陳榮榮，李 文，吳 迪，張 忠，鮑大鵬，陳萬超,3,，張勁松，楊 焱,

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實驗室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201200；3.上海百信生物科技有限公司，上海 201403）

鮮味是繼酸、甜、苦、咸之后的第5種基本味道，因其口感豐富和愉悅被認(rèn)為是一種重要的食品風(fēng)味[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，許多物質(zhì)如氨基酸、核苷酸、有機(jī)酸、無機(jī)鹽、多肽等均具有鮮味[3]，而天然來源的鮮味肽因其愉悅的口感和生理活性也引起越來越多學(xué)者關(guān)注。1978年，Yamasaki等[4]用木瓜蛋白酶處理牛肉肉汁，通過凝膠過濾、離子交換樹脂層析和紙電泳，從中分離出一種八肽（H-Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala-OH）并命名為鮮味肽。隨后，研究者逐漸在許多動物[5]、植物[6]、水產(chǎn)品[7-9]以及菌物[10-12]等食品中分離鑒定了上百種鮮味肽。鮮味肽作為新型鮮味物質(zhì)，不僅可以通過協(xié)同作用或美拉德反應(yīng)補(bǔ)充或增強(qiáng)食品原有風(fēng)味[13-15]，還能帶來愉悅的味覺感受；同時，鮮味肽能提供肽及氨基酸類的營養(yǎng)成分，更符合“天然、營養(yǎng)、安全”的食品發(fā)展理念[16]，在食品領(lǐng)域中具有極大的開發(fā)應(yīng)用前景。

鮮味肽廣泛存在于各類食品中，而動植物、水產(chǎn)品等主要鮮味來源的原材料制備鮮味肽的成本相對較高，尋找更多的鮮味食物資源對未來天然鮮味肽基料的發(fā)展尤為重要。我國是食用菌生產(chǎn)大國，食用菌蛋白含量高、味道鮮美，是制備鮮味肽的理想原料[17]。Chang Jincui等[12]對真姬菇中的鮮味肽研究發(fā)現(xiàn)，酶解后的樣品通過超濾、凝膠過濾色譜、反向高效液相色譜和超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜分離鑒定得到鮮味肽EGTAG，經(jīng)感官評價發(fā)現(xiàn)EGTAG在水和雞湯中的鮮味閾值分別為8.26 mmol/L和10.04 mmol/L，具有良好的鮮味特性。李雪[18]從蟹味菇中提取得到一個新的呈味肽，其序列為Glu-Gly-Thr-Ala-Gly，具有呈鮮特性，且能引起雞湯的濃厚感。Song Shiqing等[10]采用水提、酶解提取和高壓蒸煮法分別從美味牛肝菌中獲得421、713 條和616 條肽段，其中DGF、HHYE和KCGQ表現(xiàn)出與味精（monosodium glutamate，MSG）的鮮味協(xié)同效應(yīng)。

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）又名赤松茸，屬于傘菌目、球蓋菇科、球蓋菇屬[19]，色澤鮮艷、肉質(zhì)細(xì)嫩，具有“素中之葷”的美譽(yù)[20]，且營養(yǎng)豐富，烹飪時有肉香味，富含必需氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、多糖等營養(yǎng)成分[21]，其子實體干品中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)30%，是制備鮮味肽的優(yōu)質(zhì)原料。目前，關(guān)于大球蓋菇的研究主要集中在栽培方面，對于其呈味特性研究進(jìn)展緩慢。Li Wen等[22]對超聲制備的大球蓋菇多肽的結(jié)構(gòu)與抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）之間的機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超聲處理后的肽主要為八肽、九肽和十肽，多肽中氨基酸主要是疏水氨基酸，活性肽與ACE的對接結(jié)果表明，氫鍵相互作用是ACE與多肽相互作用的主要方式。Chen Wanchao等[23]對大球蓋菇水提物中的鮮味肽進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)5 條肽，分別為EPLCNQ、SGCVNEL、PHEMQ、SEPSHF和ESCAPQL，鮮味閾值在0.167～0.390 mmol/L范圍內(nèi)。Li Wen等[24]通過虛擬篩選、電子舌驗證和分子對接技術(shù)，對超聲輔助定向酶解法制備的47 種大球蓋菇鮮味肽的結(jié)構(gòu)與味覺活性關(guān)系進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)鮮味肽能與鮮味受體T1R1/T1R3形成氫鍵相互作用和靜電相互作用，多肽N-端和C-端氨基酸殘基在與受體結(jié)合形成中起著重要作用。已有的報道主要聚焦于大球蓋菇超聲輔助酶解及水提的多肽活性及風(fēng)味評價，實驗前期利用內(nèi)外切酶對大球蓋菇進(jìn)行分步酶解，獲得肽含量及呈鮮效果顯著提升的鮮味肽基料，但其鮮味肽的結(jié)構(gòu)及呈鮮特性尚需進(jìn)一步研究。

本研究以大球蓋菇子實體為原料，利用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對子實體進(jìn)行內(nèi)外切酶分步酶解，采用超濾、凝膠過濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）和反向高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（reversed-phase high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，RP-HPLC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合感官評價和電子舌分析，從大球蓋菇酶解液中分離純化并鑒定出8 條鮮味肽，并對其進(jìn)行合成及呈味特性分析，同時評價其與MSG的協(xié)同增鮮效果，并比較鮮味肽與其組成氨基酸混合物的呈味差異，以期為大球蓋菇鮮味肽產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大球蓋菇 上海菇林源菌業(yè)專業(yè)合作社。MSG、蔗糖、食鹽 市購。

氫氧化鈉、濃鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶（6×104U/g）、風(fēng)味蛋白酶（3×104U/g）北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-15葡聚糖凝膠瑞典Cytiva公司；檸檬酸（食品級）北京萃鋒科技有限公司；異亮氨酸（食品級）北京愛普銳晟科技有限公司；乙腈、三氟乙酸和甲酸（色譜級）美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QE-400粉碎機(jī) 浙江屹立工貿(mào)有限公司；MA100水分測定儀 德國Sartorius公司；Allegra 25R Centrifuge離心機(jī) 美國Beckman公司；SA-402B味覺分析系統(tǒng)日本INSENT公司；RP-HPLC-MS/MS儀（Thermo Easy NLC液相色譜儀，Thermo Scientific Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀）美國Thermo Fisher Scientific公司；ZWY恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；DGG-9240B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；pH計 北京萊萬生物技術(shù)有限公司；超濾膜分離裝置 美國Millipore公司；AKTATMflux 6超濾設(shè)備、AKTA pure蛋白純化系統(tǒng)、SuperdexTM30 Increase 10/300 GL凝膠色譜柱 美國通用電氣醫(yī)療公司。

1.3 方法

1.3.1 大球蓋菇酶解液的制備

新鮮大球蓋菇子實體簡單清洗后，烘干至水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10%，將烘干后的大球蓋菇粉碎后過100 目篩備用。根據(jù)實驗前期已優(yōu)化的高肽含量和風(fēng)味良好的分步酶解條件，選取中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對大球蓋菇粉進(jìn)行分步酶解，酶解溫度為50 ℃，料液比為1∶30（g/mL），先加入1175 U/g中性蛋白酶酶解76 min（pH 7.5），再添加490 U/g風(fēng)味蛋白酶繼續(xù)酶解20 min（pH 7.0），反應(yīng)結(jié)束后100 ℃沸水浴10 min，冷卻至室溫后，8000 r/min離心15 min收集上清液備用。

1.3.2 酶解液的超濾分離

鮮味肽的分子質(zhì)量主要集中在3000 Da以下[25]，上述方法制備的酶解上清液經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，選取3000 Da的超濾管進(jìn)行截留（25 ℃、ΔP＝0.60 bar、400 r/min），獲得U1（＞3000 Da）和U2（＜3000 Da）兩個組分，冷凍干燥后儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 GFC分離

參考Chen Wanchao等[23]的方法略微修改，凍干后的U2組分用超純水配制成100 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，加載到層析柱中。具體參數(shù)設(shè)置如下：樣品上樣量2 mL，洗脫液為超純水，流速0.75 mL/min，紫外檢測波長220 nm，經(jīng)自動收集器收集不同組分，冷凍干燥后進(jìn)行感官和電子舌評價。

1.3.4 RP-HPLC-MS/MS鑒定多肽序列

樣品處理：參考Li Wen等[22]的方法稍作修改。對凝膠分離出的鮮味最佳組分用ZipTip C18除鹽處理，樣品用0.1%三氟乙酸溶液溶解，17000×g離心10 min，取上清液備用。經(jīng)多次潤洗后，取10 μL 60%乙腈-0.1%三氟乙酸溶液將樣品洗脫至離心管并真空干燥備用。

色譜條件：nanoViper C18分析柱（75 μm×150 mm，Acclaim PepMap RSLC C18,2 μm,100 ?），流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為0.1%甲酸和80%乙腈溶液；梯度洗脫時間60 min；洗脫條件：0～8 min，95%～92% A、5%～8% B；8～39 min，92%～72% A、8%～28% B；39～50 min，72%～60% A、28%～40% B；50～51 min，60%～5% A、40%～95% B；51～55 min，5% A、95% B；55～56 min，5%～95% A、95%～5% B；55～60 min，95% A、5% B；流速600 nL/min；進(jìn)樣體積8 μL。

質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜參數(shù)為分辨率為120000，自動增益控制為4×105，離子最大注入時間為50 ms，質(zhì)量掃描范圍為m/z350～1550；二級質(zhì)譜參數(shù)為分辨率為50000，自動增益控制為1×105，離子最大注入時間100 ms，從一級質(zhì)譜中選擇進(jìn)行二級碎裂離子數(shù)為20，二級碎裂能量模式碰撞能量32 eV。利用Peaks studio軟件及Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對多肽進(jìn)行序列分析，對采集到的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行手動de novo解析，獲得多肽序列的分子質(zhì)量誤差為±0.03 Da。

1.3.5 目標(biāo)肽的合成

經(jīng)質(zhì)譜鑒定的多肽序列，委托上海吉爾生化有限公司采用固相合成法合成并進(jìn)行脫鹽處理，獲得純度大于98%的8 條多肽用于呈味特性的研究。

1.3.6 感官評價

參考Chen Wanchao等[23]的方法稍作修改。感官評定小組由11 名實驗室成員組成，5 名男性和6 名女性，年齡在20～30 歲，無味覺和嗅覺障礙。對感官評價員進(jìn)行基本的味覺培訓(xùn)，酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味的標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.08%檸檬酸、1%蔗糖、1%異亮氨酸、0.35%氯化鈉和0.35%MSG溶液，感官評價實驗在（25±1）℃的感官分析室中進(jìn)行，待測樣品配制好后，用NaOH（1.0 mol/L）或HCl（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至6.5盛放于30 mL品嘗杯中，用3 位數(shù)字隨機(jī)編號，評價員隨機(jī)選取樣品，品嘗量不低于5 mL，用舌頭攪拌樣品10 s，隨后吐出，為了避免疲勞效應(yīng)和遺留影響，感官評價員在兩次品嘗間需用超純水漱口，并休息2 min。

1.3.6.1 超濾組分和凝膠組分的感官分析和滋味稀釋分析

將超濾和凝膠凍干樣品充分溶解于超純水中，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液并調(diào)節(jié)pH值至6.5，小組成員采用十點(diǎn)評分法對樣品進(jìn)行評分，5 種標(biāo)準(zhǔn)品的感官評分設(shè)定為5 分，0 分表示無，10 分表示最強(qiáng)，對樣品的酸味、甜味、苦味、咸味和鮮味進(jìn)行打分，并用雷達(dá)圖展示評價結(jié)果。

滋味稀釋分析實驗：將樣品配制成5 mg/mL的溶液，采用超純水1∶1（V/V）逐級稀釋，配制一系列質(zhì)量濃度梯度的溶液，并按照濃度依次增大的順序進(jìn)行品嘗，采用三角實驗評估稀釋水平，當(dāng)感官評價員剛好將其與兩個空白對照組（超純水）區(qū)分出時，此時的稀釋倍數(shù)為樣品的滋味稀釋因子（taste dilution factor，TD），每個樣品測試3 次，所有感官評價結(jié)果的平均值計為最終結(jié)果。

1.3.6.2 合成肽及其氨基酸混合物的感官評定

將合成肽用超純水配制成1 mg/mL的溶液，對應(yīng)的氨基酸混合物配制成相同質(zhì)量濃度的溶液，調(diào)節(jié)pH值至6.5，并參照1.3.6.1節(jié)的方法進(jìn)行評價和打分。

1.3.6.3 合成肽的鮮味閾值和增鮮閾值測定

參考Xu Xiaodong等[26]的實驗方法稍作修改。合成肽的初質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用超純水對其進(jìn)行體積比1∶1逐步稀釋，當(dāng)剛好品嘗出溶液中的鮮味值時，記錄此時的質(zhì)量濃度為合成肽的鮮味閾值。合成肽的增鮮閾值測定以0.5 mg/mL MSG為對照組，并在其中添加合成肽，等比例提高溶液中合成肽的質(zhì)量濃度，當(dāng)感官評價員品嘗出溶液的鮮味值增加時，此時的質(zhì)量濃度為合成肽的增鮮閾值。

1.3.6.4 合成肽的劑量-反應(yīng)實驗

參照李曉明等[16]的方法稍作修改，將合成肽配制成6 種不同質(zhì)量濃度，分別為1、2、3、4、5、6 mg/mL，并分別添加0.5 mg/mL MSG作為母液，0.35%的MSG溶液為鮮味標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)定為5 分，0.5 mg/mL的MSG母液設(shè)定為1 分，采用10分制對添加MSG的合成肽鮮味值進(jìn)行打分，最終得到合成肽的劑量-反應(yīng)曲線。

1.3.7 電子舌分析

1.3.7.1 超濾和凝膠組分的電子舌分析

將超濾和凝膠組分配制成5 mg/mL的溶液，采用SA-402B味覺分析系統(tǒng)中的6 個傳感器，分別為CAO（酸味）、GL1（甜味）、COO（苦味）、CTO（咸味）、AAE（鮮味）和AE1（澀味）進(jìn)行測定，將樣品倒入特定量杯置于樣品槽中進(jìn)行測定，每個樣品測試4 次，樣品測試時間為120 s，取后3 次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.7.2 合成肽協(xié)同增鮮實驗

增鮮實驗將0.2 mg/mL合成肽添加到2 mg/mL MSG溶液中進(jìn)行電子舌測定，并與0.5、1、2 mg/mL和3.5 mg/mL的MSG溶液進(jìn)行對照，對其協(xié)同增鮮效果進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 25和Origin 2018對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，采用Tukey HSD檢驗進(jìn)行差異顯著性分析。所有實驗均為3 次平行實驗的結(jié)果，數(shù)據(jù)均以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾和凝膠色譜分離純化鮮味肽組分結(jié)果

大球蓋菇經(jīng)分步酶解獲得酶解物，其可溶性肽含量達(dá)到245.45 mg/g，表現(xiàn)出明顯的鮮味和菇味，TD值為32（表1）。對酶解物進(jìn)行超濾分離得到兩個組分，其中U2組分（＜3000 Da）鮮味值較高，TD值為32（表1），電子舌和感官評價結(jié)果表現(xiàn)出與酶解物相似的味覺屬性（表2和圖1），且研究表明鮮味肽的分子質(zhì)量均小于3000 Da[26-27]，進(jìn)一步對U2組分進(jìn)行GFC分離。其利用分子質(zhì)量大的樣品在色譜柱中保留時間短先被洗脫，分子質(zhì)量小的樣品后被洗脫進(jìn)而對樣品達(dá)到分離的效果[28]。經(jīng)GFC共得到4 個組分（圖2），其中F4組分占比少且得率低，選取F1、F2和F3進(jìn)一步分析。感官評定結(jié)果顯示，GFC分離的3 個組分均表現(xiàn)出鮮味特征，并伴有輕微澀味和甜味，且F2和F3鮮味明顯，TD值達(dá)到64（表1）。結(jié)合電子舌分析結(jié)果可知，F(xiàn)3組分鮮味更突出，鮮味值為20.66±0.13，與F2差異顯著（P＜0.05），且F3中的可溶性肽含量達(dá)到389.42 mg/g，進(jìn)一步表明其中的鮮味肽可能發(fā)揮了極大的作用。因此，本研究選擇F3組分做進(jìn)一步鮮味肽鑒定。

圖1 酶解物、超濾和GFC組分的感官雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of the enzymatic hydrolysate and its fractions separated by UF and GFC

圖2 U2組分的GFC圖Fig.2 Gel filtration chromatograms of fraction U2

表1 酶解物、超濾和GFC組分的可溶性肽含量及感官分析Table 1 Soluble peptide contents and sensory analysis of the enzymatic hydrolysate and its fractions separated by UF and GFC

表2 酶解物、超濾和GFC組分的電子舌呈味特性Table 2 Taste characteristics of the enzymatic hydrolysate and its fractions separated by UF and GFC

2.2 RP-HPLC-MS/MS鑒定大球蓋菇鮮味肽結(jié)果

利用RP-HPLC-MS/MS對F3組分中鮮味肽進(jìn)行鑒定，獲得8 條多肽（ALC＞95%）（圖3和表3），分別為Glu-Leu-Trp-Arg（ELWR）、Arg-Leu-Val-Asp-Arg（RLVDR）、Lys-Pro-Asp-Asn-Arg（KPDNR）、Ala-His-Leu-Arg-Phe（AHLRF）、Leu-Asp-Trp-Asp-Arg（LDWDR）、Leu-Ala-Glu-Trp-Arg（LAEWR）、Asp-Asp-Trp-Trp-Arg（DDWWR）、Glu-Gly-His-Lys-Gly-Trp（EGHKGW），肽鏈長度4～6，且以五肽為主，分子質(zhì)量在602.3176～776.3242 Da之間。

圖3 8 條多肽的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of eight peptides

表3 F3組分中鑒定的特征肽段Table 3 Signature peptide sequences identified in fraction F3

2.3 大球蓋菇合成肽的呈味特性分析

2.3.1 合成肽的感官特性、鮮味閾值和增鮮閾值

多肽由于其化學(xué)性質(zhì)和構(gòu)象的多樣性，導(dǎo)致其表現(xiàn)出多種味覺特征[1]。利用固相合成法合成了鑒定得到的8 條多肽，并進(jìn)行了感官評定和電子舌分析（圖4）。感官評定結(jié)果顯示合成肽表現(xiàn)出的滋味輪廓相似，鮮甜味突出，同時咸味和苦味明顯，酸味較弱。其中，酸味的產(chǎn)生可能由于合成過程中的試劑殘留[29]，亦或由于肽鏈中的羧基解離強(qiáng)度強(qiáng)于氨基，表現(xiàn)出酸味[28]。電子舌分析可知ELWR鮮味值最高，達(dá)到8.39；RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW 4 條多肽的鮮味值均大于7，且RLVDR、AHLRF和EGHKGW表現(xiàn)出更愉悅的滋味特征，鮮甜味及咸味更突出，酸苦味弱；而LDWDR、LAEWR和DDWWR 3 條多肽與其余5 條多肽滋味特征區(qū)別明顯，表現(xiàn)出鮮咸味值低、苦味值高的特征。當(dāng)鮮味肽含有谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺殘基，且鮮味氨基酸占比較大時，對于鮮味的貢獻(xiàn)更大[30-31]。而鮮甜味氨基酸位于肽鏈兩端時，更利于與鮮味受體結(jié)合，更容易產(chǎn)生鮮味[32]。除AHLRF外，8 條多肽均含有鮮味氨基酸，且除AHLRF和EGHKGW外，C-末端均為精氨酸（堿性氨基酸）。多肽中含有堿性氨基酸且末端含有精氨酸的肽段會呈現(xiàn)苦味[28,33]，苯丙氨酸作為苦味氨基酸也會增強(qiáng)多肽的苦味特征[34]，這可能是多肽表現(xiàn)出苦味的原因。LDWDR、LAEWR和DDWWR更苦可能是由于苦味氨基酸占比較大（60%），或因疏水性氨基酸暴露導(dǎo)致其產(chǎn)生苦味[35]。

圖4 合成肽感官評分（A）和電子舌（B）雷達(dá)圖Fig.4 Results of sensory evaluation (A) and electronic tongue analysis (B) of synthetic peptides

由表4可知，8 條肽段均表現(xiàn)出鮮味特征并對鮮味有提升作用，鮮味閾值在0.30～1.33 mmol/L之間，增鮮閾值在0.53～2.43 mmol/L之間。其中LDWDR、LAEWR和DDWWR有苦澀感但鮮味提升效果明顯，增鮮閾值與其余5 條多肽之間差異顯著且小于1 mmol/L（P＜0.05）；鮮味閾值分別為1.33、0.56 mmol/L和1.13 mmol/L，LDWDR和DDWWR的鮮味閾值顯著高于其他多肽（P＜0.05），鮮味強(qiáng)度弱；其次是ELWR、RLVDR、KPDNR和EGHKGW表現(xiàn)出甜味和咸味的味覺特征，并且有較強(qiáng)的鮮味提升作用，增鮮閾值均大于1 mmol/L，鮮味閾值分別為0.52、0.86、0.30 mmol/L和0.44 mmol/L；而AHLRF并未品嘗出甜味，鮮味提升效果較弱，增鮮閾值為2.43 mmol/L，鮮味閾值為0.49 mmol/L，增鮮效果最差。8 條多肽中KPDNR鮮味閾值最低為0.30 mmol/L，但雷達(dá)圖并未顯示出其鮮味最強(qiáng)，可能由于其他味覺屬性如甜味的協(xié)同作用增強(qiáng)了鮮味值，導(dǎo)致感官的鮮味閾值偏低[27]。增鮮效果最好的多肽是LDWDR，其增鮮閾值為0.53 mmol/L，雖然其鮮味閾值最高，鮮味值低，但是在添加0.5 mg/mL的MSG溶液后，展現(xiàn)出更強(qiáng)的鮮味提升效果，可能是由于MSG與合成肽產(chǎn)生了味覺協(xié)同作用，導(dǎo)致合成肽味覺屬性變化，致使鮮味增強(qiáng)[29,36]。

表4 合成肽的味覺描述、鮮味閾值及增鮮閾值Table 4 Taste description,umami thresholds and umami-enhancing thresholds of synthetic peptides

2.3.2 合成肽與MSG的協(xié)同增鮮效應(yīng)分析

為進(jìn)一步探究多肽的協(xié)同增鮮效果，將0.2 mg/mL鮮味合成肽添加到2 mg/mL MSG溶液中進(jìn)行電子舌測定，與0.5～3.5 mg/mL MSG溶液的鮮味值比較。圖5顯示，添加合成肽后，除LDWDR外，其余7 條多肽對MSG溶液均有不同程度的鮮味提升效果，相比2 mg/mL MSG溶液的鮮味值分別提升了61.12%、29.25%、26.62%、22.94%、14.54%、0.18%、26.44%，添加ELWR、RLVDR、KPDNR和EGHKGW這4 條多肽溶液的鮮味值甚至超出3.5 mg/mL MSG溶液的鮮味值，分別超出了27.78%、2.50%、0.42%和0.28%，且4 條多肽在較低濃度下就表現(xiàn)出極強(qiáng)的鮮味增強(qiáng)效果。從不同質(zhì)量濃度MSG溶液的咸味值可以看出，添加0.2 mg/mL合成肽溶液的咸味值相比2 mg/mL MSG溶液提升效果顯著（除DDWWR外）（P＜0.05），咸味值分別提升了130.83%、139.56%、132.89%、129.00%、2.55%、8.25%和123.67%，添加ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW后，溶液的咸味值超出了3.5 mg/mL MSG溶液的咸味值。

圖5 合成肽與MSG的協(xié)同增鮮效應(yīng)Fig.5 Synergistic umami-enhancing effect of synthetic peptides and MSG

合成肽與MSG的協(xié)同增鮮實驗表明，鮮味肽加入后對MSG產(chǎn)生了協(xié)同作用，從而增強(qiáng)了MSG溶液的鮮味值和咸味值，這也與Goto等[37]的研究結(jié)果一致。Deng Xiaofei等[36]研究卵形鯧鲹水解物中的合成肽時發(fā)現(xiàn)，在2 mg/mL MSG溶液中添加1 mg/mL合成肽后，溶液鮮味提升，且表現(xiàn)出更豐富更柔和的味覺屬性。本研究中，除LDWDR外，合成肽質(zhì)量濃度在0.2 mg/mL時均能提升溶液鮮味，ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW在低質(zhì)量濃度時也表現(xiàn)出對MSG溶液良好的鮮味和咸味提升效果。

2.3.3 合成肽在MSG溶液中的劑量-反應(yīng)關(guān)系

劑量-反應(yīng)實驗可以反映在MSG溶液中，合成肽濃度增加對MSG呈味特性的影響[29]，結(jié)果如圖6所示，隨著合成肽質(zhì)量濃度的提高，8 條多肽均表現(xiàn)出不同程度的鮮味提升效果，鮮味增強(qiáng)曲線呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（除AHLRF外），而AHLRF僅在1 mg/mL時對溶液的鮮味具有增強(qiáng)作用，隨著濃度提升，鮮味并未增強(qiáng)。LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW 4 條多肽在1～4 mg/mL范圍內(nèi)，使得MSG溶液的鮮味強(qiáng)度急劇增加，當(dāng)添加的合成肽質(zhì)量濃度超過4 mg/mL后，高質(zhì)量濃度合成肽的酸味和苦澀味掩蓋或者抑制了鮮味，導(dǎo)致溶液的鮮味強(qiáng)度降低[16,38]，可見并非質(zhì)量濃度越高對MSG溶液的鮮味增強(qiáng)效果越好，而這與An Feiyu等[31]的研究結(jié)果一致。ELWR、RLVDR和KPDNR也表現(xiàn)出與LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW相似的增鮮趨勢，不同的是，ELWR、RLVDR和KPDNR增鮮強(qiáng)度呈現(xiàn)下降的質(zhì)量濃度分別為3、5 mg/mL和5 mg/mL。此外，RLVDR和KPDNR在達(dá)到最高鮮味強(qiáng)度后，隨著質(zhì)量濃度提高，溶液的鮮味強(qiáng)度驟降；而ELWR、LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW這5 條多肽在達(dá)到鮮味峰值后，隨著質(zhì)量濃度提升，溶液的鮮味強(qiáng)度則表現(xiàn)出緩慢下降的趨勢?？傊?，多肽在低質(zhì)量濃度時可能對MSG溶液不具備鮮味提升作用，且隨著質(zhì)量濃度增加鮮味亦不會提升甚至?xí)陆担梢姸嚯呐cMSG溶液協(xié)同增鮮，質(zhì)量濃度至關(guān)重要。

圖6 合成肽在MSG溶液中的劑量-反應(yīng)曲線Fig.6 Dose-response curves of umami taste for synthetic peptides in MSG solution

2.3.4 合成肽與其組成氨基酸混合物的呈味效應(yīng)比較

為進(jìn)一步說明多肽的味覺屬性并非相應(yīng)氨基酸味道的疊加，對組成合成肽的氨基酸混合物在水溶液中的滋味特征進(jìn)行了感官評價（圖7），發(fā)現(xiàn)8 條多肽與其等質(zhì)量配比的氨基酸混合液的呈味差異顯著。ELWR和RLVDR的組成氨基酸混合液溶液苦味突出，而多肽溶液以甜鮮味為主，主要是由于苦味氨基酸占比高，分別為75%和80%，而多肽由于氨基酸脫水縮合形成肽鍵及空間結(jié)構(gòu)，可能改變了其呈味特性，從而產(chǎn)生明顯的味覺差異；LDWDR、LAEWR和DDWWR的苦味氨基酸占比60%，鮮甜味氨基酸占比40%，合成肽溶液分別突出在鮮味或鮮咸味，而等質(zhì)量配比的氨基酸混合液則苦味突出，可見鮮味不僅與氨基酸組成和排列順序有關(guān)，肽鏈構(gòu)象也會影響鮮味的呈現(xiàn)[16]。KPDNR和EGHKGW溶液鮮甜味突出，其鮮甜味氨基酸占比突出，組成氨基酸混合液卻分別表現(xiàn)出甜味和苦味的特征，表明多肽中鮮甜味氨基酸占比大時，有助于多肽的鮮味呈現(xiàn)，這也與林萌莉等[39]的發(fā)現(xiàn)一致。AHLRF溶液表現(xiàn)出鮮咸味突出的特征，苦味氨基酸占比達(dá)到80%，氨基酸混合液苦味突出，甜味、鮮味和咸味不明顯，其苦味值是合成肽苦味值的近3 倍，合成肽的甜味和鮮味值顯著高于混合液，而合成肽突出的苦味可能與苦味氨基酸占比較大，以及C-末端為疏水氨基酸苯丙氨酸有關(guān)?？傊?，氨基酸混合物的味覺特征表現(xiàn)出單個氨基酸口味疊加的特點(diǎn)，而多肽豐富的滋味特征與其氨基酸組成和特定空間結(jié)構(gòu)相關(guān)，這也與Feng Tao等[40]的研究結(jié)果一致。

圖7 合成肽與等質(zhì)量配比的氨基酸混合物的感官評價分析對比圖Fig.7 Taste intensity of 1∶1 mixtures of amino acids and synthetic peptides

3 結(jié)論

通過對大球蓋菇酶解液進(jìn)行超濾和凝膠過濾色譜分離，結(jié)合感官評價和電子舌分析，得到鮮味最強(qiáng)組分F3，通過RP-HPLC-MS/MS鑒定得到8 條多肽，分別為ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF、LDWDR、LAEWR、DDWWR和EGHKGW，以五肽為主，分子質(zhì)量在602.3176～776.3242 Da之間。8 條多肽呈味特性豐富，且兼具鮮味及其增強(qiáng)特性，鮮味閾值在0.30～1.33 mmol/L之間，增鮮閾值在0.53～2.43 mmol/L之間。它們與MSG的協(xié)同增鮮實驗表明，除LDWDR外，其余7 條多肽對MSG溶液均有不同程度的鮮味提升作用，提升幅度為0.18%～61.12%；除DDWWR外，其余7 條多肽對MSG溶液的咸味提升了2.55%～139.56%；ELWR、RLVDR、KPDNR、AHLRF和EGHKGW 5 條多肽在低濃度時也表現(xiàn)出良好的鮮味和咸味提升效果。除AHLRF外，其余7 條合成肽的劑量-反應(yīng)曲線均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，RLVDR和KPDNR的鮮味峰值質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL；協(xié)同增鮮效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，合成肽質(zhì)量濃度對于協(xié)同增鮮具有重要作用。此外，通過比較合成肽和其組成氨基酸混合物的呈味特性發(fā)現(xiàn)，氨基酸的組成、種類和空間結(jié)構(gòu)均會對合成肽的味覺屬性產(chǎn)生影響，且合成肽的呈味并不是氨基酸味覺屬性的簡單疊加，而是各方面因素綜合影響的結(jié)果。綜上所述，本研究為大球蓋菇鮮味肽的開發(fā)利用及天然鮮味調(diào)味品在食品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。