潘良文，寧 雪，王 強(qiáng)，蔡一村，許鎮(zhèn)堅(jiān)，張 晨

（上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135）

肉類摻假是影響食品安全的一個(gè)重要方面。一些不法企業(yè)和商人經(jīng)常將低價(jià)肉類原料摻入到高價(jià)肉制品中以牟取暴利，侵害消費(fèi)者權(quán)益，擾亂市場(chǎng)秩序。肉及肉制品真?zhèn)舞b別主要是基于DNA序列的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）、數(shù)字PCR和DNA條形碼等。我國(guó)現(xiàn)行的動(dòng)物源性成分鑒定標(biāo)準(zhǔn)繁多（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等），各種鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)不能有效統(tǒng)一。表1是我國(guó)現(xiàn)行有效的主要?jiǎng)游锍煞謾z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)還不包括一些地方標(biāo)準(zhǔn)。

表1 我國(guó)現(xiàn)行有效的部分主要?jiǎng)游锍煞謾z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 China’s current standards for detection of main animalderived materials

國(guó)內(nèi)的動(dòng)物成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，國(guó)際上此前也沒(méi)有統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。為保證動(dòng)物源性制品國(guó)際國(guó)內(nèi)貿(mào)易的順利進(jìn)行，需要建立統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。為此，上海海關(guān)向國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）申請(qǐng)立項(xiàng)建立動(dòng)物成分檢測(cè)的ISO標(biāo)準(zhǔn)，ISO組織專門(mén)設(shè)立了一個(gè)工作組（食品技術(shù)委員會(huì)/分子生物標(biāo)記/肉類物種鑒別工作組（ISO/TC34/SC16/WG8））。通過(guò)研究，ISO組織于2020年7月發(fā)布了由上海海關(guān)主持制定的食品和飼料中牛、綿羊、豬、雞、山羊、馬、驢等動(dòng)物成分檢測(cè)的ISO標(biāo)準(zhǔn)：ISO/TS 20224-1:2020[23]、ISO/TS 20224-2:2020[24]、ISO/TS 20224-3:2020[25]、ISO/TS 20224-4:2020[26]、ISO/TS 20224-5:2020[27]、ISO/TS 20224-6:2020[28]、ISO/TS 20224-7:2020[29]。

火雞是一種用作食品原料的重要禽類，與其他肉類相比蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量和膽固醇的含量較低?；痣u肉價(jià)格較高，在加工食品中，容易被雞、鴨等價(jià)格較低的肉類混雜假冒，也容易被混雜假冒其他價(jià)格較高的肉類，如牛、羊肉，因此有必要建立火雞成分的檢測(cè)方法。

在國(guó)外，Martín等[30]利用12S rRNA線粒體基因、Kesmen等[31]利用線粒體NADH脫氫酶亞基2基因、Pegels等[32]利用線粒體DNA控制區(qū)和12S rRNA基因區(qū)域的特異性序列建立了火雞成分的real-time PCR檢測(cè)方法，Shehata等[33]基于線粒體DNA序列建立了微粒式數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法；在國(guó)內(nèi)，張舒亞等[34]利用線粒體12S rRNA基因建立了火雞成分的real-time PCR檢測(cè)方法，李偉琦等[35]利用TGF-β3基因序列建立了適用于微滴式數(shù)字PCR和芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)的火雞成分的定量檢測(cè)方法。

real-time PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，到目前為止，該方法在日常檢測(cè)中一直是檢測(cè)動(dòng)物成分的最常用的方法。在本研究完成之前，國(guó)際上沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的火雞成分檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇火雞染色體Z DNA序列的單拷貝的保守性的特異片段作為檢測(cè)靶序列，建立了real-time PCR檢測(cè)方法，完成國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了方法的假陽(yáng)性率、假陰性率、絕對(duì)檢測(cè)限和檢出概率（probability of detection，POD），制訂出火雞成分檢測(cè)的ISO標(biāo)準(zhǔn)（ISO/TS 20224-8:2022）[36]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家火雞（Meleagris gallopavo domesticus）品種尼古拉、青銅、貝蒂娜，由山東嘉祥征博特種動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供；家火雞品種荷蘭白、黑火雞、石板青、波朋、眼斑火雞（Meleagris ocellata）肉，由美國(guó)佛羅里達(dá)愛(ài)立生家庭農(nóng)場(chǎng)提供；歐洲家鵝（Anser anser domesticus）、中國(guó)家鵝（Anser cygnoides domesticus）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos）DNA，由揚(yáng)州大學(xué)提供；印度瘤牛（Bos indicus）、牦牛（Bos mutus）、普通牛（Bos taurus）、水牛（Bubalus bubalis）血液，由云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院提供；美洲野牛DNA，由美國(guó)國(guó)家野生動(dòng)物研究中心提供；金魚(yú)（Carassius auratus）、番鴨（Cairina moschata）、駱駝（Camelus bactrianus）、狗（Canis familiaris）、山羊（Capra hircus）、麋鹿（Cervus canadensis）、鴿（Columba livia）、鵪鶉（Coturnix coturnix）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）、驢（Equus asinus）、馬（Equus caballus）、驢（Equus caballus×asinus）、貓（Felis catus）、雞（Gallus gallus）、恒河猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、鱒魚(yú)（Onchorhynchus mmaykiss）、兔子（Oryctolagus cuniculus）、綿羊（Ovis aries）、野雞（Phasianus colchicus）、大鼠（Rattus norvegicus）、鴕鳥(niǎo)（Struthio camelus）、豬（Sus scrofa domesticus）；油菜籽（Brassica rapa）、大豆（Glycine max）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays），來(lái)自本單位收集的樣本。

通過(guò)NCBI中BLAST功能進(jìn)行序列對(duì)比分析，選擇火雞染色體Z DNA序列的物種特異性單拷貝片段作為檢測(cè)靶序列，其位置信息見(jiàn)表2。利用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)出real-time PCR檢測(cè)的引物和探針，序列信息見(jiàn)表3，引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 檢測(cè)靶序列位置信息Table 2 Location information of detection target sequence

表3 本實(shí)驗(yàn)所用的引物和探針序列Table 3 Sequences of primers and probes used in this study

real-time PCR試劑2×PCR Master Mix預(yù)混液（貨號(hào)：4369016）美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；普通PCR試劑2×PCR Master Mix預(yù)混液（貨號(hào)：B639295）生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA分子質(zhì)量標(biāo)記DL2000（貨號(hào)：3427A）寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPEX 6850型冷凍碾磨機(jī) 美國(guó)SPEX SamplePrep公司；QX100微粒式數(shù)字PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ABI ViiA7 real-time PCR儀、NanoDrop 2000微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；5425小型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UFE500AO型烘箱德國(guó)Memeert公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和核酸提取

樣品碾磨：對(duì)于肉類產(chǎn)品，先切碎，然后在烘箱80 ℃干燥72 h，再使用冷凍碾磨機(jī)粉碎成超細(xì)粉末。

核酸提取：使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒（DP305）對(duì)各類動(dòng)植物樣品提取，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建

將火雞的特異性擴(kuò)增片段（基因序列號(hào)NC_015041.2中57643369～57643486 bp之間118 bp的片段）與pUC57載體進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pUC57-t，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并提取質(zhì)粒DNA，用于驗(yàn)證所建立real-time PCR方法的絕對(duì)檢測(cè)限。

1.3.3 real-time PCR反應(yīng)體系和循環(huán)程序

反應(yīng)體系：25 μL反應(yīng)體系，每條引物（10 μmol/L）1 μL，探針（10 μmol/L）0.5 μL，實(shí)時(shí)熒光2×PCR Master Mix（Thermo Fisher）12.5 μL，無(wú)核酸酶和蛋白酶的重蒸水5 μL，樣品或質(zhì)粒DNA 5 μL（基因組DNA質(zhì)量濃度為20～200 ng/μL，質(zhì)粒濃度分別為：4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL）。循環(huán)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，45 個(gè)循環(huán)。

1.3.4 普通PCR反應(yīng)體系、循環(huán)程序和電泳條件

反應(yīng)體系：25 μL反應(yīng)體系，每條引物（10 μmol/L）1 μL，2×PCR Master Mix（生工生物工程（上海）股份有限公司）12.5 μL，無(wú)核酸酶和蛋白酶的重蒸水5 μL，樣品DNA 5 μL（基因組DNA質(zhì)量濃度為20～200 ng/μL）。循環(huán)程序：預(yù)變性94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳條件：220 V、20 min。

1.3.5 特異性測(cè)試

利用各種動(dòng)植物的DNA樣本，按照1.3.3節(jié)realtime PCR反應(yīng)體系和循環(huán)程序進(jìn)行檢測(cè)。按照1.3.4節(jié)普通PCR反應(yīng)體系、循環(huán)程序和電泳條件，反應(yīng)體系只加引物不加探針，進(jìn)行定性PCR測(cè)試，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確證。

1.3.6 測(cè)試

利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)含有火雞特異擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pUC57-t拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量檢測(cè)，準(zhǔn)確稀釋到1000 拷貝/μL。將定量后的樣品DNA稀釋至7 個(gè)濃度，分別為4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL，每個(gè)PCR反應(yīng)加入5 μL模板，含有靶序列的質(zhì)?？截悢?shù)分別為20、10、5、2、1、0.5、0.1 拷貝。

1.3.7 real-time PCR結(jié)果判定

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增、陰性對(duì)照和空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增時(shí)，若待測(cè)樣品出現(xiàn)S型的擴(kuò)增曲線，并且產(chǎn)生Ct值時(shí)，則樣品被判定為陽(yáng)性；若待測(cè)樣品未出現(xiàn)S型的擴(kuò)增曲線時(shí)，則被判定為陰性。

1.3.8 國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)方法要上升為ISO 標(biāo)準(zhǔn)，需要組織國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)完成對(duì)所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)ISO 20813:2019[38]的要求，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)量要求是不少于8 家，其中國(guó)外實(shí)驗(yàn)室不少于4 家。本研究邀請(qǐng)了12 家實(shí)驗(yàn)室參加了協(xié)同實(shí)驗(yàn)，其中，國(guó)外4 家分別來(lái)自德國(guó)、法國(guó)、馬來(lái)西亞、美國(guó)，國(guó)內(nèi)8 家分別來(lái)自海關(guān)、市場(chǎng)監(jiān)管、中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院等系統(tǒng)。使用儀器涉及Roche LightCycler480 II、ABI 7500、Agilent Mx3005P、ABI 7500 Fast、ABI QuanStudio 12K Flex、Bio-Rad CFX966 種品牌和型號(hào)的PCR儀。

假陽(yáng)性率和假陰性率測(cè)試：提取火雞DNA，通過(guò)數(shù)字PCR將基因組DNA稀釋至10 拷貝/μL，作為陽(yáng)性樣品。選取牛肉DNA，通過(guò)數(shù)字PCR定量至20 拷貝/μL，作為陰性樣品。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試6 個(gè)陽(yáng)性樣品和6 個(gè)陰性樣品（均為盲樣），利用所建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。收集檢測(cè)結(jié)果后，計(jì)算檢測(cè)方法的假陽(yáng)性率和假陰性率。

絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試和POD分析：將載有火雞的特異性擴(kuò)增片段的質(zhì)粒pUC57-t利用數(shù)字PCR將質(zhì)粒濃度稀釋至1000 拷貝/μL。再將質(zhì)粒人工稀釋至4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02 拷貝/μL 7 個(gè)濃度梯度，稀釋液為含有20 ng/μL的超聲粉碎鮭魚(yú)精DNA的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液。對(duì)每個(gè)濃度點(diǎn)的樣品設(shè)置6 個(gè)重復(fù)，進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，計(jì)算各濃度點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果占總樣品數(shù)的百分比。POD是指單個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用定性方法在指定濃度下對(duì)給定基質(zhì)進(jìn)行測(cè)試分析得到陽(yáng)性分析結(jié)果的概率，按照ISO/TS 16393:2019[39]和Uhlig等[40]發(fā)表的分析方法以及Quo Data在線數(shù)據(jù)分析程序（https://www.quodata.de/en/interlaboratory-studies.html#0）對(duì)絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試的結(jié)果進(jìn)行POD分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性檢測(cè)分析

使用火雞檢測(cè)方法對(duì)收集到的各類動(dòng)植物樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有家火雞和眼斑火雞檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他物種均為陰性，特別是與火雞親緣關(guān)系較近的鵪鶉、野雞也未出現(xiàn)擴(kuò)增（表4）。為了對(duì)建立的real-time PCR方法進(jìn)行確證，利用上游引物Turkey-118 bp-F和下游引物Turkey-118 bp-R，不添加探針，對(duì)以上樣品進(jìn)行定性PCR結(jié)合電泳測(cè)試，結(jié)果顯示，也只有家火雞和眼斑火雞出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，部分禽類和主要肉類動(dòng)物樣品的定性PCR產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖1。對(duì)家火雞和眼斑火雞定性PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行克隆測(cè)序，其序列均與火雞染色體Z DNA序列（GenBank序列號(hào)：NC_015041.2）的57643369～57643486 bp的序列一致，長(zhǎng)度為118 bp。使用NCBI BLAST功能對(duì)該118 bp的序列進(jìn)行搜索比對(duì)，在整個(gè)GenBank庫(kù)中只有NC_015041.2與之完全配對(duì)（圖2）。說(shuō)明利用該引物和探針建立的real-time PCR方法高度特異。

圖1 部分禽類和肉類動(dòng)物樣品PCR檢測(cè)電泳圖譜Fig.1 PCR detection electrophoresis of partial poultry and meat animal samples

圖2 火雞PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序序列BLAST結(jié)果Fig.2 BLAST results of the sequence of PCR amplicon from turkey

表4 物種特異性測(cè)試Table 4 Results of species specificity tests

特別值得一提的是，眼斑火雞與一種野火雞，主要分布于美國(guó)、墨西哥、洪都拉斯、危地馬拉等很小一部分地區(qū)的山林。眼斑火雞與家火雞同屬于火雞科火雞屬，一些國(guó)家將眼斑火雞與家火雞雜交培育出新的家火雞品種。NCBI GenBank庫(kù)中有家火雞的基因組序列，但到目前為止未見(jiàn)眼斑火雞的基因組全序列。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)眼斑火雞具有和家火雞的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，證明兩者具有相同的靶序列。本檢測(cè)方法能同時(shí)檢測(cè)出家火雞和眼斑火雞。

2.2 種內(nèi)一致性測(cè)試

使用real-time PCR方法對(duì)尼古拉、青銅、貝蒂娜、荷蘭白火雞、黑火雞、石板青、波朋火雞等常見(jiàn)火雞品種進(jìn)行檢測(cè)，所有品種均檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果（表5），品種鑒定方法準(zhǔn)確率為100%。利用上游引物Turkey-118 bp-F和下游引物Turkey-118 bp-R，不添加探針，對(duì)以上樣品進(jìn)行定性PCR檢測(cè)和電泳測(cè)試。結(jié)果顯示，所有火雞品種出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果（圖3）。對(duì)這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，序列均與GenBank序列號(hào)NC_015041.2的57643369～57643486 bp的序列一致。結(jié)果表明：本檢測(cè)方法的測(cè)試結(jié)果具有良好的種內(nèi)一致性，適合于各種品種火雞的檢測(cè)。

圖3 不同火雞品種樣品的定性PCR檢測(cè)電泳圖譜Fig.3 Electrophoregrams of PCR products from various turkey breeds

表5 種內(nèi)一致性檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of intraspecies specificity tests

2.3 絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試

利用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)含有火雞特異基因片段的pUC57質(zhì)粒樣品進(jìn)行定量檢測(cè)稀釋至1000 拷貝/μL。將定量后的質(zhì)粒樣品DNA稀釋4、2、1、0.4、0.2、0.1 拷貝/μL和0.02 拷貝/μL 7 個(gè)濃度梯度。每個(gè)物種樣品每個(gè)濃度做6 次重復(fù)。結(jié)果顯示所建立的檢測(cè)方法在DNA濃度為1 拷貝/μL（5 拷貝/PCR反應(yīng)）時(shí)都能清楚檢測(cè)到特異性DNA（表6），說(shuō)明所設(shè)計(jì)的引物探針絕對(duì)檢測(cè)限可達(dá)5 拷貝/PCR反應(yīng)。

表6 絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試Table 6 Results of absolute detection limit tests

2.4 國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.4.1 假陽(yáng)性率、假陰性率驗(yàn)證

每個(gè)參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室均收到12 個(gè)盲樣，包括6 個(gè)陽(yáng)性樣品和6 個(gè)陰性樣品。共計(jì)12 個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了協(xié)同實(shí)驗(yàn)，測(cè)試樣品總數(shù)量為144 個(gè)，假陽(yáng)性率和假陰性率測(cè)試結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7。協(xié)同實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，應(yīng)用火雞成分檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性樣品全部檢出，陰性樣品全未檢出（表7），方法的假陽(yáng)性率和假陰性率均為0%，達(dá)到ISO 20813:2019標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定假陽(yáng)性率和假陰性率小于5%的要求。說(shuō)明該方法產(chǎn)生的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的可能性很低，能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表7 假陽(yáng)性率和假陰性率協(xié)同實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 7 Statistics of false positive and false negative rates in collaborative trials

2.4.2 絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試驗(yàn)證和POD分析

每個(gè)參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室均收到4、2、1、0.4、0.2、0.1、0.02拷貝/μL 7 個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA樣品各6 個(gè)，共計(jì)12 個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了協(xié)同實(shí)驗(yàn)，每一濃度點(diǎn)的測(cè)試樣品數(shù)為72 個(gè)，這些實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表8。計(jì)算各濃度點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果占該濃度點(diǎn)總樣品數(shù)的百分比，結(jié)果見(jiàn)表9。協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)PCR反應(yīng)體系中靶序列模板數(shù)分別為20、10、5、2、1、0.5、0.1 拷貝時(shí)，檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性百分比分別為100%、100%、100%、91.7%、70.1%、54.2%、16.7%。也就是說(shuō)，當(dāng)靶序列高于5 拷貝/PCR反應(yīng)時(shí)，樣品陽(yáng)性檢出率均達(dá)到100%，說(shuō)明該方法的絕對(duì)檢測(cè)限為5 拷貝/PCR反應(yīng)。

表9 絕對(duì)檢測(cè)限的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 9 Analysis of collaborative trial results for absolute detection limit

按照ISO/TS 16393:2019和Uhlig發(fā)表的分析方法以及Quo Data在線數(shù)據(jù)分析（https://www.quodata.de/en/interlaboratory-studies.html#0）對(duì)方法的絕對(duì)檢測(cè)限和POD進(jìn)行分析。所有參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)室在不同濃度稀釋點(diǎn)所測(cè)試的定性數(shù)據(jù)都被用來(lái)判斷檢測(cè)方法POD等于95%的分析（表10），實(shí)驗(yàn)室間標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30，低于最大允許值1；在95%的POD的情況下，方法的絕對(duì)檢測(cè)限為3.2 拷貝/PCR反應(yīng)，低于最大允許值20 拷貝/PCR反應(yīng)[39]。表明所建立起來(lái)的火雞成分real-time PCR檢測(cè)方法具有較低的絕對(duì)檢測(cè)限，并且結(jié)果之間偏差較小。

表10 POD的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 10 Collaborative trial results for POD

2.4.3 不同品牌和型號(hào)的PCR儀器對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室所使用的PCR儀有Roche LightCycler 480 II、ABI 7500、Agilent Mx3005P、ABI 7500 Fast、ABI QuanStudio 12K Flex、Bio-Rad CFX966 種不同品牌和型號(hào)（表11）。從表8和表11可以看出，各參加實(shí)驗(yàn)室的假陽(yáng)性、假陰性測(cè)試結(jié)果一致，在絕對(duì)檢測(cè)限（5 拷貝靶序列/PCR）反應(yīng)以上檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)出100%的陽(yáng)性率，在絕對(duì)檢測(cè)限以下的2 拷貝靶序列/PCR時(shí)，各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果也表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確性和一致性，因此不同品牌和型號(hào)儀器對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。

表11 各實(shí)驗(yàn)室使用的PCR儀的品牌和型號(hào)Table 11 Make and model of PCR instrument used in each laboratory

2.5 ISO標(biāo)準(zhǔn)制訂

課題組向ISO組織提出火雞檢測(cè)方法的新工作項(xiàng)目提案，經(jīng)ISO各成員國(guó)投票，ISO同意決定立項(xiàng)。立項(xiàng)編號(hào)為：ISO/NP 20224-8。經(jīng)過(guò)工作組草案、委員會(huì)草案、技術(shù)規(guī)范草案（Draft of Technical Specification，DTS）等不同階段投票，并根據(jù)各國(guó)專家意見(jiàn)進(jìn)行修改，多次召開(kāi)ISO/TC34/SC16/WG8工作組會(huì)議討論修改，形成最終的DTS標(biāo)準(zhǔn)草案。2022年7月，火雞real-time PCR檢測(cè)方法在DTS階段以ISO各成員國(guó)100%的贊成率獲得通過(guò)。2022年10月，ISO組織正式發(fā)布了火雞成分檢測(cè)ISO標(biāo)準(zhǔn)ISO/TS 20224-8:2022[36]。

3 結(jié)論

本研究以火雞染色體Z DNA序列的特異片段為檢測(cè)靶序列建立了火雞源性成分real-time PCR檢測(cè)方法，并對(duì)方法的特異性、靈敏度進(jìn)行測(cè)試。在此基礎(chǔ)上，組織國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)對(duì)建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。協(xié)同實(shí)驗(yàn)表明，所建立的檢測(cè)方法陽(yáng)性率、假陰性率、絕對(duì)檢測(cè)限、POD等指標(biāo)均達(dá)到ISO 20813:2019所要求的標(biāo)準(zhǔn)制定指標(biāo)。通過(guò)本研究建立了火雞源性成分real-time PCR檢測(cè)的ISO標(biāo)準(zhǔn)。