范 維，高曉月，董雨馨，劉虹宇，李賀楠，趙文濤，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，北京 100068）

淀粉一直是人們?nèi)粘ｏ嬍持休^為常見的食品?，F(xiàn)階段的淀粉已經(jīng)不局限于為人們?nèi)粘Ｅ腼兯?，更是作為一種工業(yè)原料在食品生產(chǎn)、化學化工領(lǐng)域得以廣泛使用[1-2]。目前，主要的淀粉種類有紅薯淀粉、馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉等[3]。由于各類淀粉原料成本和加工工藝不同[4-5]，使其在價格上存在明顯差異，加之不同淀粉顆粒的感官性狀，物化指標較為相近，消費者很難辨識，這就導(dǎo)致淀粉及其制品中蓄意摻假的行為越發(fā)嚴重[6-7]。這不僅給消費者帶來利益損失、干擾食品行業(yè)有序發(fā)展，更有甚者可引起食品安全問題[8]。近些年，我國深化改革，大力加強食品安全監(jiān)管和檢測技術(shù)支撐能力建設(shè)，并于2022年發(fā)布了《“十四五”推動高質(zhì)量發(fā)展的國家標準體系建設(shè)規(guī)劃》，力求通過落實“四個最嚴”要求，切實保障群眾“舌尖上的安全”。但是，目前針對淀粉中植物源性成分鑒定，我國尚無現(xiàn)行有效的標準方法，存在標準留白的情況。因此，亟需建立一種準確可靠、高通量，且便于推廣使用的淀粉種類摻假鑒別方法，為我國標準體系進一步完善添磚加瓦。

目前，國內(nèi)外對于淀粉種類摻假鑒別檢測方法的研究主要集中在近紅外光譜[9-10]、掃描電鏡[11-12]、高光譜成像[13-14]、傅里葉變換紅外光譜[15-16]等方法。如Khamsopha[17]利用近紅外高光譜成像技術(shù)對木薯淀粉中常見的摻假成分進行鑒定；常云彩等[18]利用掃描電鏡對常見的19 種食用淀粉顆粒結(jié)構(gòu)、基本特性以及摻假檢測方法進行了研究。這些方法主要是通過淀粉顆粒的性狀（如形態(tài)、結(jié)構(gòu)等）來鑒別不同的淀粉，但在實際應(yīng)用中易受到品種、產(chǎn)地、加工方式的影響，也存在依賴昂貴儀器設(shè)備、需建立復(fù)雜數(shù)學模型、對人員技術(shù)要求高等問題[19-21]。相較之下，多重實時聚合酶鏈式反應(yīng)（realtime polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)是通過分析物種基因水平上的差異鑒定其真實屬性，具有高通量，結(jié)果準確、可靠，不易受加工工藝和環(huán)境等因素影響，儀器普及率高等優(yōu)勢[22]，可作為一種有效的淀粉種類高通量鑒別標準方法在監(jiān)管部門、中小型企業(yè)及一般檢測實驗室得到推廣使用。

當前，采用real-time PCR技術(shù)對淀粉中植物源性成分進行鑒定的研究多集中在單重成分鑒定方面，如韓建勛等[23]建立了一種可快速檢測食用淀粉中木薯成分的real-time PCR法；姚曉靜等[24]利用real-time PCR技術(shù)對復(fù)配粉中馬鈴薯成分進行了鑒定。對于利用多重TaqMan探針real-time PCR技術(shù)同時檢測木薯、紅薯、馬鈴薯、玉米源性成分的研究較少。因此，本研究旨在建立一種高通量、快速、準確的木薯、紅薯、馬鈴薯、玉米源性成分多重TaqMan探針real-time PCR方法，使其可以應(yīng)用于市場上可食用淀粉及其制品的種類摻假鑒別，彌補目前標準中的空缺，以期為監(jiān)管部門開展食品安全摻假鑒別風險監(jiān)測提供強有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于對照或模擬樣品制備的27 種原料及原料制成的淀粉由北京市食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗三站提供，均為單一成分，包括：紅薯（煙薯25、普薯32、北京553）、木薯（面包木薯、華南9號、華南6068）、馬鈴薯（中薯5號、華薯1號、晉薯2號）、玉米（農(nóng)華101、登海618、京科968）、小麥、大麥、黑麥、蕎麥、大米、薏米、小米、芋頭、山藥、燕麥、蓮藕、綠豆、紅豆、黃豆、豌豆及其淀粉。用于實際樣品測定的50 份淀粉購自北京農(nóng)貿(mào)市場或超市。

深加工食品DNA提取試劑盒、多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 北京華大基因科技有限公司；試劑盒A：植物定性檢測紅薯源性成分核酸檢測試劑盒、試劑盒C：摻假摻雜木薯源性成分檢測試劑盒 廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司；試劑盒B：紅薯源性成分檢測PCR試劑盒 上海雅吉生物科技有限公司；試劑盒D：木薯源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 上海聯(lián)邁生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FTC-3000P型實時熒光PCR儀 加拿大Funglyn公司；微量核酸分析測定儀 美國BioTek公司；3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；DK-80恒溫金屬浴 上海一恒儀器有限公司；Thermostat plus振蕩器賽默飛世爾科技有限公司；ZK系列小型高速萬能粉碎機上海達平儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與TaqMan探針設(shè)計

從GenBank上查找并下載紅薯g3pdh基因（GenBank.EF119215）、木薯g3pdh基因（GenBank.MK129037）、馬鈴薯UGPase基因（GenBank.U20345）、玉米zSSIIb基因（GenBank.AF019297）序列，參考近年文獻發(fā)表的相關(guān)序列，使用SnapGene軟件進行序列比對，篩選出種內(nèi)保守、種間差異性區(qū)域片段，使用Primer Express和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物探針，再通過SnapGene軟件檢測引物和探針的可行性，具體序列見表1。植物內(nèi)參照引物及探針來自文獻[25]。

表1 實驗所用引物及TaqMan探針序列Table 1 Primer and TaqMan probe sequences used in this study

1.3.2 樣品前處理

鮮原料樣品：去皮后用自來水進行簡單沖洗，清洗掉樣品表面可能沾染的其他源性組織或細胞。取原料內(nèi)部組織，用清洗干凈的剪刀、高速粉碎機等將其研磨成糜（或粉）狀。

淀粉樣品：充分混勻后進行取樣。不同源性的樣品使用不同的器具，防止交叉污染。

1.3.3 DNA提取方法選擇

鮮原料樣品：按照植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書進行提取并測定DNA純度。

淀粉樣品：分別用深加工食品DNA提取試劑盒、多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對1.0 g淀粉進行提取，并用微量核酸分析測定儀進行DNA質(zhì)量評估，選出最適的淀粉樣品DNA提取方法。

DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間、OD260nm/OD230nm在2.0～2.4之間，可用于DNA擴增。將提取出的樣品和對照DNA均稀釋成30 ng/μL，作為擴增模板，置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 多重real-time PCR體系及擴增條件優(yōu)化

多重反應(yīng)體系為50 μ L：25 μ L 2×P C R Premix ExTaqTM；紅薯、馬鈴薯、木薯、玉米探針（10 μmol/L）加入量在0.4、0.6、0.8、1.0 μL 4 個梯度內(nèi)調(diào)整；上、下游引物（10 μmol/L）加入量在0.6、0.8、1.0 μL 3 個梯度內(nèi)調(diào)整；DNA模板2.0 μL；根據(jù)引物探針加入量補水至50 μL。依據(jù)控制變量法則，每次試驗只設(shè)一個變量，以擴增效率、特異性、靈敏度為考察依據(jù)，確定最佳多重反應(yīng)體系參數(shù)。

內(nèi)參基因反應(yīng)體系為50 μ L：25 μ L 2×P C R Premix ExTaqTM；探針（10 μmol/L）1 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL；DNA模板2.0 μL，補水至50 μL。

擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火60 s，40 個循環(huán)，在每個循環(huán)退火階段收集熒光信號。

1.3.5 多重real-time PCR特異性及包容性實驗

提取12 種目標原料（不同品種）和15 種非目標原料的DNA，并以此為模板，進行紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分的多重real-time PCR擴增，驗證本方法的特異性及包容性。

1.3.6 多重real-time PCR靈敏度實驗

分別將4 種鮮原料提取出的DNA用TE緩沖溶液進行10 倍系列梯度稀釋至3×10-3ng/μL，取同等稀釋水平的4 種DNA按等體積進行混合，以各稀釋度混合后的DNA為模板進行多重real-time PCR擴增，各稀釋度進行3 次平行，同時進行陰性和空白對照實驗。以質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct值為縱坐標制作標準曲線，并按下式計算擴增效率，以此考察該方法的DNA靈敏度。

1.3.7 多重real-time PCR檢出限實驗

1.3.7.1 不同摻入比例模擬樣品制備

以紅薯淀粉為本源，按5 個不同的質(zhì)量比（0.01%、0.1%、1%、10%、100%），分別向其中摻入木薯淀粉、馬鈴薯淀粉和玉米淀粉。不同紅薯淀粉摻入比例模擬樣品以小麥淀粉為本源。參照Chen Xiaoyu等[26]的方法進行不同比例模擬樣品的制備：使用高速破碎機將1 g木薯淀粉與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為10%的樣品（編碼為A1）；從A1樣品中取出1 g與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為1%的樣品（編碼為A2）；從A2樣品中取出1 g與9 g紅薯淀粉間歇性混合6 min，得到木薯淀粉添加量為0.1%的樣品（編碼為A3），同樣方法依次制備0.01%樣品以及其他源性混合樣品。每個樣品中兩種淀粉的總質(zhì)量為10 g，每組混合樣品設(shè)10 個平行。

1.3.7.2 檢出限測定

取不同摻入比例混合后的淀粉樣品各1.0 g進行DNA提取，并采用本實驗建立的多重real-time PCR方法進行檢測。根據(jù)≥95%置信水平法則[26]，在10 次平行實驗中，10 次結(jié)果均為檢出的最低目標源性摻入量即為該目標源性的檢出限。

1.3.8 實際樣品檢測

從農(nóng)貿(mào)市場或超市購買淀粉樣品共計50 份，包括紅薯淀粉20 份（編號1～20）、木薯淀粉10份（編號21～30）、馬鈴薯淀粉10 份（編號31～40）、玉米淀粉10 份（編號41～50）。取混勻后的各樣品1.0 g進行DNA提取，之后采用建立的多重real-time PCR方法對紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測。同時用標準方法SN/T 1198—2013《轉(zhuǎn)基因成分檢測 馬鈴薯檢測方法》[27]和SN/T 1196—2018《轉(zhuǎn)基因成分檢測 玉米檢測方法》[28]進行馬鈴薯和玉米源性結(jié)果驗證；采用試劑盒A和試劑盒B進行紅薯源性結(jié)果驗證；采用試劑盒C和試劑盒D進行木薯源性結(jié)果驗證。

1.3.9 結(jié)果判定

內(nèi)參對照、陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；空白對照、陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出，相應(yīng)Ct值＞40.0；樣品判定：熒光通道有熒光信號檢出，相應(yīng)Ct值≤40.0，判定為陽性；熒光通道無熒光信號檢出，相應(yīng)Ct值＞40.0，判定為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 引物、TaqMan探針設(shè)計結(jié)果

使用SnapGene軟件對紅薯g3pdh基因（GenBank.EF119215）、木薯g3pdh基因（GenBank.MK129037）、馬鈴薯UGPase基因（GenBank.U20345）、玉米zSSIIb基因（GenBank.AF019297）序列進行比對，并將設(shè)計的引物、探針導(dǎo)入軟件中，對其可行性進行分析，結(jié)果見圖1。所設(shè)計的4 組引物、探針均可以在各自對應(yīng)的靶基因序列中搜索到，且均在序列差異性區(qū)域內(nèi)。說明4 組引物探針可以用于紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米4 種目標源性的特異性檢測。

圖1 引物、TaqMan探針可行性分析Fig.1 Feasibility analysis of primers and TaqMan probes

2.2 DNA提取方法選擇結(jié)果

淀粉樣品本身含有大量蛋白質(zhì)、多糖等成分，且屬于經(jīng)過粉碎、精制、干燥等加工過程的深加工食品[24]，因而在DNA提取方面存在難度。為獲得高質(zhì)量的模板DNA，本實驗分別采用3 種試劑盒對其進行提取，并對提取出的DNA質(zhì)量進行評估。由表2可知，采用深加工食品DNA提取試劑盒（試劑盒A）提取的DNA，其純度（OD260nm/OD280nm及OD260nm/OD230nm）滿足real-time PCR方法對于模板DNA的要求，且在相同取樣量的條件下，試劑盒A提取出的DNA質(zhì)量濃度更高。

表2 不同DNA提取試劑盒提取效果對比Table 2 Comparison of efficiencies of different DNA extraction kits

綜上，選擇深加工食品DNA提取試劑盒（試劑盒A）進行淀粉樣品的DNA提取。

2.3 多重real-time PCR體系優(yōu)化結(jié)果

以最高擴增效率、對非目標源性無交叉反應(yīng)、高靈敏度為考察依據(jù)，對引物探針加入量進行了篩選和優(yōu)化，確定最佳多重real-time PCR反應(yīng)體系為：25 μL 2×PCR Premix ExTaqTM；紅薯、馬鈴薯、木薯探針（10 μmol/L）各0.8 μL，玉米探針（10 μmol/L）1.0 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL；DNA模板2.0 μL，補水至50 μL。

2.4 多重real-time PCR特異性及包容性實驗結(jié)果

通過12 種目標源性和15 種非目標源性的多重realtime PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3、圖2），本實驗開發(fā)的方法對常見的紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米品種均可檢出，且當添加的DNA模板初始質(zhì)量濃度為30 ng/μL時，非特異性信號Ct值均大于40.0。由此可知，建立的四重體系具有較好包容性，且對非目標源性無交叉反應(yīng)。

圖2 引物、TaqMan探針特異性效果分析Fig.2 Specificity analysis of primers and TaqMan probes

表3 方法特異性及包容性實驗結(jié)果Table 3 Specificity and inclusiveness of the proposed method

2.5 多重real-time PCR靈敏度實驗結(jié)果

按1.3.6節(jié)方法進行標準曲線繪制，結(jié)果如圖3所示。4 種源性DNA在質(zhì)量濃度范圍3×101～3×10-3ng/μL內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性。紅薯源性標準曲線為y＝-3.063x+27.695，R2＝0.9914，擴增效率＝108.9%；木薯源性標準曲線為y＝-3.0426x+27.772，R2＝0.9956，擴增效率＝110.2%；馬鈴薯源性標準曲線為y＝-3.2423x+23.047，R2＝0.9987，擴增效率＝99.5%；玉米源性標準曲線為y＝-3.0013x+28.947，R2＝0.9964，擴增效率＝113.7%。由此可知，本實驗開發(fā)的多重real-time PCR方法對目標DNA的檢測靈敏度可達3×10-3ng/μL，高于韓建勛等[29]的研究。而當模板DNA質(zhì)量濃度低于該質(zhì)量濃度時，仍有擴增，但不呈線性關(guān)系，且重復(fù)性和準確性差。

圖3 4 種目標源性擴增曲線及標準曲線圖Fig.3 Amplification curves and standard curves for four target plant sources

2.6 多重real-time PCR檢出限實驗結(jié)果

從表4可知，當摻入比例≥0.1%時，4 種目標源性10 次平行實驗的檢出次數(shù)均可以達到10 次，滿足不小于95%置信區(qū)間的測試要求，表明該摻入比例可以檢出且實驗的重復(fù)性較好；而當摻入比例為0.01%時，紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性的檢出次數(shù)分別為8、7、9、7 次，存在未檢出的情況，若以0.01%摻入量作為方法的檢出限，會造成假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。綜上，為了確保使用本方法進行淀粉樣品檢測時的準確性，現(xiàn)規(guī)定本方法對于淀粉樣品的檢出限為0.1%。該檢出限低于姚曉靜等[24]研究的2%及韓建勛[29]、Wang Deguo[30]等研究的1%。

表4 不同源性多重real-time PCR樣品檢出限結(jié)果Table 4 Detection limits of the multiple real-time PCR for four adulterated plant sources

2.7 實際樣品檢測結(jié)果

采用本實驗建立的多重real-time PCR方法與參比方法同時對50 份實際樣品中的紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測。其中馬鈴薯和玉米源性分別采用標準方法SN/T 1198—2013[27]和SN/T 1196—2018[28]作為參比方法；由于紅薯和木薯源性沒有對應(yīng)的標準方法，因此采用市售的2 種不同品牌的試劑盒作為參比方法。從表5可知，本方法與參比方法結(jié)果一致，均有7 個淀粉樣品檢出含有與標簽成分不符的其他源性成分，不合格率為14%（7/50）。7 個不合格樣品包括5 個紅薯淀粉和2 個馬鈴薯淀粉。其中5 個不合格紅薯淀粉中有2 個只檢出了木薯源性，1 個只檢出馬鈴薯源性，2 個既檢出紅薯又檢出木薯源性；2 個不合格馬鈴薯淀粉中有1 個只檢出木薯源性，1 個既檢出馬鈴薯又檢出木薯源性。綜上可知，兩種方法的檢測結(jié)果一致，說明所建方法結(jié)果準確可靠；同時，檢測4 種目標源性成分所用的時間僅為參比方法的1/4，且檢測成本遠低于試劑盒法。因此，所建方法可作為一種有效技術(shù)手段用于市售淀粉的種類摻假鑒別檢測。此外，通過不合格樣品檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，用木薯淀粉代替或?qū)⒛臼淼矸蹞饺氲郊t薯淀粉、馬鈴薯淀粉中是目前主要的摻假手段。

表5 實際樣品中不合格樣品的PCR檢測結(jié)果Table 5 Results of detection of unqualified samples by the PCR method

3 結(jié)論

本研究通過篩選靶基因、對比目標區(qū)域片段、設(shè)計特異性引物探針，建立了一種可同時對紅薯、木薯、馬鈴薯、玉米源性成分進行檢測的四重TaqMan探針real-time PCR方法，實現(xiàn)同一體系同時擴增4 種目標源性，達到了縮短檢測時間、提高檢測效率的目的。考慮到淀粉是一類深加工食品，本研究選取的目標序列均小于150 bp，可以有效防止因DNA降解造成的假陰性結(jié)果[31]。同時，還充分考慮了不同DNA提取試劑盒對淀粉樣品DNA提取質(zhì)量的影響，為該方法的應(yīng)用范圍從鮮原料進一步擴展到深加工淀粉制品提供研究基礎(chǔ)。本方法具有較強的特異性和包容性，對于常見的目標源性品種均可檢出，且與15 種非目標源性均無交叉反應(yīng)。此外，本方法還具有較高的靈敏度，可檢測到質(zhì)量濃度為3×10-3ng/μL的模板DNA，且對于淀粉樣品的檢出限可達0.1%，滿足目前各標準中對4 種目標源性檢出限的要求。用該方法對50 份實際淀粉樣品進行檢測，結(jié)果均與參比方法一致，而用時僅為參比方法的1/4，且檢測成本遠低于試劑盒方法。綜上，本研究建立的四重TaqMan探針real-time PCR方法可以作為一種有效的檢測手段，應(yīng)用于市場上淀粉種類的真?zhèn)涡澡b別，為完善標準體系建設(shè)、打擊非法摻假欺詐、規(guī)范市場秩序和保障人民食品安全提供技術(shù)支持。