何紅梅，徐玲英，張昌朋，王祥云，蔣金花，李艷杰，趙學(xué)平

（省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021）

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，因其果實中富含花青素等營養(yǎng)保健功能成分，在全球種植廣泛，2020年總種植面積為20.567萬 hm2[1]；我國于2000年開始藍(lán)莓商業(yè)化生產(chǎn)，到2020年底，全國栽培面積為6.64萬 hm2[2]。雖然我國藍(lán)莓種植面積不小，但在藍(lán)莓生產(chǎn)上登記的農(nóng)藥品種較少[3]。

環(huán)嗪酮是一種內(nèi)吸選擇性、芽后觸殺性三氮苯酮類廣譜型除草劑，1974年由美國杜邦公司研發(fā)，能有效防除多種一年生和多年生雜草、一些矮灌木[4-5]。至今，環(huán)嗪酮已在森林、森林防火道、藍(lán)莓和甘蔗上登記[3]，但我國僅制定了環(huán)嗪酮在甘蔗上的最大殘留限量值（maximum residue limit，MRL），為0.5 mg/kg。僅美國、韓國和日本制定了環(huán)嗪酮在藍(lán)莓上的MRL，分別為0.6[6]、0.05 mg/kg[7]和0.2 mg/kg[8]。

目前，關(guān)于環(huán)嗪酮的相關(guān)文獻(xiàn)報道主要有對生態(tài)環(huán)境影響評價研究[5]、氣相色譜法分析原藥[9]、毒性研究[10]、合成述評[11]、土壤中降解研究[12-14]、水中降解研究[15]、環(huán)境污染風(fēng)險研究[16]、殘留分析方法[4,17-21]和甘蔗上的殘留行為研究[18]。謝夢醒等[4]報道了高效液相色譜法測定甘蔗和土壤中環(huán)嗪酮殘留量，張丹華等[17]采用毛細(xì)管電泳法測定了紫薯中環(huán)嗪酮、嗪草酮和氰草津的殘留量，黃文源等[18]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究了甘蔗和土壤中環(huán)嗪酮的殘留和消解動態(tài)。Bouchard等[19]報道了液相色譜法檢測土壤和水中環(huán)嗪酮殘留量。Kubilius等[20]采用毛細(xì)管電泳法測定了地表水中環(huán)嗪酮和其代謝物殘留。Yu Xinru等[21]報道了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定淡菜、扇貝（?。┖托∝惾獾蓉悮ゎ惡ｕr中的三嗪類除草劑殘留量。目前，鮮見關(guān)于環(huán)嗪酮在藍(lán)莓上的殘留行為和殘留分析方法報道，基于此，在浙江省、遼寧省、吉林省和北京市開展了75%環(huán)嗪酮水分散粒劑在藍(lán)莓上的殘留研究，建立了環(huán)嗪酮在藍(lán)莓上的殘留分析方法，并對4 地的最終殘留結(jié)果進(jìn)行了膳食風(fēng)險評估，旨在為環(huán)嗪酮使用安全性評價和中國在藍(lán)莓上制定MRL值提供參考資料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ProElut十八烷基鍵合硅膠（C18）小柱（500 mg/6 mL）北京迪馬科技有限公司；鹽包（1.5 g NaCl+6 g無水硫酸鎂）島津上海實驗器材有限公司；Cleanert MAS-Q凈化管（乙二胺-N-丙基硅烷（primary second amine，PSA）50 mg+MgSO4150 mg+C1850 mg）天津博納艾杰爾科技有限公司；Waters BEHC18（1.7 μm，2.1×100 mm）和Waters HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）美國Waters公司。

75%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）環(huán)嗪酮水分散粒劑 江蘇禾裕泰化學(xué)有限公司；環(huán)嗪酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.68%）德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）美國Fisher公司；甲酸（色譜純）美國ROE Scientific公司；飲用純凈水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其余有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC XEVO TQ-XS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Waters公司；AB104-S電子天平 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；SE602F電子天平 奧豪斯常州儀器有限公司；NMSG-12多管旋渦混合器 泰州諾米醫(yī)療科技有限公司；3-18K高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；TD5A-WS臺式大容量離心機(jī) 金壇市金南儀器制造有限公司；SI-A256渦旋儀 美國Scientific Industries公司；R6v.v.攪拌機(jī) 德國Robertcoupe s.n.c公司；BD/BC-720hcz冰柜 青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 田間實驗

參照實驗準(zhǔn)則[22]，2021年在浙江紹興、遼寧沈陽、吉林長春和北京懷柔區(qū)4 地開展了75%環(huán)嗪酮水分散粒劑在藍(lán)莓上的殘留實驗。

1.3.1.1 施藥

田間實驗在相鄰區(qū)域設(shè)1 個對照小區(qū)和1 個處理小區(qū)，并設(shè)置間隔區(qū)避免污染。處理小區(qū)施藥劑量為1800 g/hm2（制劑量160 g/畝），施藥1 次，施藥時期為雜草生長期，施藥方式為噴霧，藥后第90天和100天采集樣品；對照小區(qū)則噴施清水。

1.3.1.2 樣品采集及其制備

用隨機(jī)的方法在實驗小區(qū)內(nèi)不少于12 個點或6 叢灌木采集藍(lán)莓，采集樣品至少1 kg，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，貼好標(biāo)簽。每小區(qū)每次采集2 個樣品；第一次和最后一次采集處理小區(qū)樣品時，同時采集對照小區(qū)樣品，并按先對照小區(qū)后處理小區(qū)順序采樣；小區(qū)內(nèi)距離兩端0.5 m內(nèi)不采樣。

將藍(lán)莓樣品去除果柄后經(jīng)攪拌機(jī)干冰制樣后得到實驗室樣品，用四分法分取150 g樣品兩份（正樣和備樣，一份用于檢測，一份用于備份），裝入封口樣品袋中，貼好標(biāo)簽待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取環(huán)嗪酮標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用甲醇配成標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液逐步稀釋得到0.0001、0.0005、0.001、0.002、0.005 mg/L和0.01 mg/L的環(huán)嗪酮溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；同時用藍(lán)莓基質(zhì)空白溶液配制同系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品檢測

1.3.3.1 樣品前處理

于50 mL離心管中稱取10 g藍(lán)莓樣品（精確到0.01g），然后加入5 mL水和10 mL乙腈，渦旋提取3 min，再加入鹽包（1.5 g NaCl+6 g無水硫酸鎂），渦旋混勻1 min，離心3 min（4000 r/min），取上清液1.5 mL至Cleanert MAS-Q凈化小管（PSA 50 mg+MgSO4150 mg+C1850 mg），渦旋混勻30 s，離心3 min（10000 r/min），取上清液0.7 mL與0.7 mL水混勻后過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.3.3.2 樣品檢測條件

液相色譜條件：色譜柱為Waters Acquity UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣體積為1.0 μL；柱溫為40 ℃；流速為0.2 mL/min。流動相：A相為甲醇，B相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液。采用梯度洗脫程序：0～2 min，60%～90% A、40%～10% B；2～4 min，90% A、10% B；4.0～4.5 min，90%～60% A、10%～40% B；4.5～5.0 min，60% A、40% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，采用多反應(yīng)監(jiān)測。毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30V，脫溶劑溫度為400 ℃，脫溶劑氣流量為800 L/h。環(huán)嗪酮定性、定量（*）離子對分別為253.1/171.1*、253.1/71.0。

1.3.4 添加回收實驗

在空白的藍(lán)莓中分別添加0.01、0.1、1.0 mg/kg 3 個環(huán)嗪酮添加量，每個水平做5 個平行。按照1.3.3節(jié)的方法進(jìn)行檢測。

1.3.5 貯藏穩(wěn)定性實驗

1.3.5.1 提取凈化液冷藏實驗

將2 個1.0 mg/kg的添加回收樣品經(jīng)前處理后獲得待檢提取凈化液，放置于冰箱內(nèi)冷藏。分別于0 d和貯藏3、7、15 d取出檢測。

1.3.5.2 樣品冷凍貯藏實驗

稱取藍(lán)莓空白樣品10 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，共20 個。其中4 個作為空白樣品，8 個經(jīng)添加標(biāo)樣后作為質(zhì)量控制樣品，8 個經(jīng)添加標(biāo)樣后作為貯藏實驗樣品，添加量為1.00 mg/kg。樣品采集間隔為0、30、55 d和89 d。

1.3.6 膳食風(fēng)險評估

環(huán)嗪酮國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI）按公式（1）計算[23-25]：

式中：STMRi為環(huán)嗪酮在中國登記作物上的規(guī)范殘留實驗中值/（mg/kg）；對于沒有殘留實驗中值的登記作物，選用相應(yīng)的MRL值計算，如果中國沒有MRL，可選取國際食品法典委員會、美國、澳大利亞等制定MRL值進(jìn)行計算；Fi為中國一般人群的人均食品消費量[26]/kg。

環(huán)嗪酮的膳食攝入風(fēng)險與NEDI和每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）以及人均體質(zhì)量有關(guān)，用風(fēng)險熵（risk quotient，RQ）表示，按公式（2）計算。如果RQ小于100%，則膳食風(fēng)險可以接受，大于100%則表示膳食風(fēng)險不可接受，數(shù)值越大風(fēng)險越大[23-25]。

式中：ADI為每日允許攝入量/（mg/kgmb）；m為中國消費者的平均體質(zhì)量（63 kg）[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法建立

2.1.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先在電噴霧電離正離子模式下，對環(huán)嗪酮進(jìn)行母離子、子離子和碰撞能量的確定，然后在含甲酸的甲醇水流動相體系下比較環(huán)嗪酮在Waters BEH C18和Waters HSS T3色譜柱上的色譜保留行為。實驗結(jié)果表明：1）發(fā)現(xiàn)環(huán)嗪酮有3 個碎片離子，分別是m/z71、85.1和171.1，其中m/z171.1（100%）豐度最高，然后是m/z71（40%）、85.1（24%），實驗選取m/z71和m/z171.1碎片離子用于定性、定量分析，與文獻(xiàn)報道[13]監(jiān)測子離子（m/z171.3和m/z85.4）不完全一致。2）在相同流動相條件下，雖然環(huán)嗪酮在HSS T3的保留（2.78 min）比在BEH C18的保留（2.28 min）強(qiáng)，但環(huán)嗪酮在這2 款色譜柱上均能獲得較好的峰型和靈敏度，最終，實驗選取通用性BEH C18用于樣品分析。

2.1.2 前處理方法選擇

目前已報道的食品中環(huán)嗪酮的前處理方法主要有三氯甲烷提取后經(jīng)中性氧化鋁玻璃層析柱凈化[4]、QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged and safe）凈化法（PSA和石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）為吸附劑）[17]、QuEChERS凈化法（C18為吸附劑）[18]、改進(jìn)QuEChERS凈化法（分子印跡聚合物和PSA為吸附劑）[21]等。QuEChERS前處理方法因其快速、簡單、環(huán)保等特點被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域農(nóng)藥殘留檢測，本實驗也采用了QuEChERS前處理方法，選取PSA和C18作為吸附劑，獲得了較好的實驗結(jié)果。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及基質(zhì)效應(yīng)考察

通過比較基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可獲得基質(zhì)效應(yīng)，具體計算見式（3），當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)絕對值少于20%時說明基質(zhì)效應(yīng)不顯著，計算時可采用溶劑標(biāo)樣[27-28]。以環(huán)嗪酮質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；環(huán)嗪酮在0.0001～0.01 mg/L范圍內(nèi)，溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y＝109182887.5115x+960.3265（R2＝0.9998）和y＝100826667.1258x+1165.2208（R2＝0.9997），基質(zhì)效應(yīng)為-7.7%，說明線性良好，基質(zhì)效應(yīng)不顯著。

式中：A為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2.1.4 回收率、定量限和檢出限

藍(lán)莓中環(huán)嗪酮添加量（0.01、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg）的回收率結(jié)果見表1，代表性添加回收色譜圖見圖1A～C。從表1可見，3 個添加水平的平均回收率為87%～91%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.7%～3.7%，結(jié)果均滿足殘留分析要求，可將該方法應(yīng)用于實際樣品中環(huán)嗪酮殘留量的分析檢測。根據(jù)最低添加濃度確定方法的定量限，環(huán)嗪酮在藍(lán)莓中定量限為0.01 mg/kg。根據(jù)3 倍信噪比確定方法檢出限，方法檢出限為2.6×10-6mg/L。

圖1 環(huán)嗪酮標(biāo)準(zhǔn)品、藍(lán)莓果實添加回收和殘留樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of hexazinone standard,hexazinone spiked and residue samples in blueberry fruit

表1 環(huán)嗪酮在藍(lán)莓中的回收率（n ＝5）Table 1 Recovery rates of hexazinone in blueberry fruit (n=5)

2.2 樣品貯藏穩(wěn)定性

2.2.1 提取凈化液冷藏穩(wěn)定性

2 個1.0 mg/kg的環(huán)嗪酮藍(lán)莓添加回收樣品的初始含量分別為0.830 mg/kg和0.858 mg/kg，提取凈化液在-0.5～7.7 ℃的冰箱中貯藏3、7 d和15 d后取出測定，結(jié)果分別為：1）貯藏3 d后環(huán)嗪酮含量分別為0.853 mg/kg和0.932 mg/kg，降解率分別為-2.8%和-8.6%；2）貯藏7 d后環(huán)嗪酮含量分別為0.899 mg/kg和0.964 mg/kg，降解率分別為-8.3%和-12%；3）貯藏15 d后環(huán)嗪酮含量分別為0.864 mg/kg和0.896 mg/kg，降解率分別為-4.1%和-4.4%。結(jié)果表明，冷藏條件下，環(huán)嗪酮在樣品提取凈化液中貯藏15 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2 樣品冷凍貯藏穩(wěn)定性

藍(lán)莓冷凍實驗結(jié)果見表2，環(huán)嗪酮的平均初始含量為0.948 mg/kg，貯藏30、55 d和89 d的平均含量分別為0.943、0.981 mg/kg和0.950 mg/kg，平均降解率分別為0.55%、-3.40%和-0.20%；4 次質(zhì)量控制樣品的平均回收率為94%～107%，說明實驗有效。冷凍貯藏期內(nèi)，冰柜溫度為-23.9 ℃～-18.0 ℃，平均溫度為-20.1 ℃，環(huán)嗪酮的降解率均小于30%，說明冷凍貯藏條件下，環(huán)嗪酮在藍(lán)莓中貯藏89 d內(nèi)穩(wěn)定。代表性冷凍貯藏樣品色譜圖見圖1D。

表2 環(huán)嗪酮在藍(lán)莓中的冷凍貯藏穩(wěn)定性Table 2 Frozen storage stability of hexazinone in blueberry fruit

2.3 最終殘留量測定結(jié)果

2021 年在浙江、北京、遼寧、吉林4 地，以1800 g/hm2的施藥劑量在藍(lán)莓園進(jìn)行雜草定向莖葉噴施75%環(huán)嗪酮水分散粒劑1 次，于施藥后90 d和100 d采樣測定藍(lán)莓中環(huán)嗪酮殘留量。

施藥后90 d和100 d，4 地的藍(lán)莓樣品中環(huán)嗪酮殘留量均低于0.01 mg/kg，均低于美國、日本和韓國制定的MRL（分別為0.6、0.2 mg/kg和0.05 mg/kg）[6-8]。最終殘留樣品測定時進(jìn)行4 次重復(fù)添加量為0.01 mg/kg的質(zhì)量控制樣品分析，回收率為95%～103%，RSD為4.4%；所有殘留樣品均在冷凍貯藏穩(wěn)定期89 d內(nèi)完成殘留樣品提取和凈化，且樣品提取凈化液均在15 d內(nèi)完成儀器測定，故實驗結(jié)果可靠。環(huán)嗪酮雖然具有內(nèi)吸性，但通過最終殘留實驗結(jié)果可見其在藍(lán)莓果實中的殘留量極低，發(fā)生食品安全風(fēng)險可能性很小。最終殘留實驗結(jié)果見表3，代表性最終殘留樣品色譜圖見圖1E。

表3 環(huán)嗪酮在4 個實驗點藍(lán)莓樣品中的最終殘留量（n＝2）Table 3 Final residues of hexazinone in blueberry samples from four test sites (n=2)

2.4 膳食風(fēng)險評估

環(huán)嗪酮在我國僅在甘蔗和藍(lán)莓2 種可食作物上獲得登記[3]，GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定環(huán)嗪酮的殘留物為環(huán)嗪酮，ADI值為0.05 mg/kgmb，在甘蔗上的MRL值為0.5 mg/kg[29]。根據(jù)環(huán)嗪酮在我國登記作物和MRL制定情況，以及本實驗獲得的環(huán)嗪酮在藍(lán)莓上的規(guī)范殘留實驗中值（0.01 mg/kg），并依據(jù)衛(wèi)健委2002年發(fā)布的《中國不同人群消費膳食分組食譜》中的膳食結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，計算普通人群環(huán)嗪酮在甘蔗和藍(lán)莓上的NEDI分別為0.0022、0.000457 mg，環(huán)嗪酮的RQ為0.084%，表明膳食攝入風(fēng)險小，具體計算相關(guān)信息見表4。

表4 甘蔗和藍(lán)莓樣品中環(huán)嗪酮膳食風(fēng)險評估Table 4 Dietary risk assessment of hexazinone in sugarcane and blueberry samples

3 結(jié)論

樣品采用QuEChERS前處理方法，選取PSA和C18作為凈化材料，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藍(lán)莓中環(huán)嗪酮殘留量的方法，結(jié)果表明方法快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、無顯著基質(zhì)效應(yīng)。

最終殘留結(jié)果顯示，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%環(huán)嗪酮水分散粒劑按有效成分1800 g/hm2施藥劑量施藥1 次，4 個實驗點的藍(lán)莓樣品中環(huán)嗪酮殘留量均低于0.01 mg/kg，最終殘留實驗結(jié)果可以為中國制定藍(lán)莓中環(huán)嗪酮的MRL值提供數(shù)據(jù)支持。此外，根據(jù)最終殘留實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了甘蔗和藍(lán)莓樣品中環(huán)嗪酮的膳食風(fēng)險評估，RQ為0.084%，結(jié)果表明風(fēng)險很小。因此，在藍(lán)莓園使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%環(huán)嗪酮水分散粒劑時，建議最高施藥劑量為1800 g/hm2，施藥次數(shù)為1 次，安全間隔期為90 d。在藍(lán)莓園合理使用75%環(huán)嗪酮水分散粒劑，發(fā)生藍(lán)莓食品中環(huán)嗪酮殘留安全風(fēng)險可能性不大。