楊沅思，坤吉瑞，代洪葦，童華榮

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

綠茶為中國傳統(tǒng)茶飲，屬不發(fā)酵茶，其加工過程包括殺青、揉捻、干燥3 道程序，以云南大葉種鮮葉為原料采用日光干燥方式制成的成品茶即為曬青綠茶（T/YNTCA 001—2021《曬青茶（大葉種）》）。曬青綠茶常被用作制作普洱生茶和熟茶的毛茶原料，因此其香氣組分是普洱茶獨特風味形成的基礎。揮發(fā)性物質在茶葉中含量低，卻是決定茶葉風味品質、產品等級和品質優(yōu)劣的一個重要指標[1]。研究顯示，曬青綠茶香氣清純持久，內含物成分較多，以萜類、醇類、酮類、酯類等揮發(fā)性物質為主[1-2]。在茶葉加工過程中其香氣前體可以通過糖苷水解、脂肪酸降解、類胡蘿卜素降解及美拉德反應4 個途徑降解或轉化產生香氣。本課題組前期研究發(fā)現，脂肪酸降解途徑是曬青綠茶香氣組分的重要來源。脂肪酸類是香氣物質，同時也是重要的香氣前體，在加工過程中通過酶促與非酶促氧化降解產生C5～C9類化合物，這些化合物是綠茶香氣的主要成分[3-4]。類胡蘿卜素影響干茶和葉底的色澤，同時也參與茶葉香氣的形成，對茶葉風味品質形成具有重要貢獻。類胡蘿卜素性質不穩(wěn)定，殺青和干燥工序的熱裂解與日光萎凋和曬干工序的光降解等非酶促氧化降解形成β-紫羅酮、二氫獼猴桃內酯、橙花叔醇等主要綠茶香氣物質[5-6]，這些物質通常閾值較低且具有特殊的香氣。目前關于茶葉香氣提取方法中的溶劑輔助風味蒸發(fā)萃?。╯olvent assisted evaporation extraction，SAFE）法作為一種溫和的揮發(fā)性化合物提取方法，可以從復雜的基質中較全面地分離出高沸點化合物，且相較于固相微萃取法對醇類、脂肪類物質有較好的提取效果，能夠全面真實地還原樣品風味，是目前香氣研究中一種較理想的香氣提取方法[7–9]。然而，關于SAFE在曬青綠茶香氣提取分離中的應用報道還較少。

目前關于普洱生茶和熟茶的風味研究報道較多，但對于其原料曬青毛茶的關注較少。本實驗基于分子感官科學和風味組學技術，探究了曬青綠茶的香氣及其前體在加工過程中的變化規(guī)律，其內容包括：采用SAFE法和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術測定曬青綠茶加工過程樣的揮發(fā)性成分；基于氣味活度值（odor activity value，OAV）表征不同加工階段的活性香氣化合物；利用氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）和高效液相色譜-二極管陣列檢測器（high performance liquid chromatography-photo-diode array，HPLC-PDA）分別測定其香氣前體脂肪酸和類胡蘿卜素組分的變化情況，探究香氣與香氣前體間關聯性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為以一芽二葉云南大葉種（Camellia sinensisvar.assamica(Masters) Kitamura cv.）制作曬青綠茶的加工過程樣，包括鮮葉、殺青葉、揉捻葉和曬青葉。制作于云南省臨滄市鳳慶縣春茗茶業(yè)有限公司。每個加工工序完成后取茶樣，進行微波固樣，真空冷凍干燥，磨碎過40 目篩后裝袋密封，-40 ℃保存待用。

月桂酸甲酯（純度99%）、肉豆蔻酸甲酯（純度98%）、棕櫚油酸甲酯（純度99%）、棕櫚酸甲酯（純度99%）、亞油酸甲酯（純度95%）、亞麻酸甲酯（純度99%）、硬脂酸甲酯（純度97%）梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；氯仿（GC級）、正己烷（GC級）、二氯甲烷（GC級）成都科隆化學品有限公司；無水吡啶（HPLC級）美國Aladdin公司；黃體素（純度98%）、玉米黃素（純度98%）、β-胡蘿卜素（純度98%）上海源葉生物科技有限公司；標準品（純度99%，GC級）上海阿拉丁生化科技股份有限公司和成都科隆化學品有限公司；C8～C25（≥99.5%）正構烷烴混合物 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

75 μm PDMS/DVB固相微萃取纖維 美國Supelco公司；SAFE裝置（定制）日本Kiriyama制作所；Trace1300型GC-FID儀 美國賽默飛世爾科技公司；QP2010Plus型GC-MS聯用儀、M20A HPLC-PDA儀日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性成分檢測

樣品前處理：稱取5.0 g茶粉于100 mL錐形瓶中，分3 次加入二氯甲烷萃取，合并萃取液，過濾。SAFE分離前，在合并液中加入50 μL內標癸酸乙酯（0.116 μL/mL），分離完畢后將收集瓶中的液體加入無水硫酸鈉，干燥后濃縮，最后轉移至進樣瓶，密封保存于-20 ℃冰箱，待測。

GC條件：色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛細管柱；進樣口溫度為250 ℃；柱箱升溫程序：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min升至130℃，然后以10 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min 升至260 ℃，保持 3 min；載氣為氦氣（純度＞99.999%）；流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣模式不分流。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～450，溶劑延遲5 min。

揮發(fā)性化合物定性定量分析：運用NIST08.LIB和NIST08s.LIB標準譜庫對GC-MS數據進行檢索比對，利用正構烷烴（C8～C25）測量計算保留指數（retention index，RI）以及查閱文獻RI定性。采用外標法定量，繪制標準曲線。

1.3.2 OAV與香氣貢獻度（aroma character impact，ACI）計算

OAV按照下式計算：

ACI按照下式計算：

式中：Ci為揮發(fā)性化合物i的濃度；Ti為揮發(fā)性化合物i的閾值；Oi為揮發(fā)性化合物i的OAV；k取值1,2,3…。

1.3.3 脂肪酸檢測

樣品前處理方法和GC-FID分析條件等參考文獻[2-10]。

脂肪酸的定性與定量：分別根據7 種脂肪酸甲酯標準品的保留時間定性；外標法定量，各脂肪酸甲酯的標準曲線，再結合各脂肪酸及其甲酯的分子質量，計算脂肪酸含量。

1.3.4 類胡蘿卜素檢測

樣品前處理：稱取0.1 g茶粉于研缽，分次加入80%丙酮溶液5 mL，研磨至勻漿狀態(tài)即可離心。離心完畢后，合并上清液，定容至5 mL，過0.45 μm有機膜至進樣瓶，-20 ℃冰箱保存待測。

HPLC-PDA分析條件：色譜柱為Waters C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相A為甲醇-乙腈-0.25 mol/L吡啶（50∶25∶25，V/V），流動相B為甲醇-乙腈-丙酮（20∶60∶20，V/V）；梯度洗脫程序為：0～22 min，100%～60% A、0%～40% B；22～28 min，60%～5% A、40%～95% B；28～38 min，5%～100% A、95%～0% B；38～40 min，100% A、0% B；柱箱溫度25 ℃，檢測波長340～740 nm，流速1 mL/min，進樣體積10 μL。

類胡蘿卜素組分定性、定量分析：參考Suzuki[11]、陳麗[12]等的方法，略作修改。類胡蘿卜素在特征吸收波長條件下，繪制標準曲線進行計算，無標準品的組分根據文獻[12-13]報道的替換計算方法進行定量。

1.4 數據分析

以上測定均重復3 次，使用IBM SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析（Duncan檢驗，P＜0.05），最后用Origin 2021作圖。

2 結果與分析

2.1 揮發(fā)性化合物在曬青綠茶加工過程中的變化

曬青綠茶加工過程樣檢出的揮發(fā)性物質主要有5 類：醇類、酮類、醛類、酯類和酸類（表1）。曬青成品茶中以醇類、酮類和醛類揮發(fā)性成分為主，與馬超龍[2]、尤秋爽等[14]研究結果相近，各類揮發(fā)性物質的數量有差異。本研究共鑒定出67 種揮發(fā)性物質，這可能與揮發(fā)性成分的萃取及檢測分析方法不同以及樣品的差異性有關。殺青葉中揮發(fā)性物質總含量最多，曬青葉中含量最少但種類為4 個加工樣中最多（圖1）。這說明雖然隨著工序進行，茶葉中原有的揮發(fā)性物質從量上發(fā)生降解與散失，但同時也存在香氣前體在熱化、光化作用下降解釋放了新的揮發(fā)性成分。

圖1 曬青綠茶加工過程揮發(fā)性物質分析Fig.1 Analysis of the number and amount of volatile compounds during the processing of sun-dried green tea

表1 曬青綠茶加工過程中揮發(fā)性化合物含量Table 1 Contents of volatile compounds during the processing of sun-dried green tea

醇類、酯類、醛類、酮類等化合物均是茶葉中重要的揮發(fā)性成分，對茶葉風味的形成不可或缺。本研究共鑒定出20 種醇類化合物，是4 個加工過程樣的揮發(fā)性物質中含量占比最高的一類成分，分別占揮發(fā)性成分總量的64.0%、67.9%、62.2%、28.7%，總體呈下降趨勢。醇類化合物大部分具有青味或愉悅的花香，其主要源于加工過程中糖苷水解及脂類氧化降解。曬青綠茶中檢測到主要的醇類物質有氧化芳樟醇、芳樟醇、辛醇、雪松醇、2-乙基己醇。雪松醇具有強烈的木香，在鮮葉中的含量最高，為8.83 mg/kg。具花香和樟木氣的芳樟醇在鮮葉中含量同樣很高，但整體呈下降趨勢；1-辛烯-3-醇具典型蘑菇香氣，在曬青葉中含量中等，因閾值較低對曬青綠茶特殊風味的形成起著不可忽視的作用[15]，為曬青綠茶香氣區(qū)別于其他綠茶香氣的重要物質之一[16]。另外，Su Dan等[17]通過正交偏最小二乘判別分析發(fā)現芳樟醇、香葉醇、植醇等物質是區(qū)別曬青綠茶與沱茶、磚茶的重要化合物。

酯類化合物總含量變化不大，但曬青之后略有增加。據文獻報道，脂質降解后會產生脂肪酸和醇，二者進行的酯化反應可生成具清甜香和水果香氣的酯類成分[18]。在各加工過程樣中檢測到較多的酯類成分主要包括呈脂肪氣的脂肪酸甲酯和具有冬青油和薄荷香氣的水楊酸甲酯[19]，其中水楊酸甲酯是茶葉的關鍵香氣化合物，但干燥后難以檢測到，可能是在日曬階段中發(fā)生了轉化或揮發(fā)，Fan Xiaowei等[20]也指出普洱生茶加工中酯類物質降低主要歸因于該物質的損失。此外，二氫獼猴桃內酯含量增加發(fā)生在曬青階段，由于其前體物質類胡蘿卜素降解速率與溫度有關，推測是日曬促進類胡蘿卜素降解，從而提高了二氫獼猴桃內酯的含量[21]。

醛類化合物共鑒定出14 種，在加工過程中整體呈下降趨勢。其中具有脂氣與青氣的壬醛含量在醛類物質中最高，曬青葉中未檢測出新生成的醛類物質。己醛呈現極典型的青氣[22]，在4 個處理下含量持續(xù)上升。苯乙醛是綠茶栗香的構成香氣之一，曬青后含量回升，推測是曬青葉中殘留酶的作用與光效應導致芳香族氨基酸發(fā)生氧化降解生成一部分苯乙醛[18]。有研究顯示，庚醛、癸醛、(E)-2-辛烯醛、辛醛這類C6～C9醛來源于脂肪酸，并且是茶葉產生青氣的重要因素[23]。

還檢測到酮類、酸類和其他類型化合物共20 種。酮類化合物含量在加工過程中總體上升，曬青葉較鮮葉增加220.4%，大量增加的酮類有香葉基丙酮、β-紫羅酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅酮、植酮等。β-紫羅酮有紫羅蘭香[6]，其含量在鮮葉中較低，隨著加工進程逐漸增加，曬青葉較鮮葉上升253.1%。呈現出甜香和玫瑰花香的香葉基丙酮[24]在鮮葉中未檢測到，推測是殺青工序提供了其前體六氫番茄紅素發(fā)生非酶氧化降解的條件，導致其大量生成[6]。

綜上，曬青綠茶的揮發(fā)性組分以花香、青香型化合物為主，如芳樟醇、雪松醇、壬醛、棕櫚酸異丙酯、β-紫羅酮等，而吡喃類、呋喃類、吡咯類、吡嗪類化合物較少，與Xu Yongquan[25]、Pang Xueli[26]等對普洱生茶活性香氣物質的研究結果相近。同時酯類物質對其他化合物的掩蔽效應也可能導致花香、果香的氣味特征被部分掩蓋[27]，而導致曬青綠茶形成了區(qū)別于其他綠茶的香氣輪廓。

2.2 曬青綠茶加工過程中關鍵香氣OAV與ACI分析

為深入剖析曬青綠茶加工過程中活性香氣的變化規(guī)律，對加工過程中的揮發(fā)性物質進行OAV和ACI分析。OAV大于1的物質被認為對于樣品整體香氣具有貢獻作用，可被認定為活性香氣[3-28]；ACI用以描述混合香氣中各揮發(fā)性組分對整體香氣的貢獻程度[29]。如表2所示，共有23 種OAV大于1的活性香氣成分，所涵蓋的香氣特征主要有青草、脂蠟氣、花香、果香、薄荷、木香以及蘑菇等氣味屬性。其中，芳樟醇、香葉醇、β-紫羅酮、辛醛在大多數階段的OAV大于100（圖2）。如圖2、3所示，各樣品中OAV與ACI均以芳樟醇為最高，在加工全過程中其OAV雖然下降了41.15%，但曬青葉中ACI為41.56%，因此它仍然是主要的香氣貢獻物質。4 個樣品的活性香氣以醛類物質為主，表現出青草、柑橘、脂蠟的氣味屬性，但曬青成茶香氣中沒有脂蠟氣屬性的物質，推測可能是某些關鍵化合物之間存在拮抗或協(xié)同效應，使得脂蠟氣被掩蔽無法在最終的香氣感知中顯露。研究報道香葉醇和苯乙醇之間的協(xié)同作用引起(E)-2-己烯醛和β-紫羅酮的掩蔽作用，導致花香氣增強[27]。Hattori等[30-31]的研究證實了癸醛和β-紫羅酮能夠增強花香，香葉醇可以放大清香，而吲哚則提高整體香氣強度。此外，多數醛類物質ACI小于或接近5%，但醛類物質總ACI仍然在曬青葉中達到了35.88%，這對于曬青綠茶最后香氣的成型起著關鍵作用；β-紫羅酮OAV與ACI持續(xù)上升，吲哚OAV與ACI持續(xù)下降，對香氣的影響由負轉正，低濃度的吲哚表現出花香[32]。1-辛烯-3-醇僅于曬青葉檢出，且OAV相對較高，這與Shi Yali等[33]的研究結果相似。

圖2 曬青綠茶關鍵香氣化合物在加工過程中的OAV分析Fig.2 OAV analysis of key aroma compounds during the processing of sun-dried green tea

圖3 曬青綠茶加工過程中關鍵香氣貢獻度分析Fig.3 Analysis of the contribution of key aroma components to the aroma of sun-dried green tea during processing

表2 曬青綠茶加工過程OAV＞1的香氣化合物Table 2 Volatile compounds with OAVs ＞ 1 during the processing of sun-dried green tea

2.3 脂肪酸在曬青綠茶加工過程中的變化

在茶葉加工過程中，絕大部分不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）都會在脂肪氧合酶催化作用下發(fā)生氧化降解，游離脂肪酸作為多種香氣物質的前體而引起了人們的關注[34-35]。為了探究曬青綠茶加工過程中香氣前體物質脂肪酸與醛類物質的潛在相關性，本實驗對曬青綠茶中的脂肪酸類物質進行了測定。

如表3所示，共鑒定出7 種脂肪酸，分別為亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）和棕櫚油酸（C16:1）、肉豆蔻酸（C14:0）、月桂酸（C12:0）、棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:2），在鮮葉、殺青葉、揉捻葉、曬青葉中的總含量分別為305.88、265.75、258.75、191.19 μg/g。在曬青綠茶的加工過程中，游離脂肪酸含量有顯著性變化，整體呈下降趨勢，與前人在研究曬青綠茶中脂肪酸結果趨勢[2,10]一致。

表3 曬青綠茶加工過程中脂肪酸分析Table 3 Analysis of fatty acids during the processing of sun-dried green tea μg/g

如表3所示，各樣品中的脂肪酸主要以飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）為主，在鮮葉和曬青葉中脂肪酸的占比分別為66.24%和57.69%；加工后期UFA含量占比明顯增加，而SFA則明顯下降，這與柳榮祥等關于綠茶初制過程中脂肪酸組成變化的研究結論一致[36]。硬脂酸含量在4 個制品中均為最高；棕櫚酸是壬醛、壬醇、庚醛、庚醇的前體物，且具有較好的吸附性能起定香作用[1]，其含量在殺青葉中出現輕微回升，主要降解過程發(fā)生在曬青過程。棕櫚油酸是樣品中最主要的UFA，曬青葉中的含量占總UFA含量的56.01%。此外，亞油酸、亞麻酸在揉捻后含量大幅下降，推測是揉捻時茶葉細胞破碎，釋放出細胞質中的脂肪氧化酶，催化二者C12～C13間的雙鍵加氧斷裂，生成己醛和己烯醛等芳香物質而減少，同時也存在二者因氧化及其他途徑發(fā)生損失的情況。綜上，曬青綠茶中的脂肪酸降解途徑是探究其香氣特征形成規(guī)律不可忽視的一項重要因素。

2.4 類胡蘿卜素在曬青綠茶加工過程中的變化

類胡蘿卜素參與茶葉香氣的組成，其酶促氧化反應主要發(fā)生在發(fā)酵過程中，在曬青綠茶加工過程中類胡蘿卜素的降解途徑應該以熱化、光化作用為主。為探索類胡蘿卜素與揮發(fā)性物質間的潛在關系，利用HPLC-PDA對各樣品的類胡蘿卜素物質進行檢測，結果如表4所示。

類胡蘿卜素總量持續(xù)下降。共檢測出13 種類胡蘿卜素，在各個加工階段以黃體素含量為最高，但其本身含量呈下降趨勢，該物質經非酶促反應可降解生成紫羅酮系列等具有紫羅蘭型氣味特征的香氣物質。其次是新黃素，但僅在鮮葉中檢出。玉米黃素的降解反應主要發(fā)生在殺青工序，同樣是紫羅酮系列物質的前體。β-胡蘿卜素持續(xù)下降，曬青葉較鮮葉下降約76.07%。類胡蘿卜素在加工全過程中降解并不徹底，僅降解約34.09%。盡管存在其他因素的損失，但類胡蘿卜素主要以熱裂解、光氧化途徑生成紫羅酮系列香氣物質，豐富曬青綠茶的香氣層次。因此可通過非酶促手段提高茶葉中類胡蘿卜素利用率改進曬青綠茶香氣。如施江等[37]利用外源茉莉酸甲酯誘導茶樹鮮葉，能夠大幅增加鮮葉中類胡蘿卜素含量，且加工的成品茶具有濃郁的花香。

2.5 曬青綠茶加工過程中關鍵香氣及前體物質熱圖

分析曬青綠茶加工中脂肪酸與類胡蘿卜素的變化趨勢可以確定它們與曬青綠茶清香型香氣特征的關聯性，因此選擇曬青綠茶中脂肪酸和類胡蘿卜素及其重要降解香氣產物進行對比分析，如圖4所示。新黃素在殺青后充分降解，該物質可在雙加氧酶作用下斷裂C9～C10之間的雙鍵，衍生出大馬士酮[38]，而殺青中高溫使得雙加氧酶鈍化，因此推測新黃素降解由熱化作用主導，揮發(fā)性物質中無大馬士酮檢出也可印證這一說法。楊偉祖等[21]研究表明β-胡蘿卜素非酶氧化主要關聯產物有β-紫羅酮、二氫獼猴桃內酯、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮。β-紫羅酮含量在殺青后上升較為突出，因此推測β-胡蘿卜素主要通過熱裂解作用生成β-紫羅酮。β-胡蘿卜素光氧化可生成二氫獼猴桃內酯和5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮，而二者確實在曬青后含量有所升高。亞油酸、亞麻酸變化明顯，主要降解產物己醛含量變化趨勢也與二者相反，該結果與Ravichandran等[39]一致。研究報道α-亞油酸可降解生成茉莉酸衍生物，如順-茉莉酸、茉莉酸甲酯[40]，本研究僅后期樣品中檢出茉莉酸甲酯，且OAV突出。

圖4 曬青綠茶加工過程中關鍵香氣及前體物質熱圖Fig.4 Heatmap of changes in key aroma component and their precursors during the processing of sun-dried green tea

3 結論

本研究對曬青綠茶加工過程中揮發(fā)性物質、前體物質脂肪酸和類胡蘿卜素的變化進行分析。曬青綠茶加工過程中，從鮮葉至殺青結束后揮發(fā)物總量增加，曬青葉中揮發(fā)物質總量較鮮葉略有下降，但種類數增加。曬青綠茶中的主要活性香氣為芳樟醇、香葉醇、壬醛等花香、青香型化合物，以醛類為主。對加工過程中香氣前體脂肪酸和類胡蘿卜素分析，可得到脂肪酸組成中SFA占優(yōu)勢，脂肪酸總量持續(xù)下降，亞油酸、亞麻酸變化明顯，主要降解產物己醛含量變化趨勢與二者相反。類胡蘿卜素含量下降明顯，其轉化生成的萜烯酮、紫羅酮及其衍生氧化物含量顯著上升。綜上，香氣前體脂肪酸與類胡蘿卜素的主要降解產物醛類與萜烯酮，與曬青綠茶香氣特征形成存在關聯性。本研究為定向改良曬青綠茶香氣提供了新方向，但還需要更深入地研究明以確香氣前體與活性香氣間的轉化關系及前體降解的具體路徑。