張敬, 劉殿卿, 黃菲, 李欣, 盧東

1.唐山市中心血站檢驗(yàn)科,河北唐山063000;2.唐山市婦幼保健院檢驗(yàn)科,河北唐山063000;3.唐山市工人醫(yī)院檢驗(yàn)科,河北唐山063000

呼吸道感染包含細(xì)菌感染及病毒感染,病毒感染占比較高,經(jīng)病毒感染后的患兒繼發(fā)細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)也較高[1-2]。蘭菌凈、泛福舒及必思添等細(xì)菌溶解產(chǎn)物為臨床常用疫苗,但這類疫苗菌種均來自國(guó)外,并非中國(guó)呼吸道感染的常見菌種,因此可能并不完全適用于中國(guó)人群[3-4]。另外,進(jìn)口疫苗價(jià)格較為昂貴,不利于普及,從而對(duì)疫苗接種率造成影響,因此制備適用于中國(guó)小兒呼吸道感染疾病的疫苗具有重要意義。研究表明,溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌均為中國(guó)呼吸道感染的常見病菌[5-6]。本研究采用以上6種常見病菌制成聯(lián)合疫苗,并探討其對(duì)免疫效果的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

CCK-8試劑(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司),RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司),細(xì)胞分離液(北京金克隆生物技術(shù)有限公司),多聚甲醛(北京金克隆生物技術(shù)有限公司),γ干擾素(interferon-γ,INF-γ)及白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司),蛋白胨溶液(上海源葉生物科技有限公司),75%乙醇(蘇州嘉鼎化學(xué)科技有限公司),10%雞紅細(xì)胞懸液(南京澤維爾生物科技有限公司),磷酸鹽緩沖液(上海之禮生物科技有限公司),2,4-二硝基氟苯(山東西亞化學(xué)科技有限公司)。超聲波破碎儀(北京星越天成科技有限公司),生物安全柜(青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司),高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠),平板離心機(jī)(蘇州盛斯?fàn)枡C(jī)械制造有限公司),高壓消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司),二氧化碳(CO2)孵孕箱(天津開關(guān)照明廠),全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司),分光光度計(jì)(南京菲勒儀器有限公司),光學(xué)顯微鏡(日本奧林帕斯公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)。

1.2 血液、菌種及動(dòng)物

血液及菌種均由本院提供,其中血液標(biāo)本為健康兒童外周血,菌種標(biāo)本為痰液樣本,取自反復(fù)呼吸道感染的患兒。40只SPF級(jí)小鼠購(gòu)自北京華阜康公司,雌雄各20只,6～8周齡,體質(zhì)量18～22 g。納入標(biāo)準(zhǔn):①患兒滿足《反復(fù)呼吸道感染的臨床概念和處理原則》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn);②患兒存有反復(fù)呼吸道感染的既往史;③患兒年齡5～13歲。

1.3 細(xì)菌聯(lián)合疫苗制備

從痰液樣本中將菌種分離培養(yǎng),生理鹽水沖洗所獲菌種(溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌);采用超聲波破碎儀分別將不同細(xì)菌破碎;將蛋白質(zhì)沉淀后透析,采用分光光度計(jì)測(cè)量蛋白水平,并以細(xì)菌蛋白作為抗原;將所獲細(xì)菌蛋白與0.9%生理鹽水混合,制備成聯(lián)合疫苗。根據(jù)聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度分為對(duì)照組(生理鹽水)、低水平組(0.1 g/L疫苗)、中水平組(0.3 g/L疫苗)及高水平組(0.5 g/L疫苗)[8]。

1.4 體外實(shí)驗(yàn)

1.4.1 單個(gè)核細(xì)胞懸液制備 取20 mL外周血樣本,抗凝,20 mL磷酸鹽緩沖液混勻;將混勻液均勻置于細(xì)胞分離液表面;梯度離心20 min,2 000 r/min;收集白膜層,采用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3次,每次離心10 min,2 000 r/min;去除上清液,經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基吹打,制成所需單個(gè)核細(xì)胞懸液。

1.4.2 單個(gè)核細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取96孔平板培養(yǎng)板,采用RPMI-1640培養(yǎng)基將單個(gè)核細(xì)胞懸液調(diào)至1×106個(gè)/mL,并依次每孔接種100 μL;加入相應(yīng)質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.5 g/L)聯(lián)合疫苗,同時(shí)設(shè)置等體積陰性對(duì)照孔;完成后置于37 ℃及5%CO2的孵孕箱中,分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí),向每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h;采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處光密度值,反映細(xì)胞增殖活性。

1.4.3 單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞表型變化測(cè)定 取24孔平板培養(yǎng)板及單個(gè)核細(xì)胞懸液,采用RPMI-1640培養(yǎng)基將單個(gè)核細(xì)胞懸液調(diào)至5×106個(gè)/mL,依次每孔接種2.0 mL;每孔標(biāo)號(hào),依次為1～48號(hào),將1～12號(hào)設(shè)置為對(duì)照組,13～24號(hào)設(shè)置為低水平組,24～36號(hào)設(shè)置為中水平組,37～48號(hào)設(shè)置為高水平組。低、中、高水平組每孔滴加0.1 mL的0.1、0.3、0.5 g/L聯(lián)合疫苗,對(duì)照組每孔加入0.1 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)6天,將細(xì)胞懸液取出,離心5 min,1 500 r/min;采用磷酸鹽緩沖液洗滌;加入相應(yīng)熒光素標(biāo)記的抗CD4、抗CD8及抗CD19抗體,隨后在避光環(huán)境下孵育30 min;孵育結(jié)束后以磷酸鹽緩沖液洗滌2次;采用1%多聚甲醛固定,流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+、CD8+及CD19+。

1.4.4 細(xì)胞因子測(cè)定 在測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞增殖活性前,取上清液50 μL,隨后繼續(xù)培養(yǎng),并在第2、第4、第8天采用INF-γ及IL-2試劑盒測(cè)定INF-γ及IL-2含量。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 造模處理 將40只SPF級(jí)小鼠分為4組,每組10只,且雌雄各一半,根據(jù)所用聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度分為對(duì)照組、低水平組、中水平組及高水平組[8];全部小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)10天,隨后低水平組、中水平組及高水平組小鼠每天上午灌服0.2 mL對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的聯(lián)合疫苗,對(duì)照組則在相同時(shí)間灌服0.2 mL生理鹽水;灌服10天后處死全部小鼠。

1.5.2 遲發(fā)型超敏反應(yīng)測(cè)定 各組小鼠處理9天后,取50 μL 1%的2,4-二硝基氟苯涂抹于小鼠右耳前后兩面,隨后左耳涂抹等量丙酮-橄欖油;24 h后處死小鼠,采用8 nm打孔器分別在左右耳同一部位打下圓耳片,并進(jìn)行稱重;腫脹度=右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量。

1.5.3 脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)測(cè)定 對(duì)處死小鼠稱重,完成后取出脾臟及胸腺,清理表面血液后,對(duì)脾臟及胸腺進(jìn)行稱重;脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.5.4 巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定 各組小鼠處理7天后,將1%蛋白胨溶液注射至小鼠腹腔,1次/天,3天。第3天注射結(jié)束后,間隔24 h,并將10%的雞紅細(xì)胞懸液1 mL注射至小鼠腹部,30 min后處死小鼠,并再次向小鼠腹腔注射2 mL生理鹽水;揉按小鼠腹腔1 min,將腹腔內(nèi)液體混勻;混勻后取1 mL腹腔液;將所取腹腔液均勻涂抹于載玻片,置于37 ℃恒溫箱孵育30 min,固定,染色,沖洗,晾干后于顯微鏡下觀察。吞噬指數(shù)=雞紅細(xì)胞被吞噬數(shù)/巨噬細(xì)胞數(shù)。

1.5.5 血清溶血素含量測(cè)定 各組小鼠灌注聯(lián)合疫苗3天后,小鼠腹部注射1 mL 10%雞紅細(xì)胞懸液。免疫結(jié)束后,處死小鼠并摘取其眼球取血;離心,取血清,生理鹽水稀釋500倍;將10%雞紅細(xì)胞懸液、1 mL稀釋血清在同一試管內(nèi)混勻;將混勻液作為對(duì)照;取混勻液,放置于37 ℃恒溫水浴下30 min,冰浴;離心后取上清液,采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)量光密度(optical density,OD)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 聯(lián)合疫苗對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活性的影響

各組單個(gè)核細(xì)胞增殖活性均隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高,并且在相同時(shí)間內(nèi),聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度越高,單個(gè)核細(xì)胞增殖活性越高(P<0.05;表1)。

表1 聯(lián)合疫苗對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖活性O(shè)D值的影響

2.2 聯(lián)合疫苗對(duì)單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞表型的影響

與對(duì)照組比較,低、中、高水平組單個(gè)核細(xì)胞CD4+、CD19+水平升高,CD8+水平降低,且隨著聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度升高,各指標(biāo)水平變化越明顯(P<0.05;表2)。

表2 聯(lián)合疫苗對(duì)單個(gè)核細(xì)胞淋巴細(xì)胞表型的影響 %

2.3 聯(lián)合疫苗對(duì)細(xì)胞因子的影響

各組INF-γ及IL-2水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高,并且在相同時(shí)間內(nèi),聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度越高,INF-γ及IL-2水平越高(P<0.05;表3)。

表3 聯(lián)合疫苗對(duì)細(xì)胞因子的影響 ng/L

2.4 聯(lián)合疫苗對(duì)小鼠各免疫性指標(biāo)水平影響

與對(duì)照組比較,低、中、高水平組腫脹度、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、吞噬指數(shù)及血清溶血素水平均升高,且隨著聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度升高而升高(P<0.05;表4)。

表4 聯(lián)合疫苗對(duì)小鼠各免疫性指標(biāo)水平的影響

3 討 論

中國(guó)呼吸道感染發(fā)病率較高,且兒童發(fā)病率高于成人,臨床上常采用抗菌藥物進(jìn)行治療,但導(dǎo)致各類致病菌耐藥性均有所升高[9-10]。因此需采用有效的預(yù)防措施以降低呼吸道感染發(fā)病率。接種疫苗為預(yù)防疾病的重要措施,但目前中國(guó)所接種疫苗主要為進(jìn)口疫苗,因其價(jià)格較為昂貴,從而影響接種率,同時(shí)預(yù)防效果亦需經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究[11-12]。

本次研究采用溶血性鏈球菌、流感嗜血桿菌B型、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌等中國(guó)呼吸道感染常見的6種病菌制成聯(lián)合疫苗,從而對(duì)預(yù)防中國(guó)呼吸道感染疾病更具有針對(duì)性。本研究結(jié)果顯示,單個(gè)核細(xì)胞增殖活性隨聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度與培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高,說明在本次實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)量濃度區(qū)間,質(zhì)量濃度升高可提高單個(gè)核細(xì)胞增殖活性。由于單個(gè)核細(xì)胞可通過吞噬病原體及產(chǎn)生細(xì)胞因子等方式參與免疫反應(yīng),故當(dāng)單個(gè)核細(xì)胞增殖活性越高則反映機(jī)體對(duì)免疫刺激具有較強(qiáng)應(yīng)答功能[13-14]。王國(guó)征等[15]研究表明,單個(gè)核細(xì)胞增殖活性越高,則利于促進(jìn)細(xì)胞因子分泌,而本研究亦發(fā)現(xiàn)各組INF-γ及IL-2水平均隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高,并且在相同時(shí)間內(nèi),聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度越高,INF-γ及IL-2水平越高。INF-γ具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、增強(qiáng)抗菌能力和促進(jìn)細(xì)胞毒性的功能,并且其不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫,亦參與體液免疫調(diào)節(jié)過程中[16]。IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、分化及生存,同時(shí)亦可刺激B細(xì)胞增殖及抗體產(chǎn)生,從而增強(qiáng)體液免疫效應(yīng)[17]。因此,當(dāng)INF-γ及IL-2水平升高時(shí),則提示聯(lián)合疫苗能增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性,利于調(diào)動(dòng)免疫功能,并起到預(yù)防呼吸道感染作用。另外,CD4+及CD8+均為T細(xì)胞表面產(chǎn)物,CD19+為B細(xì)胞表面產(chǎn)物,三者均參與了細(xì)胞及體液免疫,當(dāng)CD4+及CD19+水平升高及CD8+水平降低,則可表明機(jī)體免疫功能越高[18-19]。本研究結(jié)果顯示,隨著聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度的增加,小鼠體內(nèi)CD4+及CD19+水平均增加,CD8+水平降低;提示接種聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度越高,對(duì)細(xì)胞及體液免疫調(diào)節(jié)能力越強(qiáng),小鼠免疫功能越高。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)由T細(xì)胞介導(dǎo),可對(duì)免疫功能進(jìn)行衡量,因此當(dāng)腫脹度越高,則提示遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度越高,免疫功能越強(qiáng)[20]。脾臟及胸腺可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞以應(yīng)對(duì)感染等,當(dāng)脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)升高,則提示免疫反應(yīng)增強(qiáng)[21]。吞噬指數(shù)可反映巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)外來病菌吞噬及清除能力。溶血素參與了機(jī)體對(duì)抗感染及清除病菌的免疫反應(yīng)[22],因此當(dāng)血清溶血素水平升高,則代表機(jī)體的免疫反應(yīng)越高。本研究結(jié)果顯示,隨著接種聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度的增加,小鼠的腫脹度、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、吞噬指數(shù)、血清溶血素水平均升高;提示接種聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度越高,小鼠的體液免疫功能越強(qiáng)。

綜上,呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗有利于提高細(xì)胞及體液免疫能力,且在呼吸道感染細(xì)菌聯(lián)合疫苗質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí),可獲得的免疫效果最佳。