dá)導(dǎo)致SiHa細(xì)胞中p-STAT3水平降低,表明miR-519b-3p可抑制宮頸癌中IL-6/STAT3通路活化。RhIL-6處理可逆轉(zhuǎn)miR-519b-3p誘導(dǎo)的p-STAT3水平降低,同時(shí)逆轉(zhuǎn)miR-519b-3p過表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞遷移、凋亡、侵襲和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,這提示miR-519b-3p通過抑制IL-6/STAT3通路進(jìn)而抑制宮頸癌進(jìn)展。

綜上,本研究證實(shí)miR-519b-3p在宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-519b-3p可通過抑制IL-6/STAT3通路來增加宮頸癌細(xì)胞凋亡并抑制其遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明宮頸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制,并為其治療提供新的理論依據(jù)。