韓顥穎，王亞東，韓兆盛，王 蓓,，付翠霞，趙 爽，喬琳雅，姚 歡,

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048；2.君樂寶乳業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 050221）

近年來規(guī)?；翀鲆殉蔀樯a(chǎn)主體，牛奶的規(guī)?；a(chǎn)能夠保證奶牛、飼料、技術(shù)等的一致性，但不同地區(qū)的環(huán)境因素仍會造成牛奶中脂肪、蛋白質(zhì)等品質(zhì)指標(biāo)存在差異[1]，進(jìn)而導(dǎo)致不同牧場牛奶之間的風(fēng)味差異。牛奶風(fēng)味是決定消費者購買與否的重要因素之一。目前關(guān)于牛奶風(fēng)味的研究大多集中在不同殺菌方式的比較方面[2]，對于不同地區(qū)牧場牛奶風(fēng)味差異的研究較少。

牛奶的感官評價方法主要有定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）法、勾選所有適合項（check-all-that-apply，CATA）法等。QDA法是牛奶中最常用的感官分析方法[3]，但QDA法評價步驟復(fù)雜、培訓(xùn)時間長，并不能從感官和喜好度的角度了解消費者對牛奶的感知。據(jù)報道，CATA法是收集有關(guān)消費者對食品/飲料產(chǎn)品感官特征感知的信息的快速可靠的方法[4]，提供的信息與訓(xùn)練有素的評估人員使用描述性分析獲得的信息相似[5]。Yang Yang等[6]采用QDA法和CATA法對7 種市售棕色酸奶（5 種低溫和2 種常溫）進(jìn)行感官評價，兩者均能有效區(qū)分褐色酸奶的感官性質(zhì)且分類結(jié)果一致，其中焦糖味和棕色的得分和使用頻率在兩種方法中都是最高的。目前，CATA法已被用于酸奶[6]、奶酪[7]、乳品甜點[8]、冰淇凌[9]等多種乳制品的感官屬性分析中，但關(guān)于牛奶感官評價的報道卻很少。

牛奶基質(zhì)復(fù)雜，其中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度較低[10]，頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)因其具有選擇性高、靈敏度高、無需溶劑、樣品量低及檢測快速的特點常用于牛奶中揮發(fā)性化合物的萃取[11]。近年來的應(yīng)用實踐發(fā)現(xiàn)，頂空-箭型固相微萃?。℉S-SPME-Arrow）的萃取頭萃取涂層的厚度得到提高，萃取體積相較于SPME有所提高，更適合于揮發(fā)性化合物濃度較低的樣品檢測[12]。因此可將HS-SPME-Arrow結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)應(yīng)用于乳制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究中。而GC-MS只是一種間接測量揮發(fā)性化合物的方法，不能夠單獨分析香氣活性化合物，氣相色譜-嗅覺（gas chromatographyolfactometry，GC-O）測定法[13]可用于表征食物樣品的氣味活性，即使用人的鼻子作為探測器，與氣相色譜相結(jié)合感知氣味化合物，能夠更加直觀地確定具有香氣活性的風(fēng)味組分，從而更有效地從大量揮發(fā)性化合物中識別出香氣活性物質(zhì)，該方法已普遍用于各類食品風(fēng)味的研究[14-15]。

本研究以4 個不同感官特性牧場的牛奶為研究對象，采用CATA法、GC-MS以及GC-MS-O聯(lián)用技術(shù)研究了牛奶的感官特征和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。采用單因素方差分析、對應(yīng)分析（correspondence analysis，CA）和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）等方法，分析影響不同牧場牛奶感官差異的香氣活性化合物，以期為實際乳品工業(yè)中的牛奶感官品質(zhì)的控制提供進(jìn)一步的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從河北的6 個牧場獲取6 份牛奶樣品，通過初步感官評價（數(shù)據(jù)未顯示）篩選出4 種感官差異較大的牛奶樣品，分別標(biāo)記為一牧、二牧、三牧、四牧（表1）。

正構(gòu)烷烴（C7～C30，色譜純）美國o2si smart solutions公司；2-甲基-3-庚酮（色譜純）美國Sigma公司；二氯甲烷、乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸、苯乙酮、1-辛烯-3-醇、己醛、癸醛、2-庚酮、苯乙烯、檸檬烯（均為分析純）北京化學(xué)試劑公司；氦氣（純度99.99%）北京氦普北分公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A型GS-MS聯(lián)用儀、DB-WAX型毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、SPME Arrow 1.10 mm：DVB/Carbon WR/PDMS萃取頭 美國Agilent公司；7890B-ODP3 GC-O儀 德國Gerstel公司；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；BILON-XH-D漩渦混合器 上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

利用SPME-Arrow萃取頭進(jìn)行風(fēng)味化合物的萃取，并對提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后的條件：10 g樣品置于40 mL的頂空瓶中，向其中加入1 g氯化鈉提高萃取效率，并向其中添加1 μL質(zhì)量濃度為0.816 mg/mL的2-甲基-3-庚酮作為內(nèi)標(biāo)。在45 ℃水浴鍋中平衡20 min后，利用SPME-Arrow的萃取頭吸附30 min，在GC-MS中解吸5 min。

1.3.2 GC-MS條件

色譜條件：DB-WAX型毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μ m），以氦氣作為載氣，設(shè)置恒定流速1.2 mL/min。升溫程序：起始柱溫為40 ℃，以4 ℃/min升溫到230 ℃，維持2 min。采用不分流模式。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z35～350。

1.3.3 GC-MS-O條件

采用配備嗅覺檢測端口的G C-M S。高純氮氣（99.99%）作為GC-O分析的載氣。嗅聞口與質(zhì)譜儀進(jìn)樣分流比1∶1，嗅聞口和傳輸線的溫度分別保持在230 ℃和250 ℃，在檢測口通入濕潤的空氣。其他條件同1.3.2節(jié)GC-MS條件。由4 名有牛奶感官經(jīng)驗的小組成員進(jìn)行，針對牛奶香氣物質(zhì)對評價員進(jìn)行額外12 h培訓(xùn)（每周3 h，共4 周）。嗅聞時，實時記錄香氣化合物出現(xiàn)的時間、氣味特征以及氣味強(qiáng)度（aroma intensity，AI）。參考文獻(xiàn)方法[16-17]并進(jìn)行調(diào)整，將AI分5 個等級，分別以0、1、2、3、4 分的形式表示香氣強(qiáng)度，“0”表示未識別到任何氣味，“1”表示可以準(zhǔn)確識別氣味但持續(xù)時間短，“2”表示能快速識別氣味且持續(xù)時間長，“3”表示能準(zhǔn)確快速識別氣味且持續(xù)時間較長，“4”表示能準(zhǔn)確快速識別氣味且持續(xù)時間更長。如果2 個及其以上的小組成員感知到氣味，就確定一個香氣活性物質(zhì)。

1.3.4 定性定量分析

采用NIST14 譜庫、計算化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）與文獻(xiàn)中的保留指數(shù)進(jìn)行對比以及比對嗅聞結(jié)果對牛奶中化合物進(jìn)行定性分析。RI計算：將正構(gòu)烷烴C7～C30與牛奶在相同的色譜條件下得出GC保留時間，根據(jù)公式計算待測物i的RI（tn＜ti＜tn+1）：

式中：n為碳原子數(shù)；tn為碳原子數(shù)為n的正構(gòu)烷烴的保留時間；tn+1為碳原子數(shù)為n+1的正構(gòu)烷烴的保留時間；ti為樣品i的保留時間。

定量分析：內(nèi)標(biāo)半定量法，根據(jù)化合物及內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值計算各揮發(fā)性組分的濃度。對嗅聞得到的香氣活性物質(zhì)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法（內(nèi)標(biāo)為2-甲基-3-庚酮）精確定量。

1.3.5 感官評價

從北京工商大學(xué)學(xué)生中招募到50 名未經(jīng)培訓(xùn)的消費者（18 名男性和32 名女性，年齡19～25 歲）完成CATA問卷（圖1）。實驗開始前，每個參與者都簽署了一份知情同意書，參與者均具有長期飲用牛奶的習(xí)慣（每周至少5 次）。并對招募的消費者評價員進(jìn)行實驗所需的流程介紹以及感官評價等基本知識培訓(xùn)。

圖1 CATA問卷示例Fig.1 Example of CATA questionnaire

CATA問卷中的感官屬性在文獻(xiàn)[18-19]及實驗室感官評價專家小組討論確定的基礎(chǔ)上，再由10 名消費者集體討論，根據(jù)樣品本身的屬性以及參與者的語言習(xí)慣對描述詞進(jìn)行調(diào)整后最終確定。在回答完每個評估樣本的CATA問題后，參與者還需要使用1～9 分的享樂量表對樣品的總體喜愛程度進(jìn)行評分。

將4 份15 mL的牛奶樣品置于30 mL的品評杯中。樣本隨機(jī)3 位數(shù)編碼呈送給參與者。期間還提供了無鹽餅干和瓶裝凈水清潔口腔。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析比較GC-MS測得的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的半定量及精確定量結(jié)果，并采用Tukey事后比較法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（以P＜0.05表示差異顯著）。CATA數(shù)據(jù)以感官屬性的頻率表示，通過具有顯著差異的氣味描述詞進(jìn)行CA，將氣味屬性的頻率和4 個牛奶樣本之間的相關(guān)性可視化。使用PLSR，以探索CATA氣味感官屬性（頻率）與香氣活性物質(zhì)之間的關(guān)系。利用IBM SPSS Statistics 23、SIMCA 14及Origin 2018等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶樣品的感官分析

50 名參與者通過CATA問卷對牛奶樣品的感官屬性進(jìn)行勾選，表2顯示了4 個牛奶樣本的22 個感官屬性描述詞的使用頻次，包括10 個氣味、4 個滋味、4 個口感和4 個外觀。其中描述氣味的奶香味、奶油味，描述滋味的甜味，描述口感的醇厚以及描述外觀的流動性好為參與者勾選最多的描述詞，而氣味描述詞紙板味，滋味描述詞回味-澀味、口感描述詞顆粒感和外觀描述詞流動性差則是勾選頻率最低的。由表3可知，4 個牧場牛奶樣品喜好度評分均存在顯著差異（P＜0.05）。以上表明參與者傾向于使用奶香味、奶油味、甜味變量描述牛奶樣品的風(fēng)味，它們是牛奶中普遍存在的風(fēng)味屬性，也是消費者所喜愛的風(fēng)味屬性。

表2 由參與者（n ＝50）為4 個牧場牛奶樣品選擇的屬性的頻次Table 2 Frequency of sensory attributes selected by participants(n=50) for milk samples from four pastures

表3 參與者（n ＝50）對4 個牧場牛奶樣品整體喜好度評分Table 3 Overall preference scores of participants (n=50) for milk samples from four pastures

此外，根據(jù)Cochran’s Q-test，在10 個氣味屬性中，50 位參與者能夠顯著區(qū)分4 個牛奶樣品中的7 個氣味屬性，分別為奶香味、奶油味、香甜味、奶腥味、塑料味、蒸煮味、金屬味，在回味-奶香味、氧化味和紙板味的氣味屬性上沒有顯著差異。利用CA將7 個氣味屬性與來自4 個牧場的牛奶樣品之間的關(guān)系可視化（圖2）。CA的結(jié)果顯示F1和F2的總解釋量為96.25%。一牧牛奶樣本位于第2象限，與奶油味和奶香味CATA變量呈正相關(guān)，且喜好度評分最高（表3）。二牧位于第3象限，與香甜味有關(guān)。三牧則位于第1象限，其喜好度評分最低，與金屬味、塑料味呈正相關(guān)，而四牧位于第4象限，與奶腥味、蒸煮味、氧化味等不愉快的氣味有較強(qiáng)的相關(guān)性。綜上所述，4 個牧場牛奶樣品感官差異明顯，未經(jīng)訓(xùn)練的小組成員可以很好地將其進(jìn)行區(qū)分。

圖2 CA中樣品與感官屬性對稱關(guān)聯(lián)圖Fig.2 Symmetric correlation between samples and sensory attributes in correspondence analysis

2.2 4 個牧場牛奶風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS分析

采用HS-SPME-Arrow-GC-MS初步分析造成4 個牧場牛奶樣品感官差異的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，圖3A清楚地顯示了4 個牧場牛奶樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量，共鑒定出37 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括酸類11 種、酮類3 種、醇類11 種、醛類6 種、酯類2 種以及萜烯類2 種、含硫化合物1 種和酚類物質(zhì)1 種。一牧和二牧的風(fēng)味物質(zhì)比三牧和四牧多，4 個樣品被檢測出17 種相同的成分。將4 個樣品中風(fēng)味物質(zhì)的種類通過含量進(jìn)行比較，如圖3B所示?？梢钥闯?，一牧牛奶樣品風(fēng)味物質(zhì)釋放含量明顯高于其他3 個牧場，三牧和四牧樣本間的差異相對較小。其中一牧的酸類和酮類物質(zhì)含量最高，牛奶中的酸類物質(zhì)來源于脂肪分解、乳糖和氨基酸的降解[20-21]，而牛奶中的揮發(fā)性脂肪酸一般是指含偶數(shù)碳的中短鏈脂肪酸，如丁酸、己酸、辛酸等。此外，酸類除了能夠作為揮發(fā)性物質(zhì)外，還是酮類化合物的前體物質(zhì)[22]，酮類主要由熱加工過程中的脂肪降解和游離脂肪酸經(jīng)氧化為β-酮酸后脫羧反應(yīng)產(chǎn)生[23]。二牧中的醛類化合物含量在4 個樣品中最高，牛奶中的醛類化合物主要來源于脂肪酸代謝、氨基酸轉(zhuǎn)氨作用或Strecker降解[24]。醇類和酯類在所有樣品中均較少，牛奶中的醇類物質(zhì)可能來源于化學(xué)降解，也可能是由于微生物的活動產(chǎn)生的，醇類的風(fēng)味閾值較醛類高，因此對風(fēng)味的影響較醛類物質(zhì)低[25]。

圖3 4 個牧場牛奶揮發(fā)性風(fēng)味化合物種類及含量的Venn（A）、柱狀（B）和PCA（C）圖Fig.3 Venn diagram (A),bar plot (B) and PCA plot (C) of types and contents of volatile flavor compounds in milk samples from four pastures

為更直觀地分辨4 個牛奶樣品間的差異，基于其風(fēng)味物質(zhì)的定性定量結(jié)果，對樣品進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）（圖3C），PC1和PC2分別解釋了55.6%和29.3%的方差，兩個PC總方差貢獻(xiàn)大于80%，可以基本反映樣品整體信息。不同樣品在PC1上有較大差異。三牧和四牧在PC1上投影較近，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)較為相似，一牧、二牧則與上述兩個樣品相距較遠(yuǎn)，表明揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差別較大。與一牧相關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)最多，均存在PC1的負(fù)軸上，如中短鏈脂肪酸、2-庚酮、壬醛等。而二牧與3-己醇、辛醇、糠醛、苯乙烯、苯甲酸等物質(zhì)距離較近。三牧和四牧與2-戊醇、檸檬烯、己醛、苯乙酮等揮發(fā)性物質(zhì)聚集在一起。其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、己醛、檸檬烯、苯乙烯在韓兆盛等[26]的研究中也有發(fā)現(xiàn)，因此，這可能是造成牛奶感官差異的風(fēng)味物質(zhì)。

2.3 4 個牧場牛奶香氣活性物質(zhì)的GC-MS-O分析

基于GC-MS從牛奶樣品中共鑒定出37 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為進(jìn)一步確定引起4 個牧場牛奶樣品感官差異的主要香氣活性物質(zhì)，本研究進(jìn)一步采用GC-MS-O技術(shù)從中分析出AI≥1的14 種氣味活性物質(zhì)，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算這些香氣活性物質(zhì)在牛奶中的精確含量（表4），其中包括酸類7 種（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸）、酮類2 種（2-庚酮和苯乙酮）、醛類2 種（己醛和癸醛）、醇類1 種（1-辛烯-3-醇）以及萜烯類2種（檸檬烯和苯乙烯）。

表4 14 種嗅聞得到的香氣活性物質(zhì)的AI及精確定量Table 4 Aroma intensity and precise quantification of 14 aroma-active substances identified by olfactometry

為更清晰地了解4 個牧場牛奶樣品香氣活性物質(zhì)濃度的異同，對4 個牧場牛奶樣品的14 種香氣活性物質(zhì)的精確定量結(jié)果進(jìn)行熱圖和層次聚類分析，結(jié)果如圖4所示。橫向代表不同樣品間的濃度差異，縱向聚類結(jié)果代表14 種成分間的濃度差異關(guān)系，熱圖顏色由藍(lán)至紅反映各成分濃度由低至高。4 個牧場牛奶樣品熱圖聚類分析結(jié)果顯示，一牧牛奶樣品聚為第一類，說明一牧牛奶樣品的香氣活性物質(zhì)分布不同于其他3 個牧場，這主要與其短鏈脂肪酸含量顯著高于其他3 個牧場有關(guān)（P＜0.05）。它們分別為乙酸（AI＝1.5，63.55 μg/kg）、丁酸（AI＝2，22.31 μg/kg）、己酸（AI＝2，51.06 μg/kg）、辛酸（AI＝2.5，125.55 μg/kg）、壬酸（AI＝1.5，8.79 μg/kg）、癸酸（AI＝2.5，72.21 μg/kg），這些脂肪酸廣泛存在于牛奶中，其中丁酸在低濃度下具有較為濃郁的奶香味[27]，此外，苯乙酮（AI＝1，24.82 μg/kg）在一牧中的含量也最高，苯乙酮由苯基丙氨酸的β-氧化形成酮酸后經(jīng)脫羧生成[28]，且苯乙酮與奶酪的香氣強(qiáng)度呈正相關(guān)[29]。二牧聚為第二類，其中的十二酸（AI＝1，27.72 μg/kg）和檸檬烯（AI＝2.5，20.26 μg/kg）含量顯著高于其他牧場（P＜0.05），這可能是引起差異的主要香氣活性物質(zhì)，萜烯類化合物通常具有水果味、草本味或樹脂味[30]，F(xiàn)ernandez-Garcia等[29]報道了法國高原地區(qū)采集的牛奶中萜烯類濃度均高于平原地區(qū)。因此4 個牧場牛奶樣品間萜類物質(zhì)濃度的差異可能是由于地區(qū)不同。三牧和四牧聚為第3類，表示其香氣活性物質(zhì)分布整體上沒有顯著差異，這與兩者的香氣活性物質(zhì)含量普遍偏低有關(guān)。但從表4的定量結(jié)果可以得出己醛（AI＝2，52.89 μg/kg）和癸醛（AI＝1，36.06 μg/kg）在三牧中的含量均最高，醛類化合物在低濃度時，會產(chǎn)生令人愉悅的草本氣味[31]，且1-辛烯-3-醇是嗅聞得到唯一的醇類物質(zhì)且僅在三牧中出現(xiàn)，它具有典型的蘑菇香氣，超過適當(dāng)?shù)臐舛人?，會使牛奶有金屬味[27]。以上聚類結(jié)果與圖3C結(jié)果一致，表明這14 種香氣活性物質(zhì)是引起4 個牧場牛奶感官差異的主要貢獻(xiàn)者。

圖4 不同牛奶樣品14 種香氣活性物質(zhì)濃度聚類熱圖Fig.4 Clustering heatmap of 14 aroma-active substances in different milk samples

2.4 牛奶樣品香氣活性物質(zhì)與感官特性的相關(guān)性分析

基于PLSR的模型分析氣味CATA變量（Y變量）與香氣活性物質(zhì)（X變量）之間的相關(guān)性。PLSR結(jié)果如圖5所示。僅使用樣本間差異顯著的氣味CATA變量進(jìn)入模型。雙組分（cum）值在0.630～0.807之間，（cum）值在0.788～0.968之間。PLSR模型中的Q2值用于揭示氣味屬性（Y變量）和化合物（X變量）之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：一牧奶香味和奶油味較為明顯，這是令人愉悅的氣味特征，與短鏈脂肪酸類化合物，如丁酸、己酸、辛酸、癸酸以及2-庚酮等相關(guān)性較大，艾娜絲等[32]在分析全脂巴氏乳揮發(fā)性成分中得到了相似的結(jié)果；二牧具有香甜味，與檸檬烯相關(guān)性較大，也是令人愉悅的氣味；三牧具有塑料味、奶腥味、金屬味的氣味特性，其中金屬味與1-辛烯-3-醇相關(guān)性較大，與潘明慧等[27]的研究結(jié)果一致。四牧的蒸煮味較強(qiáng)，與苯乙烯、己醛的相關(guān)性較大，在Hedegaard等[19]對3 種不同脂肪酸組分的牛奶的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)蒸煮味與己醛高度相關(guān)。此外，三牧和四牧喜好度評分較低，己醛、苯乙烯、1-辛烯-3-醇與其有較大的相關(guān)性，這些物質(zhì)可能是令人不愉快的氣味來源。

圖5 4 個牧場牛奶的感官屬性與香氣活性物質(zhì)PLSR分析Fig.5 PLSR analysis of sensory properties and major aroma-active substances in milk samples from four pastures

3 結(jié)論

本實驗旨在揭示引起不同牧場牛奶感官差異的化合物。基于CATA問卷和GC-MS-O結(jié)果，采用PLSR分析可以得到，一牧最受小組成員喜歡，其奶香味和奶油味較為突出，與2-庚酮、丁酸、癸酸、己酸等化合物相關(guān)性強(qiáng)；二牧具有香甜味，這可能與檸檬烯的濃度有關(guān)；三牧和四牧的喜好度評分較低，其中三牧與金屬味、塑料味、奶腥味相關(guān)性較強(qiáng)，與1-辛烯-3-醇有關(guān)；四牧和蒸煮味有關(guān)，該氣味特征主要來自己醛和苯乙烯。此研究為牛奶生產(chǎn)商和產(chǎn)品開發(fā)者提供了有關(guān)感官質(zhì)量和未經(jīng)培訓(xùn)的牛奶感官評價參與者接受度的重要信息，可為牛奶品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。