蔡 杰，方 媛，賈繼來，張 碟，叢 欣,3，程水源

（1.武漢輕工大學(xué)硒科學(xué)與工程現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，國家富硒農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，湖北省綠色富硒農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)研發(fā)工程中心，湖北 武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué) 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430023；3.恩施德源硒材料工程科技有限公司，湖北 恩施 445000）

近年來，含有兩種或多種活性成分的共包封體系在提高功能性食品的營養(yǎng)價值方面引起了廣泛關(guān)注[1-2]。這種共包封體系不僅能夠提高活性成分在輸送過程中的穩(wěn)定性，而且滿足了人們對營養(yǎng)個性化定制食品的需求[3]。目前，已有學(xué)者對不同種類的生物活性成分共包封體系展開研究，如益生菌/瓜拉那提取物[4-5]，益生菌/Omega-3脂肪酸[6]，益生菌/益生元[7]，蛋清衍生肽/姜黃素[8]，VB2/VE/β-胡蘿卜素[9]等。硒肽是一種從天然的植物或微生物分離純化得到的富硒活性多肽，具有抗氧化、降血壓、肝臟保護(hù)和免疫調(diào)解等活性[10]。相比于大多數(shù)活性多肽，人體對微量元素硒的需求使其成為了一種不可或缺的營養(yǎng)膳食硒補充劑，對人體生理健康具有積極作用。VE也是一種人體必需的脂溶性維生素，作為抗氧化劑和營養(yǎng)劑被應(yīng)用于食品加工中。隨著對硒與VE的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)兩者在營養(yǎng)作用方面具有一定的關(guān)聯(lián)性，主要在抗氧化等生理功能方面具有一定的協(xié)同作用[11-13]。然而親水性的硒肽和親脂性的VE在人體消化道生理條件下表現(xiàn)出較低的穩(wěn)定性，并且VE由于自身較差的水溶性和對氧氣敏感等缺陷使其不適合直接添加到水性食品體系中。除此之外，由于溶解性差異，尋找合適的遞送體系用于兩者的共同包封成為了亟需解決的問題。

水包油包水（W1/O/W2）雙重乳液是一種將油包水（W1/O）初乳液分散在另一連續(xù)相水（W2）中形成的常見乳液體系，由于其能夠同時包封不同極性（親水性和親脂性）的物質(zhì)，在活性成分的共包封和遞送中表現(xiàn)巨大的應(yīng)用前景[14-15]。相比于傳統(tǒng)的W/O乳液而言，W1/O/W2得益于其獨特的“兩膜三相”結(jié)構(gòu)，內(nèi)水相（W1）中的親水性活性成分能夠更有效地被保護(hù)并且延緩釋放[16-17]，并且使其在水溶性體系（如人體胃腸道消化）中具有更好的分散性。雙重乳液的構(gòu)建需要兩步乳化過程完成，并且其中包含使用具有親脂性和親水性乳化劑或表面活性劑穩(wěn)定W1/O/W2乳液的兩層油水界面膜，能夠降低界面張力。聚甘油蓖麻醇酸酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）是一種最常見的親脂活性劑，能夠有效地穩(wěn)定W1/O初乳液[18-19]。而多糖或蛋白質(zhì)被認(rèn)為是合適的乳化劑用于穩(wěn)定O/W2乳液的界面，由于其能夠有效抑制內(nèi)水相遷移擴散到外水相，提高雙重乳液在貯藏過程中的穩(wěn)定性[20-22]。辛烯基琥珀酸酐（octenyl succinic anhydride，OSA）淀粉由天然來源的淀粉與辛烯基琥珀酸酐通過酯化反應(yīng)合成，具有兩親性、低成本和安全性等優(yōu)點，已被廣泛用于穩(wěn)定O/W乳液，被認(rèn)為是阿拉伯樹膠最有前景的替代品[23-24]。目前，通過噴霧干燥和冷凍干燥等方法可以將液態(tài)的乳液轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的微膠囊顆粒[25]，改變產(chǎn)品性狀，便于運輸貯藏以及滿足消費者的需求。其中，冷凍干燥作為一種非熱加工技術(shù)，能夠降低加工過程中被包封物質(zhì)生物活性損失而受到廣泛的關(guān)注。所制備的微膠囊不僅對活性成分有著優(yōu)異的包封和緩釋性能，提高其穩(wěn)定性和生物利用度，而且能夠有效屏蔽被包埋物質(zhì)自身令人不愉悅或刺激的風(fēng)味。Yang Wen等[26]基于W1/O/W2雙重乳液結(jié)合冷凍干燥法制備了封裝牡蠣肽的微膠囊，電子鼻結(jié)果證實相比于相同濃度的牡蠣肽水溶液，復(fù)溶后的微膠囊仍具有雙重乳液結(jié)構(gòu)，并且表現(xiàn)出更低的異味。更重要的是，雙重乳液形成的微膠囊具有多層核殼結(jié)構(gòu)，油相中的親脂性抗氧化劑能夠?qū)?nèi)水相中被遞送的活性小分子起到很好的抗氧化保護(hù)作用，避免被溶解于外水相的氧氣氧化。

基于此，本實驗以硒肽水溶液作為內(nèi)水相（W1），VE油溶液作為油相，OSA淀粉溶液作為外水相（W2），通過兩步乳化法構(gòu)建W1/O/W2雙重乳液。在此基礎(chǔ)上，采用冷凍干燥固化法制備共封裝硒肽/VE微膠囊并評估其理化特性（圖1）。具體地，考察了兩種活性物質(zhì)（硒肽和VE）以及壁材OSA淀粉添加量對微膠囊包埋率的影響。結(jié)合激光粒度儀、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀等手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征分析；進(jìn)一步通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除實驗評估了微膠囊的抗氧化活性；采用體外模擬胃腸道消化和電子鼻實驗分別著重探究了微膠囊芯層中硒肽的緩釋規(guī)律和其不愉悅氣味的遮掩性能。相關(guān)的研究結(jié)果為具有兩種相反極性（親脂性和親水性活性小分子）的共包封提供了一種新策略，并且為富硒固態(tài)功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供了一種新思路。

圖1 共封裝硒肽-VE的微膠囊構(gòu)建及其性能評價示意圖Fig.1 Schematic diagram of fabrication and evaluation of microcapsules loaded with selenium-enriched peptides and VE

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OSA淀粉（PURITY GUM 2000）宜瑞安食品配料有限公司；PGPR、胰酶（其中淀粉酶和蛋白酶活力為100～350 U/mg，脂肪酶活力為10～75 U/mg）、胰脂肪酶（15～35 U/mg）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；植物硒肽粉 恩施德源硒材料工程科技有限公司；VE、膽鹽、胃蛋白酶（15000 U/g）上海麥克林生化科技有限公司；葵花籽油 益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T18 digital數(shù)顯型分散機 德國IKA公司；SM-1800A超聲波細(xì)胞破碎儀 南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；PX124ZH微量電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；Mastersizer 3000激光粒度儀 英國Marvin公司；SU8100 SEM 日本Hitachi公司；Nicolet 6700 FTIR儀美國Thermo Fisher科技公司；TGA 55熱重力分析儀美國TA儀器公司；D8 Advance X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 德國Bruker分析儀器公司；Alpha1-4冷凍干燥機 德國Christ公司；Enspire多功能酶標(biāo)儀 珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；PEN3型便攜式電子鼻 德國Airsense公司；HD-3A智能水分活度測量儀 北京圖拉揚科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 共封裝硒肽/VE微膠囊的制備

在構(gòu)建W1/O/W2雙重乳液的基礎(chǔ)上，采用冷凍干燥技術(shù)制備共封裝硒肽/VE微膠囊。首先將VE和硒肽分別溶于葵花子油和去離子水中，離心后取上清液，作為油相和內(nèi)水相（W1）。其次，在油相中加入PGPR作為親脂性乳化劑后混合均勻，繼續(xù)加入含有硒肽的水相（油水比7∶3），并在高速剪切（14000 r/min，2 min）和超聲（360 W，開3 s停3 s）處理后得到W1/O型初乳液。之后，將新鮮配制的OSA淀粉溶液作為外水相（W2）加入到初乳液中，依次經(jīng)過高速剪切（8000 r/min，2 min）和超聲（360 W，開3 s停3 s）處理后得到共封裝硒肽/VE的W1/O/W2雙重乳液。最后，將所制備的雙重乳液經(jīng)冷凍干燥后得到共封裝硒肽/VE微膠囊。在上述制備方法的過程中，通過調(diào)控OSA淀粉、VE和硒肽含量改善微膠囊的物化性質(zhì)。

1.3.2 共封裝硒肽/VE的W1/O/W2雙重乳液的形貌觀察

將適當(dāng)稀釋后的乳液樣品滴加于載玻片凹槽內(nèi)，蓋上蓋玻片后放置于顯微鏡下觀察，目鏡和物鏡的放大倍數(shù)分別為10 倍和20 倍。

1.3.3 共封裝硒肽/VE微膠囊的表征

1.3.3.1 粒徑

采用馬爾文激光粒度儀測試微膠囊的平均粒徑。分散介質(zhì)水和樣品的折光率分別為1.33和1.46。

1.3.3.2 微觀形貌將微膠囊樣品分散在導(dǎo)電膠表面，噴金處理后采用SEM觀察其形貌，其中加速電壓設(shè)置為1.0 kV。

1.3.3.3 FTIR

利用FTIR測定微膠囊的官能團(tuán)。將樣品與KBr粉末按照1∶100的比例研磨粉碎后壓片，置于檢測器中。具體參數(shù)設(shè)置為波數(shù)400～4000 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，波譜分辨率4 cm-1。

1.3.3.4 熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）

將微膠囊粉末（約5 mg）加入氧化鋁坩堝中，之后置于儀器爐膛內(nèi)進(jìn)行測試，具體測試條件為：溫度范圍30～700 ℃，升溫速率10 ℃/min，氮氣流速20 mL/min。記錄在不同溫度下的質(zhì)量損失率。

1.3.3.5 XRD

分別將空白微膠囊和微膠囊進(jìn)行壓片，用XRD儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。測試條件：掃描范圍2θ＝5°～70°，掃描速率2°/min。

1.3.3.6 水分活度

將微膠囊樣品放入傳感器內(nèi)，待讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄下微膠囊的水活度值。

1.3.3.7 電子鼻分析

將微膠囊粉末密封于樣品瓶中，2 h后采用電子鼻進(jìn)行測定。具體檢測條件為：傳感器清洗時間180 s，樣品檢測時間60 s，調(diào)零時間10 s，流量300 mL/min，進(jìn)樣流量300 mL/min。電子鼻所測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.4 微膠囊中兩種活性物質(zhì)包埋率測定

1.3.4.1 硒肽包埋率測定

取兩份相同質(zhì)量的微膠囊分別復(fù)溶于水中，前者渦旋10 s，之后在10000 r/min條件下離心至上清液澄清，所得到的上清液用0.45 μm濾膜過濾后得到微膠囊表面硒肽的溶液；而后者經(jīng)超聲破碎（360 W，5 min）后在10000 r/min條件下離心至上清液澄清，吸取上清液，用0.45 μm濾膜過濾得到微膠囊中硒肽的溶液。之后采用BCA蛋白試劑盒測定兩種溶液中硒肽的含量。微膠囊中硒肽的包埋率測定公式如下：

1.3.4.2 VE包埋率測定

4 mg VE標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，移取0、5、10、20、40、60、80、100 μL VE-無水乙醇溶液加入96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)孔中，再加入無水乙醇定容至200 μL，得到一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇為空白對照，采用酶標(biāo)儀測定溶液在285 nm處的吸光度，通過線性擬合得到VE含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

微膠囊表面VE提取：取適量的微膠囊分散到乙醇中，渦旋10 s，在10000 r/min條件下離心至上清液澄清，吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾后在285 nm波長處測定吸光度。微膠囊中VE提?。喝∵m量微膠囊分散到乙醇中，超聲破碎（360 W，5 min）后吸取1 mL溶液，在10000 r/min條件下離心至上清液澄清，吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾后在285 nm波長處測定吸光度。VE包埋率計算公式如下：

式中：m為微膠囊表面VE質(zhì)量；m0為微膠囊中VE質(zhì)量。

1.3.5 共封裝硒肽/VE微膠囊熱穩(wěn)定性評價

分別稱取0.5 g的硒肽和微膠囊粉末分散于10 mL去離子水中，置于60 ℃和100 ℃條件下持續(xù)攪拌，攪拌速率為100 r/min。分別在第15、30、60、90、120分鐘時取出反應(yīng)液，超聲破碎處理（360 W、10 min）后，高速離心（1200 r/min、10 min），取上清液，參考1.3.4.1節(jié)方法測定硒肽的含量，計算損失率，并以損失率對時間關(guān)系作曲線。

1.3.6 共封裝硒肽/VE微膠囊抗氧化活性評價

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力測定

在Shen Dongyu等[27]研究的基礎(chǔ)上稍作修改，對待測樣品的DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定。將100 μL待測樣品溶液和100 μL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合均勻，避光反應(yīng)30 min后在517 nm波長處測定吸光度。通過下式計算樣品的DPPH自由基清除能力：

式中：A1為待測樣品溶液與DPPH自由基乙醇混合溶液的吸光度；A2為待測樣品溶液與無水乙醇混合溶液的吸光度；A0為DPPH自由基乙醇溶液與待測樣品溶劑混合液的吸光度。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參考賈蕾[28]方法對待測樣品的ABTS陽離子自由基清除能力進(jìn)行測定。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液等體積混合，避光靜置16 h后得到ABTS陽離子自由基工作液。在測定前，先用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將ABTS陽離子自由基工作液稀釋20 倍，然后將20 μL待測樣品溶液和200 μL ABTS陽離子自由基稀釋液混合均勻，避光反應(yīng)6 min后，測定其在734 nm波長處的吸光度。通過下式計算樣品的ABTS陽離子自由基清除能力：

式中：A1為待測樣品溶液與ABTS陽離子自由基稀釋液混合后的吸光度；A0為ABTS陽離子自由基稀釋液的吸光度。

1.3.7 微膠囊的體外模擬胃腸道消化特性研究

參考Wang Qiang等[29]的方法，通過模擬人體消化過程探究微膠囊中硒肽的緩釋規(guī)律及對其穩(wěn)定性的影響。模擬胃液配制：準(zhǔn)確稱取0.32 g胃蛋白酶和0.2 g氯化鈉溶于100 mL去離子水中，胃蛋白酶質(zhì)量濃度為3.2 g/L，并將溶液pH值至1.2。模擬腸液配制：稱取1.64 g NaCl、0.21 g CaCl2、0.30 g脂肪酶、0.30 g胰酶和0.95 g膽鹽溶于50 mL PBS，然后用氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)至7.4。在模擬胃腸道消化過程中，首先分別稱取適量的硒肽、雙重乳液和微膠囊置于20 mL模擬胃消化液中，然后置于37 ℃恒溫水浴中，在120 r/min條件下振蕩2 h。之后，取10 mL模擬胃消化產(chǎn)物，加入到13 mL模擬腸液中，在37 ℃條件下振蕩（120 r/min，2 h），在第0、15、30、60、120分鐘取5 mL反應(yīng)液并補充5 mL緩沖液。最后，將最終消化溶液超聲處理后，在12000 r/min離心10 min，取上清液，參考1.3.4.1節(jié)方法測定硒肽含量，并采用pH-stat法測定小腸階段中樣品游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）釋放情況[30]，在模擬腸液消化過程中持續(xù)加入氫氧化鈉溶液，維持溶液體系pH 7.0，通過消耗氫氧化鈉的量計算FFA釋放率，公式如下：

式中：Vt為t時間下中和反應(yīng)消耗氫氧化鈉的體積/L；c為氫氧化鈉溶液的濃度/（mol/L）；M為葵花籽油的平均分子質(zhì)量/（g/mol）；m為消化樣品中油相的質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 OSA淀粉、硒肽和VE添加量對W/O/W乳液及其微膠囊的影響

OSA淀粉和兩種活性物質(zhì)含量對乳液的粒徑和電位的影響結(jié)果如圖2A～C所示。液滴表面均為負(fù)電荷，這可能與含有羧基的OSA淀粉有關(guān)，并且Zeta電位絕對值隨著其含量增加而表現(xiàn)出降低的趨勢。少量的OSA淀粉（10%和15%）無法完全包裹油滴，可能會引起并聚等不穩(wěn)定現(xiàn)象發(fā)生，從而導(dǎo)致油滴粒徑增大。進(jìn)一步增加OSA淀粉含量時，乳液的粒徑并未發(fā)生顯著的變化，這可能是由于油滴表面包裹的OSA淀粉達(dá)到飽和[31]。硒肽和VE的加入對乳液表面的電位影響較小，Zeta電位在-8～-18 mV區(qū)間內(nèi)變化。當(dāng)硒肽的添加量從5%增加到30%時，乳液粒徑略微從3.62 μm增加到6.86 μm。硒肽添加量增加提高了初乳液的黏度，導(dǎo)致在剪切和超聲過程液滴難以被破壞，提高了液滴粒徑。相似地，Zhu Qiaomei等[32]的研究結(jié)果也表明提高內(nèi)水相中明膠的濃度，有助于W/O/W乳液的粒徑增大。油相中VE添加量的增加（0.5%～2%）對乳液粒徑?jīng)]有明顯影響，但過多的VE（4%）導(dǎo)致乳液粒徑反而略有上升。進(jìn)一步評估3 種物質(zhì)添加量對冷凍干燥后的微膠囊粒徑和水分活度影響，結(jié)果如圖2D～F所示。OSA淀粉和硒肽添加量對微膠囊水分活度的影響相似，水分活度值隨其添加量增加整體上在0.30～0.45區(qū)間內(nèi)逐漸降低。然而，當(dāng)OSA淀粉添加量為30%時，水分活度反而增加，這可能是由于乳液在冷凍干燥過程中不穩(wěn)定，液滴粒徑增大，單位面積需要更多的OSA淀粉含量，從而導(dǎo)致壁材對水的結(jié)合能力增強。壁材在高濃度下有利于微膠囊壁更為緊湊，防止了水分進(jìn)入內(nèi)部，從而使微膠囊水分活度降低。

圖2 OSA淀粉、硒肽和VE添加量分別對W/O/W乳液（A～C）和微膠囊（D～F）理化性質(zhì)的影響Fig.2 Effects of OSA starch,selenium-enriched peptides,and VE concentration on the physicochemical properties of W/O/W emulsion (A–C) and microcapsules (D–F)

2.2 添加不同量OSA淀粉、硒肽和VE的微膠囊包埋率

如圖3所示，OSA淀粉作為水溶性壁材，其含量對油相中的VE的包埋率幾乎沒有明顯的影響，保持在50%左右，而硒肽的包埋率隨著OSA淀粉添加量的增加表現(xiàn)出先增加后保持不變的趨勢。OSA淀粉作為外水相和油相的界面乳化劑，在濃度較低時所形成的界面膜較薄，這使得內(nèi)水相容易與外水相接觸后逃逸，造成多重乳液體系中內(nèi)水相中的硒肽含量降低，以及所得到的微膠囊中硒肽的包埋率較低。相反，OSA淀粉添加量增加提高了界面膜的厚度，在內(nèi)水相起到了物理阻隔作用，限制了內(nèi)水相的逃逸從而有利于硒肽的包封。然而，過多的OSA淀粉游離于外水相中，在高能量的機械攪拌和超聲條件下可能與硒肽小分子形成復(fù)合物，從而導(dǎo)致內(nèi)水相中硒肽的包埋率略有降低。隨著硒肽和VE的添加量逐漸增加，VE的包埋率幾乎保持不變（～50%），而硒肽的包埋率逐漸降低。這可能是由于硒肽作為蛋白質(zhì)水解物，具有兩親性，過量的硒肽被吸附到油相和內(nèi)水相界面，中性環(huán)境中帶正電荷的硒肽與壁材帶負(fù)電荷的OSA淀粉通過靜電相互作用力接觸，之后逃逸整個W/O/W乳液體系，導(dǎo)致包埋率降低。

圖3 OSA淀粉、硒肽和VE添加量對包埋率的影響Fig.3 Effects of OSA starch,selenium-enriched peptides,and VE concentration on the encapsulation rate

2.3 乳液和微膠囊的微觀結(jié)構(gòu)

采用光學(xué)顯微鏡和SEM分別觀察硒肽/VE共封裝的W/O/W乳液和微膠囊的微觀形態(tài)。圖4A、B分別為W/O/W乳液和微膠囊水分散液的光學(xué)顯微鏡圖像。部分小液滴位于大液滴內(nèi)部，參考Florence等[33]分類方法，表明該乳液是典型的B型W/O/W乳液，并且冷凍干燥制備的微膠囊重新分散后表現(xiàn)出相似的現(xiàn)象，液滴粒徑約為（13.94±6.58）μm。圖4C、D為微膠囊的SEM圖。冷凍干燥處理后，得到的微膠囊表面粗糙，囊壁由于冷凍干燥導(dǎo)致部分塌陷，形成了褶皺，但結(jié)構(gòu)緊湊，能夠有效減少外界因素（如水分等）進(jìn)入內(nèi)部，從而有效降低水分活度（圖2），并且對內(nèi)部兩種活性物質(zhì)具有較好的保護(hù)屏障作用。

圖4 W/O/W乳液（A）和微膠囊分散液（B）的光學(xué)顯微鏡圖像和微膠囊放大500（C）、2000 倍（D）的SEM圖Fig.4 Optical microscopic images of W/O/W emulsion (A) and microcapsule dispersion (B),and SEM images of microcapsules (C ×500,and D × 2000)

2.4 微膠囊的結(jié)構(gòu)表征

如圖5A所示，未包封兩種活性物質(zhì)的空白微膠囊FTIR圖表現(xiàn)出多糖類壁材（OSA淀粉）典型的特征吸收峰：O—H的伸縮振動寬譜帶（3300 cm-1）和葡萄糖環(huán)骨架中C—O的伸縮振動峰（1147 cm-1和993 cm-1），而在1743 cm-1處尖峰可能歸因于葵花籽油中甘油三酯的C＝O伸縮振動[34]。對于硒肽和VE單獨的紅外光譜圖，1578 cm-1和2800～3000 cm-1處的吸收峰分別對應(yīng)中酰胺II帶和脂肪族長碳鏈中C—H的伸縮振動，而包封后的微膠囊并未出現(xiàn)新的吸收峰。結(jié)合包埋率的測定結(jié)果可以證實兩種活性物質(zhì)被成功地包埋在微膠囊內(nèi)部。圖5B中空白微膠囊具有兩個無定形的寬峰（2θ＝9.2°和20.0°），表現(xiàn)出典型的V型單螺旋結(jié)構(gòu)[35]，而兩種活性成分的摻入對其晶體結(jié)構(gòu)無明顯影響。

圖5 微膠囊結(jié)構(gòu)的FTIR（A）和XRD（B）圖Fig.5 FTIR spectra (A) and XRD patterns (B) of microcapsules

2.5 微膠囊熱穩(wěn)定性分析

硒肽的熱降解過程主要分為3 個階段：1）第1階段為25～150 ℃，熱損失主要是由于吸附的自由水和結(jié)合水揮發(fā)；2）第2階段為150～400 ℃，微膠囊熱損失速率快速下降，歸因于氨基酸分子鏈的脫水裂解、脫羧等反應(yīng)；3）由于脫羧反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)生，質(zhì)量損失隨著溫度升高進(jìn)一步下降，但相對于第2階段更為平緩。如圖6A所示，微膠囊化后，在277 ℃左右的降解趨勢更為平緩，主要是硒肽的氨基酸鏈裂解，這表明微膠囊能夠提高芯材硒肽的熱穩(wěn)定性，而在400 ℃左右的熱損失主要歸因于多糖壁材葡糖鏈的斷裂。如圖6B、C所示，在60 ℃水體系中，微膠囊化前后的硒肽損失率均隨著時間的延長（從0～120 min）而升高，但微膠囊化后的硒肽損失率顯著低于未封裝的硒肽，因此延緩了硒肽熱損失速率，起到了一定的保護(hù)作用，在120 min后兩者損失率幾乎相同，約為15%，這可能是由于微膠囊多糖壁材在水溶液中逐漸被溶解，微膠囊結(jié)構(gòu)逐步被破壞。而在100 ℃空氣體系條件下，硒肽的損失率隨著時間延長而增加，在120 min后損失率達(dá)（32.8±0.5）%，而微膠囊化后硒肽隨著時間延長表現(xiàn)出先增加后幾乎保持不變的趨勢，在120 min后損失率僅為（15.0±4.2）%，顯著低于未封裝的硒肽。且硒肽在開始的60 min內(nèi)損失可能是由于未包封或微膠囊表面少量的硒肽損失所導(dǎo)致，而芯層部分的硒肽幾乎不受溫度影響。綜上，微膠囊對硒肽起到了較好的保護(hù)作用，延緩了其在高溫下的損失，提高了硒肽的熱穩(wěn)定性。

圖6 微膠囊前后硒肽的TGA曲線（A）以及其在60℃水（B）和100℃空氣（C）體系中的損失率變化Fig.6 TGA curves (A) of free and encapsulated selenium-enriched peptides and its mass loss rates in water at 60℃ (B) and air at 100℃ (C)

2.6 封裝前后微膠囊的抗氧化活性

硒肽和VE兩種功能性成分已被證實具有較高的抗氧化活性。比較共封裝硒肽和VE的微膠囊和兩種功能性成分對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力，用以評估其抗氧化活性（圖7）。如圖7A所示，硒肽和VE對DPPH自由基清除率分別為93%和31.2%，將其封裝于微膠囊后，DPPH自由基清除率為45.50%。微膠囊對DPPH自由基清除能力介于兩種活性成分中間。ABTS陽離子自由基清除實驗也表現(xiàn)出相似的結(jié)果（圖7B），三者對ABTS陽離子自由基清除率大小順序為：VE＞微膠囊＞硒肽。微膠囊化后，兩種活性物質(zhì)仍賦予了體系較高的抗氧化活性。

圖7 DPPH自由基（A）和ABTS陽離子自由基（B）清除測試評估微膠囊的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of microcapsules evaluated by DPPH radical (A) and ABTS cation (B) radical-scavenging assays

2.7 模擬體外消化實驗結(jié)果

圖8A為不同體系（游離、乳液和微膠囊）下硒肽在模擬胃液中的保留率變化。游離的硒肽在120 min消化后保留率僅為31.92%，顯著低于在乳液和微膠囊包封狀態(tài)下的保留率，分別為70.21%和72.14%。封裝狀態(tài)下的硒肽在前15 min內(nèi)損失率較高，但30 min后硒肽的損失率基本保持不變，可能是由于少量未被封裝的硒肽釋放到模擬胃液中所導(dǎo)致，這與微膠囊在60 ℃水體系下熱穩(wěn)定性測試結(jié)果一致。酸性條件下，OSA淀粉發(fā)生質(zhì)子化，表面電荷降低，結(jié)構(gòu)更為緊湊，對硒肽的釋放起到了屏障作用。而在模擬腸液中（圖8B），前30 min內(nèi)，微膠囊的硒肽損失率迅速升高，而30 min后保留率逐漸趨于平緩。游離的硒肽在120 min內(nèi)的保留率僅為8%，同樣顯著低于被封裝的硒肽。相比于相同時間內(nèi)模擬胃液消化階段，模擬腸液消化階段微膠囊中的硒肽保留率更低，這表明硒肽被更多的釋放到腸液中，有利于人體的吸收。一方面可能是由于在中性環(huán)境下帶有羧基的OSA淀粉發(fā)生去質(zhì)子化，表面電荷增加；另一方面歸因于脂肪酶解油相，從而導(dǎo)致內(nèi)水相中的硒肽被釋放。因此，進(jìn)一步評估了模擬腸液消化過程中FFA釋放率，結(jié)果如圖8C所示。在脂肪酶的作用下，油相會分解為甘油和FFA，微膠囊和W/O/W乳液的FFA釋放速率隨著消化的過程均呈現(xiàn)先增加后趨于平緩趨勢。在消化時間為120 min后，W/O/W乳液的FFA釋放率為27.6%，低于微膠囊中FFA釋放率（40.3%）。微膠囊重新分散在水溶液體系中，多糖壁材逐漸被溶解，由于沒有高能量攝入，無法重新吸附在油相和外水相界面，因此相比于W/O/W乳液，微膠囊的油相與脂肪酶接觸面積更大，導(dǎo)致更高的脂肪酸釋放率。此外，內(nèi)水相中的硒肽仍然被油相包裹，這與乳液中油相包裹內(nèi)水相的結(jié)構(gòu)相似，因此微膠囊和乳液體系中的硒肽保留率變化趨勢幾乎一致。

圖8 體外模擬胃腸道消化過程中硒肽的保留率Fig.8 Retention rate of selenium-enriched peptides during in vitro simulated digestion

2.8 電子鼻測定結(jié)果

電子鼻是一種模擬動物嗅覺的氣味識別儀器，能夠通過特定的傳感器獲取豐富的氣味指紋信息，如W1C（芳香成分和苯）、W5S（氮氧化合物）、W3C（芳香組分和氨類物質(zhì)）、W5C（氫化合物）、W1S（甲基類物質(zhì)）、W1W（硫化物）、W2S（醇、醛和酮）、W2W（芳香組分和有機硫化物）和W3S（含長鏈烷烴物質(zhì)）。植物中提取的天然硒肽存在令人不愉悅的氣味，這使得其在富硒功能食品開發(fā)及實際應(yīng)用中具有一定局限性。因此，進(jìn)一步采用電子鼻評估微膠囊化對硒肽氣味的遮掩能力，相應(yīng)的氣味信息如圖9A所示。硒肽樣品的氣味主要來源于烷烴類物質(zhì)（W3S）、芳香成分和有機硫化物（W2W）、氮氧化合物（W5S）、硫化物（W1W）。其中，令人不愉悅的氣味主要來源于氮氧化合物（W5S）和硫化物（W1W）[26]。而微膠囊化硒肽樣品的氮氧化合物（W5S）和硫化物（W1W）的響應(yīng)值顯著降低，表明其令人不愉悅的異味降低，這與人自身嗅覺的感官結(jié)果一致。進(jìn)一步對微膠囊化前后硒肽的揮發(fā)性成分進(jìn)行PCA（圖9B）。硒肽樣品的PC1與PC2的累計貢獻(xiàn)率達(dá)到83.1%，表明其能夠有效反映樣品的主要信息。硒肽樣品的氣味區(qū)域分布較為集中，而微膠囊化后硒肽的氣味區(qū)域分布較為分散，并且兩區(qū)域無重疊，橫坐標(biāo)距離較大，這表面微膠囊化前后硒肽的揮發(fā)性氣味具有顯著性變化。上述結(jié)果證實了微膠囊化能夠?qū)ξ牧钊瞬挥鋹偟臍馕哆M(jìn)行有效遮掩，提高人們對硒肽氣味的接受程度。

圖9 硒肽與微膠囊的電子鼻測試?yán)走_(dá)圖（A）和PCA圖（B）Fig.9 Radar (A) and PCA plots (B) of electronic nose analysis of selenium-enriched peptides and microcapsules

3 結(jié)論

本研究通過乳化-干燥法構(gòu)建了具有不同極性的兩種活性物質(zhì)（親水性硒肽和親脂性VE）的共封裝微膠囊體系。單因素試驗結(jié)果表明：當(dāng)OSA淀粉、硒肽和VE添加量分別為15%、5%和0.5%時，所制備的微膠囊的硒肽和VE的包埋率都達(dá)到最高。微膠囊在水溶液中具有較好的分散性，并且保留了雙重乳液的結(jié)構(gòu)，具有較好的水復(fù)溶性。TGA和熱穩(wěn)定性分析結(jié)果表明硒肽在微膠囊體系中具有更高的熱穩(wěn)定性，能夠抵抗胃階段的消化，保持乳液的狀態(tài)并使其耐受低pH值和胃蛋白酶的作用，保持超過70%的硒肽保留率。消化主要發(fā)生在模擬腸道階段，在消化酶作用下，乳液結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)FA釋放率增加，硒肽保留率逐漸降低，在小腸中逐漸緩釋。電子鼻測試結(jié)果也證實微膠囊化可以對硒肽自身的異味起到良好的遮掩作用。上述相關(guān)研究結(jié)論可為硒肽作為硒營養(yǎng)強化劑以及其在多功能食品和特殊膳食品開發(fā)提供指導(dǎo)，為強化人們?nèi)粘Ｉ攀持形氐墓?yīng)，滿足人們的營養(yǎng)健康需求提供途徑。