周昀菲，孫志強(qiáng)，杜慶鑫，王志勇，王 璐，杜紅巖，杜蘭英,

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，河南 鄭州 450003；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家林業(yè)草原杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.），落葉喬木，雌雄異株，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，在我國(guó)有兩千多年的栽植、藥用歷史[1-2]。杜仲葉富含木脂素、環(huán)烯醚萜、酚類(lèi)、類(lèi)固醇、萜類(lèi)、類(lèi)黃酮等活性物質(zhì)，具有滋補(bǔ)肝腎、調(diào)節(jié)血壓的保健功能[3]。近年來(lái)，杜仲葉被廣泛用于醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等行業(yè)，其中，杜仲茶是杜仲葉開(kāi)發(fā)利用的典型代表之一[4]。傳統(tǒng)杜仲茶主要由殺青、揉捻、發(fā)酵等工藝制作而來(lái)[4-6]。杜仲嫩葉期為3—4 月，成熟期為7—9 月，分別是采摘制茶的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。杜仲嫩葉制作的杜仲茶，茶湯中富含可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸，色澤明亮度高、濁度低、青草氣明顯、醇厚感和回甘度較差[5]。成熟期葉片組織發(fā)育完全，可溶性蛋白質(zhì)被代謝分解，多酚類(lèi)化合物含量達(dá)到頂峰，青澀感減輕，醇厚感較佳，有回甘，但茶湯亮度低、濁度高[5]。現(xiàn)有的杜仲茶產(chǎn)品主要是通過(guò)發(fā)酵技術(shù)加工而成。發(fā)酵工藝是傳統(tǒng)茶揮發(fā)性物質(zhì)形成的關(guān)鍵步驟，例如凌云白毫發(fā)酵茶選擇同標(biāo)準(zhǔn)的嫩鮮葉進(jìn)行不同程度的發(fā)酵，所制成的白茶、烏龍茶、黃茶和紅茶，其茶湯香氣分別呈清香、橙香、青果香和甜香等[7]。

揮發(fā)性物質(zhì)一般僅占茶干質(zhì)量的0.01%左右，但由于其低閾值和高氣味敏感性[8]，在茶的感官品質(zhì)上占據(jù)著重要地位。加工工藝和采摘季節(jié)是影響茶葉香氣特征的重要影響因素。熱風(fēng)、真空、日曬、自然干燥以及真空冷凍干燥牛蒡（Arctium lappaL.）根茶后，發(fā)現(xiàn)干燥方式對(duì)牛蒡根茶的揮發(fā)性化合物種類(lèi)和含量上有不同的影響[9]；5、7月和9月在同地區(qū)采摘的茶葉以同一工藝生產(chǎn)的3 種綠茶，其特征香氣成分各有不同[10]?；诖?，推測(cè)不同時(shí)期采摘的杜仲葉對(duì)蒸汽爆破處理后茶湯香氣化合物的響應(yīng)情況也有不同。

電子鼻是一種模仿人類(lèi)嗅覺(jué)感知-解釋-辨別過(guò)程的氣體傳感器陣列，可以對(duì)特定的揮發(fā)物做出特殊響應(yīng)[11]。在食品領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，例如Tan Juzhong等[12]利用電子鼻研究了制作工藝和配方對(duì)精煉可可揮發(fā)性化合物的影響，用于預(yù)測(cè)制作巧克力最佳的精煉時(shí)間及攪拌時(shí)間；Yang Xuemei等[13]利用電子鼻對(duì)普洱茶揮發(fā)性成分特征進(jìn)行分析，用于鑒別不同貯存年限的非發(fā)酵普洱茶。頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）是一種具有良好的線性、高重現(xiàn)性和低檢出限等特點(diǎn)的前處理方法，是集合采樣、預(yù)濃縮和樣品導(dǎo)入一系列步驟的前處理技術(shù)[14]。氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)能夠?qū)⒁粋€(gè)復(fù)雜體系中的單一揮發(fā)性化合物分離、鑒定和定量，是鑒定和分析芳香化合物最廣泛的技術(shù)[14]。電子鼻和HS-SPME-GC-MS技術(shù)聯(lián)用常用于區(qū)分和鑒別不同產(chǎn)地、不同工藝下的茶類(lèi)[15]、果類(lèi)[16]和酒類(lèi)[17]的香氣特征差異。

蒸汽爆破（簡(jiǎn)稱(chēng)“汽爆”）原理是水蒸汽依靠高壓進(jìn)入植物組織細(xì)胞，在內(nèi)部與外部壓強(qiáng)平衡的瞬間，水蒸汽攜帶組織間的液體迅速釋放至空氣中的熱機(jī)械處理過(guò)程[18-20]。汽爆過(guò)程中高壓汽體滲入膨脹做功，植物組織結(jié)構(gòu)被打破，木質(zhì)纖維素降解成可溶性糖[21]，物料比表面積增大，溶劑可及性增加，活性成分溶出率提高[22]。同時(shí)，汽爆條件可控，生產(chǎn)過(guò)程中僅使用水以產(chǎn)生水蒸汽，環(huán)境友好、成本低廉，且生產(chǎn)效率極高[23]，使得該項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化[24-25]、秸稈類(lèi)再利用[26]、膳食纖維改性[27-30]等領(lǐng)域。然而，有關(guān)杜仲葉片汽爆后揮發(fā)性化合物變化的研究極少，在杜仲茶的生產(chǎn)制作應(yīng)用上香氣組分變化鮮有報(bào)道，特別是鮮有研究比較杜仲嫩葉和成熟葉制成的茶樣在香氣特征上的差別。

為此，本研究以杜仲‘華仲8號(hào)’（E.ulmoides‘Huazhong 8’）嫩葉和成熟葉為對(duì)象，結(jié)合電子鼻、HSSPME-GC-MS、氣味活度值（odor activity value，OAV）法和感官定量描述分析（sensory quantitative descriptive analysis，SQDA）法，對(duì)比蒸汽爆破處理前后兩種原材料制成的杜仲茶揮發(fā)性物質(zhì)的變化；同時(shí)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）法和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）法進(jìn)行降維分析，解析嫩葉茶和成熟葉茶關(guān)鍵香氣化合物種類(lèi)及其含量，以期為改善杜仲茶感官品質(zhì)、采用蒸汽爆破輔助生產(chǎn)具有獨(dú)特香氣的杜仲飲品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲嫩葉和成熟葉采自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所孟州試驗(yàn)基地（112°42’58”E，34°51’38”N）‘華仲8號(hào)’1 a嫁接苗。

氯化鈉（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁烷（色譜純）德國(guó)Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QBS-80GB蒸汽爆破試驗(yàn)臺(tái) 鶴壁正道生物能源有限公司；PEN3電子鼻 德國(guó)Arisense公司；6890N-G5795B GC-MS儀 美國(guó)Agilent公司；XS204萬(wàn)分之一電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；Milli-QIntegral超純水機(jī) 美國(guó)MerckMillipore公司。

1.3 方法

1.3.1 嫩葉和熟葉杜仲茶蒸汽爆破加工流程

采摘‘華仲8號(hào)’嫩葉（3—4 月份）和成熟葉（6—7 月份），日曬凋萎后，將含水率統(tǒng)一調(diào)至30%?；谇捌谕耆囼?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，在蒸汽壓力0.45 MPa、穩(wěn)壓時(shí)間300 s條件下進(jìn)行汽爆處理[31]。汽爆后的成熟葉和嫩葉處理分別記為T(mén)1和T2，未汽爆的成熟葉和嫩葉處理分別記為CK1和CK2。將4 個(gè)處理的杜仲葉適當(dāng)切碎后，分別于55 ℃烘至足干，除去葉柄等雜質(zhì)，隔紗布攤于蒸鍋上30～50 s蒸汽回軟，壓制成茶餅，隨后55 ℃烘至足干，密封貯藏。

1.3.2 香氣感官評(píng)定

杜仲茶香氣的感官評(píng)定采用SQDA 法，參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》中的審評(píng)方法，邀請(qǐng)5 名具備高級(jí)以上專(zhuān)業(yè)技術(shù)資格的評(píng)茶員對(duì)茶樣成分進(jìn)行審評(píng)，經(jīng)評(píng)定小組對(duì)香氣屬性進(jìn)行評(píng)定描述后，選取5 個(gè)頻次最高的香氣屬性術(shù)語(yǔ)為杜仲茶的香氣特征屬性，對(duì)感官屬性制定的評(píng)分細(xì)則，以量化描述結(jié)果。

1.3.3 電子鼻測(cè)定

1.3.3.1 樣品前處理

水浴鍋提前預(yù)熱，每組樣品分別稱(chēng)取2.0 g的杜仲茶，置于潔凈的燒杯中，加入200 mL沸水，保鮮膜封口后置于沸騰的水浴中，持續(xù)沸騰3 min后迅速取出，紗布過(guò)濾得到茶湯，保鮮膜封口后自然冷卻至室溫。取20 mL茶湯于100 mL的燒杯中，雙層保鮮膜封口，用于電子鼻測(cè)試，每個(gè)樣品準(zhǔn)備3 個(gè)平行。

1.3.3.2 電子鼻檢測(cè)參數(shù)

直接將進(jìn)樣針頭插入含樣品的密封燒杯中，電子鼻進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：采樣時(shí)間為1 s/組，傳感器自清洗時(shí)間為80 s，傳感器歸零時(shí)間為5 s，樣品準(zhǔn)備時(shí)間為5 s，進(jìn)樣流量為400 mL/min，分析采樣時(shí)間為80 s。

1.3.4 GC-MS測(cè)定

1.3.4.1 樣品前處理

稱(chēng)取適量樣品經(jīng)充分磨碎，置于頂空瓶中，加入飽和氯化鈉溶液和正丁烷內(nèi)標(biāo)溶液，并使用硅膠頂空隔墊的鉗口蓋密封頂空瓶，置于80 ℃水浴中平衡20 min，再將SPME針扎進(jìn)頂空中，繼續(xù)放入80 ℃水浴中30 min，250 ℃進(jìn)樣口解吸5 min。

1.3.4.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：初溫50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至180 ℃保持5 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；載氣流速為1.0 mL/min；分流比為不分流。

M S 條件：離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子電離源，模式為全掃描，掃描范圍m/z40～600。

1.3.5 OAV計(jì)算方法

在一定范圍內(nèi)，OAV越大說(shuō)明該香氣成分對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大，其計(jì)算公式[32]如下：

式中：C為香氣成分的含量/（μg/kg）；T為香氣成分在水中的閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。Origin 2021作圖。通過(guò)非線性結(jié)構(gòu)進(jìn)行SQDA。SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），計(jì)算預(yù)測(cè)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP），并結(jié)合非參數(shù)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)篩選P＜0.05的差異揮發(fā)性化合物；通過(guò)The Unscrambler X軟件分析PLS回歸相關(guān)性并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)定

SQDA是通過(guò)非線性結(jié)構(gòu)表述評(píng)估屬性的強(qiáng)度，并利用圖形態(tài)變化描述樣本不同屬性的變化，通常為雷達(dá)圖，該方法已在一些食品的感官評(píng)定中得到了應(yīng)用[33]。4 種處理下杜仲茶的香氣屬性描述詞上的平均得分如圖1所示，整體上香氣屬性得分排序?yàn)門(mén)2＞T1＞CK2＞CK1。經(jīng)蒸汽爆破處理后，嫩葉和成熟葉茶的香氣在感官上都有顯著提升，T2除脂香稍弱于T1，木香、花香、堅(jiān)果香均較顯著；T1在脂香、花香表現(xiàn)較好，其次還伴有烤香。

圖1 嫩葉和成熟葉杜仲茶的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Radar plot of sensory characteristics of tender and mature E. ulmoides leaf tea

2.2 基于電子鼻分析蒸汽爆破對(duì)嫩葉和熟葉杜仲茶的影響

電子鼻分析可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)、分析和識(shí)別復(fù)雜的氣味和大部分揮發(fā)性成分，重復(fù)性好，樣品前處理簡(jiǎn)單易操作，不存在感官疲勞風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)結(jié)果可靠[13]。杜仲嫩葉和成熟葉茶的電子鼻響應(yīng)值表1所示，7 個(gè)傳感器對(duì)嫩葉和熟葉杜仲茶樣氣味的響應(yīng)值不同。在7 個(gè)傳感器中，W1W、W2S、W2W和W5S 4 個(gè)傳感器的響應(yīng)值在4 個(gè)茶樣中存在顯著差異（P＜0.05，VIP＞1），即這4 個(gè)傳感器檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)杜仲茶樣氣味的貢獻(xiàn)較大。

表1 嫩葉和成熟葉杜仲茶的電子鼻響應(yīng)值Table 1 E-nose response values of tender and mature E. ulmoides leaf tea

根據(jù)表1繪制的電子鼻傳感器陣列特征響應(yīng)雷達(dá)圖見(jiàn)圖2，雷達(dá)圖的差異一定程度反映了杜仲茶香氣強(qiáng)弱的差異。結(jié)果表明，4 種杜仲茶湯的香氣在7 種傳感器上的響應(yīng)值均有顯著差異，與對(duì)照茶樣相比，蒸汽爆破處理顯著降低嫩葉和熟葉杜仲茶的茶湯氣味在各傳感器上的響應(yīng)值。在成熟葉茶中，經(jīng)汽爆后的W2W、W1W和W5S 3 個(gè)傳感器響應(yīng)值較對(duì)照有明顯下降，W2S和W1S兩個(gè)傳感器響應(yīng)值較對(duì)照有略微下降；在嫩葉杜仲茶中，經(jīng)汽爆后的W2W、W2S、W1W、W5S和W1S 5 個(gè)傳感器響應(yīng)值較對(duì)照均有不同程度的下降。整體上，熟葉杜仲茶受到蒸汽爆破處理影響程度稍大于嫩葉杜仲茶。

圖2 嫩葉和成熟葉杜仲茶的電子鼻傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.2 Radar plot of E-nose sensor responses of tender and mature E. ulmoides leaf tea

PCA對(duì)電子鼻檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物進(jìn)行降維分析，可表征不同茶樣之間起主要區(qū)分作用的組分[34]，茶樣分布區(qū)域距離越遠(yuǎn)，則氣味差異越大。嫩葉和熟葉杜仲茶湯香氣的電子鼻PCA圖及其電子鼻傳感器的關(guān)系如圖3A所示。結(jié)果顯示，PC1和PC2貢獻(xiàn)率之和達(dá)到95%以上，基本上涵蓋了茶樣的大部分原始信息，其中PC1的貢獻(xiàn)率為95.789%，PC2的貢獻(xiàn)率為2.342%，由此可見(jiàn)，茶樣之間的差異主要表現(xiàn)在PC1上。CK2和CK1兩個(gè)對(duì)照茶樣分別與T2和T1兩個(gè)蒸汽爆破處理的茶樣在PC1上差異明顯，得到了有效區(qū)分。CK2的PC1、PC2的得分均最高，基本處于第1象限，與其他3 個(gè)茶樣之間的距離最遠(yuǎn)；CK1與T1和T2兩個(gè)茶樣距離雖較近，但在PC1投影上均不重疊，能夠較好區(qū)分；T2和T1分別在第3、2象限，兩個(gè)茶樣在PC1上投影重疊，但在PC2上差異明顯，說(shuō)明兩個(gè)茶樣之間存在差異。將載荷圖結(jié)合電子鼻傳感器雷達(dá)圖發(fā)現(xiàn)，W2W和W5S傳感器對(duì)CK2較靈敏，這與上述雷達(dá)圖的結(jié)果相吻合。W2W和W5S對(duì)氣味的PC1貢獻(xiàn)值較大，W1S和W2S對(duì)PC2貢獻(xiàn)值較大，說(shuō)明通過(guò)電子鼻傳感器特征響應(yīng)值能夠有效區(qū)分4 種杜仲茶樣的香氣差異。

圖3 嫩葉和成熟葉杜仲茶的電子鼻數(shù)據(jù)PCA（A）和LDA（B）圖Fig.3 PCA (A) and LDA plots (B) of E-nose data of tender and mature E. ulmoides leaf tea

LDA也是一種聚類(lèi)分析方法，一般注重類(lèi)別的分類(lèi)以及各種組之間的距離分析，即LDA會(huì)盡量縮小組內(nèi)的差異，擴(kuò)大組間的差異[35]?？s小組間差距后的杜仲茶樣香氣區(qū)分更為明顯，4 種杜仲茶香氣能夠被有效分開(kāi)（圖3B）。

2.3 香氣特征比較

2.3.1 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)結(jié)果

為探究嫩葉和熟葉杜仲茶汽爆前后制成杜仲茶的香氣特征差異，利用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用對(duì)4 種處理杜仲茶的揮發(fā)性化合物成分和相對(duì)含量進(jìn)行分析鑒定，得到其總離子流圖（圖4），共檢測(cè)到177 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，CK1、T1、CK2和T2中可鑒定的峰面積分別占比92.32%、100.00%、94.50%和100.00%。根據(jù)化合物類(lèi)型將其分為碳?xì)浠衔?、雜環(huán)類(lèi)化合物、醇類(lèi)化合物、醛類(lèi)化合物、酮類(lèi)化合物、酯類(lèi)化合物和其他類(lèi)化合物。由圖5A可知，CK1、T1、CK2和T24 個(gè)處理所制的杜仲茶揮發(fā)性化合物種數(shù)差異顯著，數(shù)量排序?yàn)門(mén)1＞CK2＞T2＞CK1，汽爆處理后的成熟葉茶揮發(fā)性化合物種類(lèi)高于未汽爆處理，增加了16 種，而嫩葉茶汽爆前后揮發(fā)性化合物種類(lèi)無(wú)顯著差異。其中，嫩葉茶汽爆后醛類(lèi)、酮類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)分別增加了2、6 種和3 種，成熟葉茶汽爆后醇類(lèi)、醛類(lèi)和酮類(lèi)分別增加了5、3 種和9 種（圖5B）。CK1、T1、CK2和T24 種杜仲茶揮發(fā)性化合物相對(duì)含量的差異也十分顯著，酯類(lèi)是相對(duì)含量最高的化合物類(lèi)型，相對(duì)含量分別為42.07%、16.33%、23.70%和21.89%；酮類(lèi)相對(duì)含量分別為6.63%、29.05%、12.30%和13.15%；碳?xì)漕?lèi)的相對(duì)含量分別為10.76%、10.83%、14.20%和13.89%；醇類(lèi)的相對(duì)含量分別為9.27%、15.22%、9.48%和14.87%；雜環(huán)類(lèi)的相對(duì)含量分別為18.73%、8.83%、14.13%和13.13%；其他類(lèi)的相對(duì)含量分別為0.90%、8.68%、5.25%和4.92%（圖5C）。

圖4 杜仲嫩葉茶和成熟葉茶揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatograms of volatile substances of tender and mature E. ulmoides leaf tea

圖5 杜仲嫩葉茶和成熟葉茶的揮發(fā)性化合物upset圖（A）、種數(shù)（B）和相對(duì)含量（C）Fig.5 Upset plots of volatile compounds (A),number (B) and relative content (C) of volatile compounds in tender and mature E. ulmoides leaf tea

2.3.2 OPLS-DA法分析揮發(fā)性化合物

PCA、OPLS-DA可以提取揮發(fā)性化合物中的有效信息并體現(xiàn)不同樣品香氣組成間的差異情況[36]，在茶葉的香氣特征分析中有著廣泛應(yīng)用，適用于解釋變量數(shù)量較多的情況。為進(jìn)一步分析蒸汽爆破處理對(duì)杜仲嫩葉茶和成熟葉茶香氣成分的影響，采用OPLS-DA對(duì)茶樣揮發(fā)性化合物進(jìn)行分析。如圖6所示，模型累積解釋率為0.9991，整體預(yù)測(cè)能力Q2為-0.7040，置換檢驗(yàn)200 次的模型R2＝0.9991，Q2＝-0.8625，并且Q2回歸曲線與Y軸的截距小于0，表明模型不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象，結(jié)果較為可靠。在OPLS-DA中，茶樣之間距離越小則差異越小，反之則意味著差異較大。CK2、T2、CK1和T1分別置于4 個(gè)象限，表明杜仲嫩葉茶和成熟葉茶揮發(fā)性化合物組成在蒸汽爆破處理后均發(fā)生了顯著變化，同時(shí)，嫩葉茶和成熟葉茶之間的揮發(fā)性化合物組成存在顯著差異。整體上，4 種處理的揮發(fā)性化合物組成均能被有效區(qū)分開(kāi)。

圖6 嫩葉和成熟葉杜仲茶揮發(fā)性化合物含量的OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA score plot of volatile component contents of tender and mature E. ulmoides leaf tea

VIP作為衡量OPLS-DA模型變量的權(quán)重程度，能夠代表各處理之間分類(lèi)判別的影響度和解釋力[37]。VIP值越大，揮發(fā)性化合物對(duì)茶樣整體香氣的貢獻(xiàn)率越大，篩選揮發(fā)性化合物時(shí)一般選取VIP≥1的成分。如表2所示，VIP≥1的揮發(fā)性化合物共有65 種。其中，酯類(lèi)物質(zhì)主要為二氫獼猴桃內(nèi)酯、3-呋喃甲基乙酸酯和2-甲基戊酸甲酯，酮類(lèi)物質(zhì)主要為大馬士酮、香葉基丙酮、β-紫羅酮、3-乙基-4-甲基吡咯-2,5-二酮和4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯-1-基)-3-丁烯-2-酮，碳?xì)漕?lèi)物質(zhì)主要為十二烷、十三烷、十四烷、十六烷和4-甲基-1-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯，醇類(lèi)物質(zhì)主要為苯甲醇、α-松油醇和芳樟醇。

表2 基于OPLS-DA模型分析VIP≥1的揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量和P值Table 2 Relative contents and P values of volatile compounds with VIP ≥ 1 based on OPLS-DA model

為進(jìn)一步縮小特征香氣化合物范圍，從VIP≥1的揮發(fā)性化合物中，篩選出差異代謝物達(dá)到顯著水平（即P＜0.05）的揮發(fā)性化合物，得到24 種特征香氣化合物，對(duì)應(yīng)的層次聚類(lèi)熱圖如圖7所示，其中，CK2中相對(duì)含量最高的是醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)，CK1、T1和T2中相對(duì)含量最高的是酯類(lèi)。T2和T1中相對(duì)含量增加最顯著的均是酯類(lèi)和酮類(lèi)，分別增加了13.06%和4.12%、9.71%和4.84%。

圖7 嫩葉和成熟葉杜仲茶特征香氣成分相對(duì)含量層次聚類(lèi)熱圖Fig.7 Hierarchical clustering heatmap of the relative contents of characteristic aroma components in tender and mature E. ulmoides leaf tea

2.3.3 特征香氣化合物與感官評(píng)定之間的相關(guān)性分析

通過(guò)PLSR進(jìn)行4 個(gè)茶樣的感官評(píng)定結(jié)果和特征香氣化合物的相關(guān)性分析。X矩陣（貢獻(xiàn)率73.43%）代表不同茶樣的特征香氣化合物，Y矩陣（貢獻(xiàn)率98.13%）代表不同茶樣的感官評(píng)定結(jié)果，香氣化合物和感官屬性之間的關(guān)系如圖8所示。圖中的大、小圓環(huán)分別表示100%和50%的相關(guān)性，分布在兩個(gè)圓環(huán)之間則表示相關(guān)性良好，大多數(shù)據(jù)分布在雙環(huán)之間，這說(shuō)明圖中的特征香氣化合物與感官屬性均呈顯著相關(guān)。由圖8可見(jiàn)，與花香、脂香關(guān)聯(lián)的特征香氣化合物占比較多，其中，花香與苯甲醇和香葉基丙酮等香氣化合物的關(guān)聯(lián)性較好，脂香與(E,E)-2,4-庚二烯醛和3-呋喃甲基乙酸酯的關(guān)聯(lián)性較好，這說(shuō)明花香氣和脂香氣占據(jù)杜仲茶特征香氣的主要地位。

圖8 特征香氣化合物與感官屬性的PLSR圖Fig.8 PLSR plot of correlation of characteristic aroma compounds with sensory attributes

2.3.4 OAV法分析特征香氣成分

OAV表征了茶樣中不同香氣成分對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)程度?；贠PLS-DA法篩選出的VIP≥1、P＜0.05的24 種特征香氣成分進(jìn)行OAV分析（表3）。

表3 特征揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量、閾值和OAVTable 3 Relative contents,thresholds and odor activity value (OAV) of characteristic volatile compounds

基于OAV的香氣特征分析如表4所示，當(dāng)OAV＞1時(shí)，定義為關(guān)鍵香氣成分，該香氣成分對(duì)總體香氣有直接影響；當(dāng)0.1＜OAV≤1時(shí)，定義為修飾性香氣成分，該香氣成分對(duì)總體香氣有輔助影響；當(dāng)0＜OAV≤0.1時(shí)，定義為潛在香氣成分，該香氣成分對(duì)總體香氣有潛在影響[41]。在一定范圍內(nèi)，OAV越大說(shuō)明該香氣成分對(duì)總體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。T1的關(guān)鍵香氣組分（OAV＞1）為二氫獼猴桃內(nèi)酯和壬醛，呈現(xiàn)甜桃香、木香、柑橘香、花香、焦糖香，CK2為二氫獼猴桃內(nèi)酯，呈現(xiàn)甜桃香、木香，T2為二氫獼猴桃內(nèi)酯、壬醛、苯甲醛和苯乙醛，呈現(xiàn)甜桃香、木香、柑橘香、花香、焦糖香、苦杏仁味、堅(jiān)果香、玫瑰香、巧克力香。二氫獼猴桃內(nèi)酯在T1、T2和CK23 種茶樣香氣中均占主導(dǎo)地位，其OAV以T1最高，為4.743，其次是T2為1.586。

表4 基于OAV的香氣特征分析Table 4 OAV-based aroma characteristics

3 討論

3.1 汽爆處理前、后杜仲嫩葉和成熟葉茶揮發(fā)性成分分析及感官評(píng)定

感官評(píng)定結(jié)果表明，汽爆處理后的嫩葉茶和成熟葉茶分別不同程度地增加了木香、花香和堅(jiān)果香以及脂香和花香，其中，嫩葉茶的香氣要略重于成熟葉茶。電子鼻分析表明，汽爆前兩種杜仲茶的響應(yīng)值均較高，嫩葉茶的響應(yīng)程度明顯大于成熟葉茶，這種差異可能是其中的青草氣較重導(dǎo)致的。同時(shí)，PCA和LDA所得到的模型擬合度較好，能很好地將4 個(gè)茶樣的香氣區(qū)分，說(shuō)明嫩葉茶和成熟葉茶在汽爆前后，二者之間的香氣組分均存在顯著差異，且汽爆前后香氣組分均有顯著變化。HS-SPMEGC-MS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共檢測(cè)出177 種揮發(fā)性化合物，其中酯類(lèi)的相對(duì)含量最高，化合物種類(lèi)數(shù)量排序?yàn)門(mén)1＞CK2＞T2＞CK1，汽爆處理后的成熟葉茶種類(lèi)增加了16 種，而嫩葉茶種類(lèi)無(wú)明顯變化。OPLS-DA表明，4 個(gè)茶樣之間能實(shí)現(xiàn)較好的區(qū)分（＝0.9991，Q2＝-0.8625），以VIP≥1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了65 種揮發(fā)性成分，剔除P＞0.05的成分后，得到24 種特征香氣成分，嫩葉茶和成熟葉茶經(jīng)汽爆后酯類(lèi)和酮類(lèi)相對(duì)含量分別增加了13.06%和4.12%、9.71%和4.84%。特征香氣化合物與感官評(píng)定之間相關(guān)性分析表明，杜仲茶中的苯甲醇和香葉基丙酮是花香的主要來(lái)源，(E,E)-2,4-庚二烯醛和3-呋喃甲基乙酸酯是脂香的主要來(lái)源，花香氣和脂香氣是杜仲茶的主要特征香氣，這與感官評(píng)定結(jié)果相符合。

現(xiàn)有關(guān)于杜仲茶香氣特征的研究中，多是對(duì)杜仲葉的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性化合物分析。Wang Zhihong等[42]以不同食用菌發(fā)酵杜仲葉后，鑒定杜仲葉及其發(fā)酵產(chǎn)物，共得到162 個(gè)信號(hào)峰，鑒定出醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)等68 種化合物，結(jié)果表明揮發(fā)性成分的組成和含量可以通過(guò)生物發(fā)酵技術(shù)被不同的微生物菌株改變。劉夢(mèng)培等[4]以不同乳酸菌發(fā)酵杜仲葉水提液，揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量由31 種增加至51 種，且關(guān)鍵香氣成分含量增加顯著，發(fā)酵后產(chǎn)生獨(dú)特花香氣的二氫-α-紫羅蘭酮。也有學(xué)者分析了微波干燥、保綠等熱處理工藝對(duì)杜仲香氣的影響[43-44]，發(fā)現(xiàn)這些工藝均能有效提升杜仲茶香氣品質(zhì)，所得杜仲茶呈現(xiàn)出特有的杜仲典型香氣。

本研究認(rèn)為，二氫獼猴桃內(nèi)酯是4 種杜仲茶的香氣基調(diào)，經(jīng)蒸汽爆破處理后，生成的其他特有香氣物質(zhì)是杜仲汽爆茶具有各類(lèi)香氣特征的主要因素之一。杜仲嫩葉汽爆茶中二氫獼猴桃內(nèi)酯、壬醛、苯甲醛和苯乙醛對(duì)其香氣特征有主要貢獻(xiàn)，產(chǎn)生了甜桃香、木香、柑橘香、花香等香氣。王娟等[45]以杜仲、甘草和葛根為原料，調(diào)配棗汁，分析得到異戊醛、反式-2-己烯醛、2-庚酮、1-辛烯-3-醇、正辛醛、苯乙醛、苯乙酮、壬醛和香葉基丙酮為目標(biāo)產(chǎn)物的特征香氣物質(zhì)，呈現(xiàn)果香、玫瑰香等花果香氣，與本研究中的杜仲嫩葉汽爆茶結(jié)果相似。杜仲熟葉汽爆茶中二氫獼猴桃內(nèi)酯和壬醛對(duì)香氣特征有主要貢獻(xiàn)，產(chǎn)生了甜桃香、花香、焦糖香等香氣。劉夢(mèng)培等[4]使用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵杜仲葉水提物，關(guān)鍵呈香物3-糠醛、大馬士酮和芳樟醇等呈現(xiàn)果香、花香、焦香，與本研究中的杜仲熟葉汽爆茶結(jié)果相似。曾橋等[46]分析杜仲葉茯磚茶的揮發(fā)性成分，得出加工過(guò)程前后揮發(fā)性成分組成和含量變化顯著，酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)為主要的揮發(fā)性成分，本研究中酸類(lèi)含量較少，但酯類(lèi)、酮類(lèi)和醇類(lèi)同樣占比較大，該部分結(jié)論與本研究結(jié)果一致。

3.2 PCA、LDA及OPLS-DA結(jié)合OAV法分析比較4 種杜仲茶香氣特征

曾橋等[46]采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)鑒定杜仲葉茯磚茶加工過(guò)程中的揮發(fā)性成分，共鑒定出152 種揮發(fā)性化合物，結(jié)合PCA和PLS-DA篩選了杜仲葉茯磚茶特有香氣物質(zhì)來(lái)源；林先麗等[47]采用PLS-DA確定了棕櫚酸乙酯和乙酸等的16 個(gè)將白酒劃分為3 個(gè)等級(jí)的關(guān)鍵差異化合物；金友蘭等[48]采用PLS-DA模型從不同類(lèi)型發(fā)花磚茶中以VIP＞1篩選了24 種差異香氣物質(zhì)，結(jié)合OAV＞1進(jìn)一步篩選出15 種特征香氣；黨昕等[16]將GC-MS結(jié)合電子鼻技術(shù)以區(qū)分不同預(yù)處理方式下沙棗風(fēng)味的變化，通過(guò)GC-MS確定14 種特征香氣，由電子鼻結(jié)果的響應(yīng)值雷達(dá)圖和PCA有效區(qū)分各樣品間的香氣強(qiáng)度，OPLS-DA驗(yàn)證了特征香氣與感官屬性間的相關(guān)性；羅紅玉等[49]采用OPLS-DA比較了重慶沱茶壓制前后香氣特征變化，并結(jié)合OAV比較4 種干燥工藝對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)β-紫羅酮和芳樟醇對(duì)香氣貢獻(xiàn)度最大。

本研究首先對(duì)杜仲茶香氣進(jìn)行了整體感知，進(jìn)行感官評(píng)定和電子鼻分析，基于電子鼻的雷達(dá)圖、PCA和LDA對(duì)比兩種杜仲茶汽爆處理前后的氣味強(qiáng)度，確定汽爆處理和采摘時(shí)段影響了杜仲茶的香氣組成，GC-MS檢測(cè)結(jié)果采用OPLS-DA法將4 種處理的杜仲茶有效區(qū)分后，篩選VIP≥1、P＜0.05的揮發(fā)性成分，并進(jìn)行特征香氣化合物與感官評(píng)定間的相關(guān)性分析，驗(yàn)證了杜仲汽爆茶特征香氣的揮發(fā)性化合物主要來(lái)源，最后，用OAV將4 種杜仲茶的特征香氣化合物劃分為關(guān)鍵香氣成分、修飾性香氣成分和潛在香氣成分，進(jìn)一步細(xì)化了各種杜仲茶特征香氣的具體貢獻(xiàn)程度和多種氣味之間的強(qiáng)弱關(guān)系。

4 結(jié)論

蒸汽爆破處理對(duì)杜仲嫩葉茶和成熟葉茶的香氣特征均有顯著影響。未汽爆處理嫩葉茶的關(guān)鍵香氣成分為二氫獼猴桃內(nèi)酯，呈現(xiàn)甜桃香、木香，經(jīng)汽爆處理后嫩葉茶的關(guān)鍵香氣為二氫獼猴桃內(nèi)酯、壬醛、苯甲醛和苯乙醛，呈現(xiàn)甜桃香、木香、柑橘香、花香、焦糖香、苦杏仁味、堅(jiān)果香、玫瑰香、巧克力香。未汽爆處理成熟葉茶無(wú)明顯的關(guān)鍵香氣，汽爆后成熟葉茶的關(guān)鍵香氣為二氫獼猴桃內(nèi)酯和壬醛，呈現(xiàn)甜桃香、木香、柑橘香、花香、焦糖香。本研究結(jié)果可為杜仲葉在茶飲品方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)，且所用的研究方法可運(yùn)用于多種食品的香氣分析研究。