王瑞安，杜再慧，康帥帥，田洪濤,3,4,，李 晨,4，王鑫昕，王妙姝，許文濤,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京 100083；3.國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)中心，河北 保定 071000；4.河北省益生功能性乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071000；5.河北新希望天香乳業(yè)有限公司，河北 保定 071000）

阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）屬于克羅諾桿菌屬，它是一種條件食源性致病菌，對高滲透壓和干燥條件具有很高的抵抗力。因此，它可以在嬰兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）和其他食品中存活，并且主要存在于奶粉中[1-3]。它與壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血癥、嬰兒腦膜炎有關(guān)，病死率高達80%，并且阪崎腸桿菌有時也會出現(xiàn)抗藥性，難以治療[4-6]。2004年，安徽阜陽出現(xiàn)著名的“大頭嬰兒”事件中，從出事奶粉中檢測出阪崎腸桿菌，污染陽性率為12.6%，這也是國內(nèi)首次從PIF中檢測到阪崎腸桿菌。2019年全國奶粉抽檢，在某品牌奶粉中檢測出阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌作為致死菌，不允許在奶粉中檢出，因此需要可靠的、超靈敏的檢測方法檢測阪崎腸桿菌規(guī)避這些風(fēng)險。

用于檢測PIF 中阪崎腸桿菌的標準方法是ISO/TS 22964:2006，它是傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，基于培養(yǎng)的初步分離和生化分析進行最終確認，整個過程需要5～7 d，對生長條件和試劑也有特殊要求，費工費時[5-7]。另外還有分子檢測方法與基于免疫的檢測方法，如聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[7-8]、酶聯(lián)免疫吸附實驗[9]，或基于免疫脂質(zhì)體的分析[10-12]，已被建議作為基于培養(yǎng)的方法的替代，或作為替代生化測試的最終確認步驟[13]。其中檢測阪崎腸桿菌的分子方法比生化檢測耗時更短。然而，基于PCR的方法需要設(shè)計特定的引物和專門的設(shè)備[14]。此外，基于免疫的檢測依賴于抗體與抗原的相互作用，由于抗阪崎腸桿菌的抗體還沒有商業(yè)化，需要自行制備，這增加了技術(shù)上的挑戰(zhàn)[15-16]。因此，迫切需要開發(fā)具有成本效益、簡單、快速、高靈敏度的檢測阪崎腸桿的新方法。

適配體是單鏈DNA、RNA或通過指數(shù)富集型配體的系統(tǒng)進化分離的修飾核酸，可以高親和力和選擇性地與各種靶分子，如小有機分子、蛋白質(zhì)、藥物、病毒、細菌甚至完整的腫瘤細胞結(jié)合[17]。與抗體相比，適配體更小，更容易合成和修飾，具有更好的熱穩(wěn)定性，合成價格更為低廉[18]。為了獲得高靈敏度，通常會將適配體與擴增方法聯(lián)用。如PCR分析[19-20]、滾環(huán)擴增[18-22]、鏈置換擴增[23-24]、核酸外切酶III輔助靶標回收[25]。這些方法在原理上具有極高的靈敏度和很寬的定量動態(tài)范圍，但它們高度依賴于酶，其中一種或多種類型的酶是催化擴增反應(yīng)所必需的。因此，為了保證酶的活性，必須精確控制反應(yīng)的pH值、溫度和緩沖介質(zhì)等條件。為此，無酶擴增方法在檢測中顯示出巨大的潛力[26-27]。其中，雜交鏈式反應(yīng)（hybrid chain reaction，HCR）擴增是最具吸引力的方法之一。HCR最吸引人的優(yōu)點是它是一個動力學(xué)控制的反應(yīng)，擴增不需要任何酶[28]。無標記檢測技術(shù)因其能提供快速、經(jīng)濟的檢測方法而備受關(guān)注。在這些檢測系統(tǒng)中，SYBR Green I是迄今為止最靈敏的雙鏈DNA染色試劑，通常被用作無標記檢測的熒光指示劑[29-30]。

基于上述問題與思考，本實驗開發(fā)了一種簡單快速的級聯(lián)放大策略用于檢測阪崎腸桿菌，整個傳感過程包含有四重放大：磁富集、適配體磁珠-靶標一對多識別、HCR擴增、熒光信號積累（圖1）。首先采戊二醇反應(yīng)和親和素-生物素反應(yīng)進行適配體功能化磁珠的制備（圖1A），當存在靶標時，含有觸發(fā)序列的適配體會特異性識別靶標（圖1B），在和捕獲的靶標孵育后發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，露出觸發(fā)序列，引發(fā)HCR擴增，使H1和H2交替打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并相互補充，最終延伸出缺口的長雙鏈DNA，實現(xiàn)信號放大（圖1C）。接下來加入SYBR Green I染料，作為迄今為止最靈敏的雙鏈DNA染色試劑[30]，它可以迅速嵌入雙鏈DNA。隨后加入氧化石墨烯（graphene oxide，GO）吸附游離的發(fā)卡以及SYBR Green I猝滅熒光，降低背景噪聲（圖1D）。最后使用熒光分光光度計測量熒光強度實現(xiàn)靶標的定量檢測。該傳感器具有靈敏度高、易于操作、體系穩(wěn)定等優(yōu)點，為奶粉中阪崎腸桿菌的快速檢測提供了新方法。

圖1 檢測阪崎腸桿菌傳感策略原理圖Fig.1 Schematic diagram of sensing strategy for the detection of C. sakazakii

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

阪崎腸桿菌（ATCC 29544）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、金黃色葡萄球菌（CICC 21600）、大腸桿菌（CICC 10389）、沙門氏菌（CMCC 50115）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評估（食品）重點實驗室提供。

NaCl、MgCl2?6H2O、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、氯化鉀（KCl）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氨基磁珠由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)功能核酸實驗室提供；鏈霉親和素 生工生物工程（上海）股份有限公司；緩沖蛋白胨 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨 美國賽默飛世爾科技公司；酵母提取物 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、戊二醇、SYBR Green I（10000×）北京索萊寶科技有限公司；GO 南京先豐納米材料科技有限公司。

用于HCR擴增的序列：HP（5’Biotin-CGG ATG ACT AGG ACG GAG ATA AAA AAA AAA ACT AGT CAT CCG ACG TAG AGC ATC ACC ATG ATC CTG-3’）、H1（5’-TGG TTT GGC TTC TAG TCA TCC GTA GTA GAG GGT CGG ATG ACT AG-3’）、H2（5’-CGG ATG ACT AGA AGC CAA ACC ACT AGT CAT CCG ACC CTC TAC TA-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

越平電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；可調(diào)式混勻儀旋渦混合器 北京開源國創(chuàng)科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司；CF1524R臺式高速冷凍離心機 杭州恒流科技有限公司；Mini-smart掌上離心機 北京昊諾斯科技公司；磁力架 安徽為臻生物工程技術(shù)有限公司；數(shù)顯pH計 上海精密科學(xué)儀器廠；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

結(jié)合緩沖液：50 mmol/L Tr is、150 mmol/L NaCl和5 mmol/L MgCl2（pH 7.5）。Tris-HCl緩沖液：10 mmol/L Tris、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L CaCl2（pH 8.5）。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：2.7 mmol/LKCl、137 mmol/LN aCl、2 mmol/L K H2P O4和10 mmol/L Na2HPO4（pH 7.4）。HCR緩沖液：8 mmol/L Na2HPO4、2.5 mmol/L NaH2PO4、0.15 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2（pH 7.4），置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。SYBR Green I溶液（10×）：取10000×SYBR Green I溶液1 μL加入到999 μL蒸餾水中，置于-20 ℃?zhèn)溆?。GO溶液：取5 mg/mL的GO溶液1 mL，加入49 mL的蒸餾水稀釋至100 μg/mL，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的活化和培養(yǎng)

將凍存的阪崎腸桿菌在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上劃線37 ℃培養(yǎng)24 h，之后挑取單菌落接種到50 mL的緩沖蛋白胨液態(tài)培養(yǎng)基（buffered peptone water，BPW），置于37 ℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。然后將活化好的阪崎腸桿菌按照2%接種量接種至50 mL的BPW液態(tài)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、200 r/min的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌液用平板計數(shù)法確定細菌數(shù)，并用結(jié)合緩沖液梯度稀釋保存。

1.3.3 適配體功能化磁珠的制備

取40 mg氨基磁珠加入20 mL PBS中，超聲至完全分散，加入5 mL戊二醛溶液（25%體積分數(shù)），室溫下110 r/min振蕩2 h。在外加磁場下進行磁分離并棄去反應(yīng)液，PBS重復(fù)洗滌3 次后分散于16 mL含有960 μg鏈霉親和素的PBS中。室溫下110 r/min充分振搖反應(yīng)12 h。洗滌3 次后重懸于20 mL PBS中得到親和素修飾的納米磁珠。將修飾有生物素的包含觸發(fā)序列的核酸適配體序列與親和素化磁珠通過親和素-生物素反應(yīng)進行組裝。取40 mg親和素化磁珠分散于40 mL適配體濃度為30 nmol/mL的PBS中，在室溫下110 r/min搖蕩反應(yīng)2 h。用外磁分離，水洗多次，分散于40 mL Tris-HCl中4 ℃保存。

1.3.4 適配體磁珠熒光傳感器檢測阪崎腸桿菌

制備完成適配體磁珠后，取5 mg的適配體磁珠與20 μL不同濃度的阪崎腸桿菌，室溫孵育30 min，使用結(jié)合緩沖液洗滌磁珠3 次，以充分去除未結(jié)合的靶標?？瞻讓φ詹惶砑影袠宋镔|(zhì)，其余操作和陽性樣本同步。隨后將孵育后的磁珠-靶標復(fù)合體加入到總體積180 μL含100 nmol/L H1、100 nmol/L H2的HCR緩沖液中，37 ℃孵育90min。在HCR擴增產(chǎn)物中加入10 μL SYBR Green I（10×），并將反應(yīng)體系補充至200 μL，在室溫下孵育10min。隨后向體系中加入10 μg/mL的GO，并將最終混合物在37 ℃孵育10 min。最終，使用熒光分光光度儀進行熒光信號的測量，激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5.0 nm，激發(fā)電壓為700 V，激發(fā)波長為495 nm，采集510～700 nm范圍的發(fā)射光譜。使用520 nm處的熒光強度進行評估。

1.3.5 傳感器的條件優(yōu)化

為使傳感器得到最佳檢測效果，本實驗對擴增環(huán)節(jié)，信號輸出部分進行條件優(yōu)化，并對實驗結(jié)果使用GraphPad Prism 8軟件進行單因素方差分析，采用Duncan多重檢驗對樣本之間的差異顯著性進行檢驗，P＜0.05，差異顯著。1）擴增條件優(yōu)化：HCR是一個動力學(xué)控制的反應(yīng)，擴增不需要任何酶，所以影響其擴增效果的主要就是發(fā)夾序列H1、H2濃度以及反應(yīng)時間。2）信號輸出條件優(yōu)化：主要包括GO質(zhì)量濃度、GO孵育時間。按照單一變量的原則進行條件優(yōu)化，GO質(zhì)量濃度優(yōu)化區(qū)間為0～12 μg/mL，GO孵育時間優(yōu)化區(qū)間為0～12 min。

1.3.6 實際樣品中阪崎腸桿菌的檢測

采用加標回收的方式測定樣本菌濃度。首先對奶粉進行樣品前處理。稱取一定量的奶粉，將奶粉用無菌水按1∶10稀釋后進行巴氏殺菌（65 ℃、30 min），然后制得無菌質(zhì)地的奶粉放入4 ℃冰箱保存。

對滅菌的奶粉先進行傳感檢測及利用培養(yǎng)法考察奶粉的無菌性，確認無阪崎腸桿菌存在時可作為陰性對照樣品及實驗加標樣品。對陽性樣品按照1.3.4節(jié)操作進行檢測，根據(jù)熒光值與靶標濃度之間的關(guān)系繪制標準曲線，同時計算回收率和相對標準偏差。此外，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法對該生物傳感器的準確性進行了佐證。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體磁珠的表征

采用戊二醇偶聯(lián)反應(yīng)進行親和素和磁珠的連接，磁珠表面的氨基（—NH2）和親和素上的氨基（—NH2）分別與戊二醛反應(yīng)縮合生成希夫堿，產(chǎn)生共價交聯(lián)反應(yīng)完成連接。選擇質(zhì)量分數(shù)5%戊二醇作為參與偶聯(lián)反應(yīng)的終濃度[31]。利用親和素在280 nm波長處具有紫外吸收的特點，通過測定親和素參與戊二醛偶聯(lián)反應(yīng)前后的紫外吸光度變化表征親和素與氨基磁珠的反應(yīng)情況，結(jié)果如圖2A所示，曲線a是親和素的紫外吸光度，曲線c是氨基磁珠的紫外吸光度，曲線b是親和素與磁珠孵育后溶液的紫外吸光度，通過紫外吸光度的下降可以判斷親和素修飾到了氨基磁珠上。

圖2 紫外吸收光譜圖Fig.2 UV-vis absorption spectra

將適配體通過生物素-親和素連接反應(yīng)修飾到磁珠上。實驗中通過測定生物素修飾的適配體溶液與親和素修飾磁珠孵育前后的紫外吸收光譜圖的變化表征適配體序列與親和素修飾磁珠的結(jié)合情況。如圖2B所示，生物素修飾適配體與親和素化磁珠孵育后吸光度顯著降低，表明其含量有所減少，這說明適配體結(jié)合在了磁珠表面。

2.2 傳感器可行性驗證

采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測方法的可行性。如圖3A所示，泳道1、2的條帶基本沒有差別，并未發(fā)生擴增反應(yīng)。泳道3條帶有輕微彌散，也沒未發(fā)生明顯擴增。泳道4產(chǎn)生長而明亮的條帶，證明由于靶標的存在，打開了HP的二級結(jié)構(gòu)，露出了觸發(fā)序列從而引發(fā)了HCR，產(chǎn)生了長的雙鏈DNA，從而證明了實驗的可行性。

圖3 生物傳感器可行性驗證Fig.3 Feasibility verification of the biosensor

利用熒光分光光度計對實驗可行性進行驗證，對反應(yīng)溶液先加入SYBR Green I進行染色，隨后加入GO對背景熒光進行猝滅，最后利用熒光分光光度計測量熒光強度。如圖3B所示，曲線在520 nm處有明顯吸收峰，在SYBR Green I和GO存在下，50 nmol/L的H1或H2產(chǎn)生的背景熒光信號相對較弱。H1和H2混合溶液熒光強度也很弱。在加入5 nmol/L的HP后，熒光強度有略微增強，這可能是由于極少部分HP序列沒有充分折疊，從而和H1與H2發(fā)生部分雜交導(dǎo)致。這些現(xiàn)象清楚地證實了HP、H1和H2單體可以通過黏性末端和環(huán)緊密吸附在GO表面，從而導(dǎo)致有效的熒光猝滅。然而，當阪崎腸桿菌和HP進行孵育后并加入H1和H2的混合物中時，在SYBR Green I和GO的存在下觀察到顯著的熒光增強，表明阪崎腸桿菌被特異性識別并觸發(fā)了HCR擴增反應(yīng)。從而證明了實驗的可行性。

2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

HCR屬于無酶擴增反應(yīng)，它是一個動力學(xué)控制的擴增反應(yīng)。發(fā)卡H1、H2濃度對反應(yīng)的效率以及擴增效果至關(guān)重要，因此首先對H1、H2濃度進行優(yōu)化。然后，對反應(yīng)時間也作出優(yōu)化，確保擴增反應(yīng)的充分進行。從圖4A可以看出，當H1和H2濃度達到60 nmol/L時，熒光強度進入平臺期。圖4B顯示，當反應(yīng)時間為60 min，擴增基本結(jié)束，隨著反應(yīng)時間繼續(xù)延長，熒光強度基本穩(wěn)定。所以選擇H1、H2濃度為60 nmol/L，反應(yīng)時間60 min進行后續(xù)的實驗。此外，實驗對GO的熒光猝滅條件進行優(yōu)化，因為GO的有效猝滅是設(shè)計HCR/GO檢測方法的關(guān)鍵。以便在之后的檢測中能達到較好的熒光猝滅效果提高檢測的靈敏度。當GO質(zhì)量濃度為8 μg/mL時，實驗的信噪比最高，達2.33（圖4C）。如圖4D顯示，當孵育時間為4 min時，猝滅效果達到了最優(yōu)。因此選擇8 μg/mL的GO，孵育時間為4 min，進行之后的實驗。

圖4 擴增條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of amplification conditions

2.4 傳感器的靈敏度驗證

在上述最佳條件下，探究生物傳感器在純培養(yǎng)條件下的檢測性能。將該生物傳感器應(yīng)用于檢測含有1～2×104CFU/mL的阪崎腸桿菌，并在GO熒光猝滅完成后記錄其在520 nm處的熒光強度。如圖5A所示，該傳感策略可以在純培養(yǎng)中檢測的范圍為4.6～5×103CFU/mL，檢出限約為2 CFU/mL。

圖5 生物傳感器靈敏度測定Fig.5 Sensitivity evaluation of the biosensor

探究在奶粉中傳感器的檢測性能，以此證明在實際樣品中傳感器的檢測能力。在當?shù)爻匈徺I飛鶴牌、君樂寶牌、貝因美牌奶粉作為樣品，結(jié)果如圖5B所示，隨著靶標濃度的不斷增加，其對應(yīng)的熒光值也在不斷增加，當濃度超過1×103CFU/g或低于1×101CFU/g后，不再具有良好的線性關(guān)系，其檢測范圍為1×101～1×103CFU/g，檢出限約為8 CFU/g。

2.5 傳感器的特異性分析

為評估該傳感器的檢測特異性，選擇奶粉中可能存在的4 種常見致病微生物（副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌）作為陰性參考。如圖6所示，只有靶標物質(zhì)為阪崎腸桿菌時才能在520 nm處產(chǎn)生高熒光值。當在非靶標菌株濃度較高時，也沒有出現(xiàn)明顯的熒光增強。這表明該方法對阪崎腸桿菌的檢測具有較高的特異性。

圖6 生物傳感器特異性評估Fig.6 Specificity evaluation of the biosensor

2.6 真實樣品檢測結(jié)果

為檢驗傳感器實際應(yīng)用的可靠性，以奶粉作為樣品進行檢測。為評估生物傳感器的準確性，選擇3 種不同濃度的阪崎腸桿菌加入樣品（103、102、10 CFU/g）進行加標回收實驗，結(jié)果（表1）顯示回收率在98.5%～110%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1.03%～2.40%之間（n＝3）。此外，采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和本策略的方法結(jié)果對比印證，如表1所示。而且各個環(huán)節(jié)檢測中陰性對照組均未出現(xiàn)假陽性。結(jié)果表明，設(shè)計的生物傳感器適用于奶粉中阪崎腸桿菌的實際檢測。如表2所示，本研究開發(fā)的傳感器與現(xiàn)有傳感器相比具有更高的靈敏度，而且檢測時間更短。

表1 本實驗方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測奶粉樣品中阪崎腸桿菌的結(jié)果（n ＝3）Table 1 Results of C. sakazakii detection in milk powder samples using the method proposed in this study and traditional culture method (n=3)

表2 不同方法檢測阪崎腸桿菌的生物傳感器性能比較Table 2 Comparison of the performance of the biosensor with that of other different methods for the detection of C. sakazakii

3 結(jié)論

開發(fā)了一種免酶免標記的檢測阪崎腸桿菌高靈敏度熒光生物傳感器。檢測方法結(jié)合了磁珠的富集能力、靶標的適配體識別、HCR的高效擴增、SYBR Green I的熒光信號積累和GO的選擇性猝滅作用等優(yōu)點，靈敏度高、特異性好。由于它是適配體/目標結(jié)合間接啟動HCR，因此可以通過簡單地改變相應(yīng)的適配體序列應(yīng)用其他目標分析物的檢測，從而使方案的設(shè)計具有潛在的通用性。與之前報道的用于阪崎腸桿菌檢測的熒光標記方法以及比色方法相比，本方法無需基因提取，反應(yīng)過程無需任何酶，適配體探針無需修飾或標記，這對于保持適配體高目標結(jié)合活性很重要，而且使系統(tǒng)更方便且更具成本效益。未來有望于在食品、藥品、環(huán)境等方面實現(xiàn)快速，超靈敏的現(xiàn)場檢測。