馬秋霞，王寶維，張名愛，賈一銘，孫麗騫，張紫涵，王思儀，王 悅，伏瑩瑩，孔 敏，凡文磊,

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

鵝肥肝是中外馳名的高級營養(yǎng)食品，與魚子醬和松露一同被譽(yù)為世界三大美食[1-2]。我國是世界第三大鵝肥肝生產(chǎn)國和第二大消費(fèi)國，年產(chǎn)鵝肥肝1000多噸，并且產(chǎn)量逐年增加[3]。鵝肥肝的生產(chǎn)是通過填飼大量高能飼料，打破肝臟脂質(zhì)代謝物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與分解之間的平衡，使脂質(zhì)在肝臟中過度積累[4-5]。但是，填飼的過程不僅耗費(fèi)大量的人力，而且造成動物機(jī)體負(fù)擔(dān)過重、脂質(zhì)代謝紊亂和健康狀況下降，不僅生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品品質(zhì)也不穩(wěn)定。因此，迫切需要研究鵝肥肝形成的代謝調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)質(zhì)鵝肥肝的精準(zhǔn)營養(yǎng)調(diào)控和高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

鵝肥肝的品質(zhì)取決于其所累積的各種代謝物的組成和比例，如鵝肥肝的色澤主要取決于鐵和VA的含量，肥膩感主要取決于粗脂肪和VA的含量，香味主要取決于蛋白質(zhì)的含量[6]。研究表明，鵝肥肝不飽和脂肪酸高達(dá)60%～70%，必需氨基酸含量占40%，呈味氨基酸可達(dá)50%[7-8]。在填飼的不同階段，鵝肝臟各種營養(yǎng)成分呈現(xiàn)動態(tài)變化趨勢，已有研究大多聚焦于對粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等常規(guī)營養(yǎng)指標(biāo)及部分氨基酸、脂肪酸或維生素的比較分析[7,9-10]。目前尚缺少對填飼過程中鵝肝臟代謝成分組成及變化規(guī)律的總體認(rèn)識。

廣泛靶向代謝組學(xué)分析是一種結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)優(yōu)點(diǎn)的新方法，可以同時定性和精確定量數(shù)百種已知代謝物并對數(shù)千種已知及未知代謝物進(jìn)行定量[11-12]，在動植物品質(zhì)性質(zhì)形成機(jī)制的研究中得到廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，福州雙瓣茉莉的花器官和葉片中特有代謝物種類豐富且均多于福州單瓣茉莉，且會合成更多具有生物活性和藥理活性的物質(zhì)[13]。郭明陽等[14]利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對不同生長期毛竹筍進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同生長期毛竹筍代謝物有顯著差異，破土期代謝物主要與營養(yǎng)風(fēng)味品質(zhì)有關(guān)，生長期階段代謝物與提高竹筍的環(huán)境適應(yīng)力密切相關(guān)。Weng Kaiqi等[15]利用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對不同上市年齡的鵝肉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同年齡的代謝物種類及含量存在明顯差異，例如肉堿、安賽蜜和煙酰胺核苷含量隨年齡增長而增加，次黃嘌呤、2-甲基琥珀酸和戊二酸含量隨著年齡的增長而減少。研究發(fā)現(xiàn)不同生長速度的鴨肉代謝譜同樣存在顯著差異，其中己醛、壬醛、辛醛、庚醛和2-戊呋喃等小分子物質(zhì)含量的差異，是鴨肉香味不同的原因[16]。

本研究基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的廣泛靶向代謝組技術(shù)對3 個不同填飼階段的鵝肝臟樣品進(jìn)行分析，以獲得鵝肥肝的代謝物圖譜，并揭示其動態(tài)變化規(guī)律，豐富家禽肝臟代謝的理論知識，以期為優(yōu)質(zhì)鵝肥肝的精準(zhǔn)營養(yǎng)調(diào)控和高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

同批次體況相近的70 日齡朗德鵝，由春冠食品有限公司提供。相同條件下預(yù)飼1 周后，分別在填飼前期（7 d）、填飼中期（16 d）、填飼后期（25 d）隨機(jī)選取3 只鵝進(jìn)行屠宰，采集肝大葉肝尖組織樣，迅速置于液氮中冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存用于廣泛靶向代謝組測定，3 組樣本分別用Q、Z、H表示。填飼實(shí)驗(yàn)于山東濰坊春冠食品有限公司肥肝生產(chǎn)廠進(jìn)行，填飼飼料為98%玉米+1%水+1%植物油混合型飼料。

甲醇、乙腈（均為色譜純）美國Merck公司；甲酸（色譜純）上海Aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP6500 UPLC-MS/MS儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

將樣本在-80 ℃冰箱中取出放在冰上解凍，并在液氮環(huán)境下研磨均勻；稱取20 mg樣本到對應(yīng)編號離心管中，加入400 μL 70%甲醇溶液內(nèi)標(biāo)提取液，1500 r/min振蕩5 min，然后在冰上靜置15 min；4 ℃、12000 r/min離心10 min，取300 μL上清液到另一對應(yīng)編號離心管中，在-20 ℃冰箱中靜置30 min；然后4 ℃、12000 r/min再離心3 min，取上清液200 μL到對應(yīng)進(jìn)樣瓶內(nèi)襯管中，用于上機(jī)分析。

所有樣本提取液等量混合形成質(zhì)控樣本（quality control，QC），用于分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性。

1.3.2 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A相為超純水（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸）；洗脫梯度：0～11 min，95% A、5% B；11～12.1 min，10% A、90% B；12.1～14 min，95% A、5% B；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓5500（正）、-4500 V（負(fù)），離子源氣體I壓力50 psi，氣體II壓力50 psi，氣簾氣壓力25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中，每個離子對根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用武漢邁維生物技術(shù)有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB、Analyst 1.6.3軟件、MultiaQuant軟件，對樣本代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性定量分析。多元統(tǒng)計包括無監(jiān)督模式識別的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督模式識別的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminate analysis，OPLSDA）。OPLS-DA在原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行中心化處理，然后進(jìn)行分析。OPLS-DA模型預(yù)測圖的、、Q2越接近1表示模型越穩(wěn)定可靠，大于0.5表明模型有效，適合進(jìn)一步篩選不同填飼時間鵝肥肝差異代謝物。差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)：1）差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥2或FC≤0.5；2）變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值≥1。并對差異代謝物進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析和K-Means分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總代謝物分析

基于廣泛靶向代謝組學(xué)分析，共檢測到1153 個代謝物（正離子模式688 個，負(fù)離子模式465 個），分為19 類（圖1A），主要包括424 個氨基酸及其代謝物，136 個有機(jī)酸及其衍生物，99 個苯及其衍生物，88 個核苷酸及其代謝物，77 個雜環(huán)化合物，73 個碳水化合物及其代謝物，55 個醇、胺類，46 個脂肪酰類，33 個醛、酮、酯類，32 個甘油磷脂類，19 個輔酶和維生素，10 個激素及激素相關(guān)物質(zhì)，8 個甘油脂類和其他。為了解各組樣本之間總體代謝物差異和樣本間變異度大小，對樣本進(jìn)行PCA（圖1B），PC1貢獻(xiàn)率為36.4%，PC2貢獻(xiàn)率為25.9%，所有樣品坐標(biāo)點(diǎn)均分布于95%置信區(qū)間。3 個組樣本組內(nèi)間距小，表明組內(nèi)差異不大，在PC2上3 個組明顯分開，表明組間差異明顯。此外，通過聚類熱圖可發(fā)現(xiàn)不同填飼階段鵝肝臟代謝物的表達(dá)模式存在顯著差異（圖1C），表明填飼不同階段鵝肝臟代謝活動發(fā)生了劇烈變化。

圖1 不同填飼階段的鵝肝臟代謝組學(xué)圖譜Fig.1 Metabolite profiles of goose liver at different overfeeding stages

2.2 差異代謝物鑒定

由OPLS-DA得分圖和模型驗(yàn)證圖（圖2）可知，填飼前期與填飼中期、填飼中期與填飼后期之間的代謝物有顯著差異，且均大于0.5，表明構(gòu)建的OPLSDA模型穩(wěn)定可靠，適合進(jìn)一步篩選不同填飼時間鵝肝臟差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為VIP≥1、FC≥2和FC≤0.5。

圖2 不同填飼階段的鵝肝臟代謝譜差異分析Fig.2 Differential analysis of metabolite profiles in goose liver at different overfeeding stages

由差異代謝物火山圖（圖2A3、B3）可知，與填飼前期相比，填飼中期上調(diào)的差異代謝物有130 個，氨基酸及其代謝物（氨基酸2 個、氨基酸衍生物9 個、小肽24 個）、有機(jī)酸及其衍生物（有機(jī)酸及其衍生物25 個、磺酸類化合物1 個）、脂肪酰類（游離脂肪酸8 個、?；鈮A4 個）含量最多，下調(diào)的差異代謝物有12 個。FC排前10的是脫氧馬錢苷（雜環(huán)化合物）、L-纈氨酸-L-脯氨酸-L-亮氨酸（小肽）、n-甲基-4-氨基丁酸（氨基酸衍生物）、(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳六烯酸乙酯（酯類）、羥苯基乳酸（有機(jī)酸及其衍生物）、脫氧膽酸、α-鼠膽酸、γ-鼠膽酸、β-鼠膽酸（膽汁酸）。與填飼中期相比，填飼后期上調(diào)差異代謝物有43 個，氨基酸及其代謝物（氨基酸6 個、氨基酸衍生物8 個、小肽7 個）和有機(jī)酸及其衍生物（有機(jī)酸及其衍生物6 個）含量最多，下調(diào)差異代謝物有49 個，有機(jī)酸及其衍生物（有機(jī)酸及其衍生物14 個）和氨基酸及其代謝物（氨基酸1 個、氨基酸衍生物4 個、小肽7 個）含量最多。FC排前10的是L-纈氨酸-L-脯氨酸-L-亮氨酸（小肽）、脫氧馬錢苷（雜環(huán)化合物）、水楊酸β-D-O-葡萄糖醛酸、DL-3-苯基乳酸、托品酸、阿魏酸、(S)-2-羥基-3-苯丙酸（有機(jī)酸及其衍生物）、1,5-戊二胺（多胺）、2-(4-羥基苯基)丙酸酯（酚酸類）、對乙酰氨基酚硫酸鹽（苯及其衍生物）。

由差異代謝物Venn圖（圖3A）可知，差異代謝物總數(shù)為199 個，其中填飼前期與填飼中期特有的是107 個，填飼中期與填飼后期特有的是57 個，共有的是35 個。差異代謝物占代謝物總數(shù)的17.26%，表明不同填飼時間鵝肥肝代謝物有顯著差異。3 個填飼階段差異代謝物表達(dá)模式有明顯差異（圖3B、C）。綜合來看，隨填飼時間的延長，差異代謝物數(shù)目減少，下調(diào)代謝物所占比例增加。差異代謝物主要是氨基酸及其代謝物、有機(jī)酸及其衍生物和脂肪酰類。

圖3 不同填飼階段差異代謝物Venn圖和熱圖Fig.3 Venn diagram and heatmap of differential metabolites at different overfeeding stages

2.3 差異代謝物KEGG富集通路分析

對不同填飼時間差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，選擇P排名前20的通路進(jìn)行展示。填飼前期與填飼中期的142 個差異代謝物有46 個被注釋到63 條通路中，其中生物素代謝、脂肪酸生物合成、VB6代謝、亞油酸代謝通路顯著富集（圖4A）。填飼中期與填飼后期的92 個差異代謝物有38 個被注釋到61 個通路中，其中賴氨酸降解、D-氨基酸代謝、VB6代謝、精氨酸生物合成、生物素代謝、花生四烯酸代謝、氨基酸的生物合成通路顯著富集（圖4B）。

圖4 不同填飼階段差異代謝物KEGG富集圖Fig.4 KEGG enrichment map of differential metabolites at different overfeeding stages

2.4 差異代謝物的K-Means分析

為研究不同差異代謝物在不同分組中的相對含量變化，以及尋找和聚類具有相似表達(dá)模式的差異代謝物，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，然后進(jìn)行K-Means分析，如圖5所示。第1類和第5類代謝物相對含量變化趨勢大致相似，填飼前期到填飼中期含量迅速升高，然后迅速下降，在第1類中共有38 個代謝物，主要包括溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、溶血磷脂?；掖及返?，在第5類中共有67 個代謝物，包括L-脯氨酸等。在第2類中共有44 個代謝物，在填飼前期到填飼中期保持穩(wěn)定，填飼中期到填飼后期迅速升高，主要包括L-谷氨酰胺、L-賴氨酸、L-精氨酸等，大多數(shù)是氨基酸類。第3類中共有15 個代謝物，隨填飼時間延長含量不斷下降，主要是氨基酸衍生物。第4類中共有35 個代謝物，隨填飼時間延長含量不斷升高，主要包括細(xì)胞松弛素B、肉堿C4:DC、尿酸、8,15-二羥基二十碳四烯酸、月桂酸等。

圖5 不同填飼階段差異代謝物K-Means圖Fig.5 K-Means diagram of differential metabolites at different overfeeding stages

3 討論

肉質(zhì)風(fēng)味特性與其所含的小分子代謝物密切相關(guān)[17]，如滋味的呈味物質(zhì)是無機(jī)鹽、游離氨基酸、核糖、小肽、有機(jī)酸等，揮發(fā)性風(fēng)味是由醛類、酸類、酮類、烴類、酯類、醇類、雜環(huán)化合物等化合物導(dǎo)致[18-20]。氨基酸及其衍生物不僅能影響肉的滋味，而且可與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而影響肉的風(fēng)味[21-22]，研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的醛類、酮類及雜環(huán)類化合物是雞脂肪受熱時特征香味物質(zhì)的主要來源[23]。核苷酸作為半必需營養(yǎng)成分，可以與氨基酸、還原糖等反應(yīng)提供香氣[24]。鵝肥肝質(zhì)地細(xì)嫩、香味獨(dú)特，風(fēng)味鮮美奇特，但是其風(fēng)味品質(zhì)性質(zhì)形成的原因尚不完全清楚。通過對填飼不同階段的肥肝鵝肝臟代謝譜進(jìn)行分析，將有助于揭示鵝肥肝風(fēng)味品質(zhì)性質(zhì)的形成原因，為鵝肥肝產(chǎn)業(yè)高效發(fā)展提供理論支撐。

本研究對3 個填飼階段的朗德鵝肝臟進(jìn)行廣泛靶向代謝組分析，共檢測到1153 個差異代謝物（正離子模式688 個，負(fù)離子模式465 個），包括氨基酸及其代謝物、有機(jī)酸及其衍生物、苯及其衍生物、核苷酸及其代謝物、雜環(huán)化合物、碳水化合物及其代謝物、脂肪酰類、醇類、胺類、醛類、酮類、酯類等19 類代謝物。本研究發(fā)現(xiàn)鵝肥肝中氨基酸類、有機(jī)酸類、核苷酸類等滋味呈味物質(zhì)和雜環(huán)化合物、醛、酮、酯類、醇、胺類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)占比較高，這些豐富多樣的代謝物可能是鵝肥肝獨(dú)特營養(yǎng)與風(fēng)味的形成原因。通過PCA發(fā)現(xiàn)，3 個填飼階段鵝肝臟代謝譜有明顯差異，說明填飼不同階段鵝肝臟代謝活動發(fā)生了巨大變化，填飼改變了鵝肝臟的代謝模式。Zhao Minmeng等[25]利用GC-MS的代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)鵝脂肪肝的形成伴隨著肝臟代謝譜的顯著變化，差異代謝物主要屬于脂肪酸、氨基酸、有機(jī)酸和胺類，與本研究的結(jié)果一致。Yu Yuzhu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與未填飼鵝肝相比，填飼25 d的鵝肝中有77 種差異代謝物發(fā)生了顯著變化，油酸水平持續(xù)升高，而苯丙氨酸、磷酸甲酯、硫酸和3-羥基苯甲醛水平下降。本研究中，填飼前期與中期共142 個差異代謝物（上調(diào)130 個，下調(diào)12 個），填飼中期與填飼后期共92 個差異代謝物（上調(diào)43 個，下調(diào)49 個），隨填飼時間延長，差異代謝物數(shù)目減少，上調(diào)下調(diào)差異代謝物數(shù)目趨于平穩(wěn)，說明鵝肝臟在填飼前期到填飼中期代謝變化更劇烈。

填飼后鵝肝臟脂肪酸合成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過脂肪酸β-氧化降解和脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的能力，三者之間的平衡被打破，多余的脂肪酸以甘油三酯的形式儲存下來，造成肝細(xì)胞肥大[27-29]。本研究中，在填飼前期與中期階段，上調(diào)差異代謝物中氨基酸及其衍生物（氨基酸2 個、氨基酸衍生物9 個、小肽24 個）、有機(jī)酸及其衍生物（有機(jī)酸及其衍生物25 個、磺酸類化合物1 個）所占比例最高。氨基酸分解代謝可形成檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，進(jìn)而參與脂類的生物合成，本研究中，參與三羧酸循環(huán)的檸檬酸、烏頭酸、異檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、草酰乙酸等含量從填飼前期到中期也呈上升趨勢，且KEGG通路結(jié)果顯示脂肪酸生物合成通路顯著富集，表明在該階段脂肪酸從頭合成增多。填飼中期到后期階段，雖然差異代謝物仍然以氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸及其衍生物等為主，但是差異代謝物的數(shù)目明顯減少，并且上調(diào)與下調(diào)差異代謝物的數(shù)目比例變小，表明該階段動物機(jī)體已經(jīng)適應(yīng)了填飼，重新建立了代謝穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，鵝填飼后Fads1/2的表達(dá)增強(qiáng)，或許是作為保護(hù)性成分以滿足鵝脂肪肝對LC-PUFAs的即時需求[30]。

4 結(jié)論

本研究通過對不同填飼階段鵝肝臟進(jìn)行廣泛靶向代謝組學(xué)分析，共鑒定出1153 種代謝物，其中占比最多的是氨基酸及其衍生物和有機(jī)酸及其衍生物，并且在整個填飼期間與脂肪酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的代謝物含量表現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢。本研究還發(fā)現(xiàn)在填飼的早期階段，鵝肝臟代謝活動變化更為劇烈。本研究在代謝層面揭示了鵝肝中代謝物種類及其動態(tài)變化規(guī)律，有助于了解鵝肥肝填飼過程中生理狀態(tài)變化，為優(yōu)質(zhì)鵝肥肝的精準(zhǔn)營養(yǎng)調(diào)控和高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。