陳雪妍，楊 波，羅瑞明，張 倩，王金霞，李 榮，胡麗筠

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

當(dāng)動(dòng)物被屠宰時(shí)，肌肉組織不會(huì)立即停止代謝過(guò)程[1]，而是由有氧代謝轉(zhuǎn)為無(wú)氧代謝，這一過(guò)程被稱為糖酵解。宰后糖酵解在肌肉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，糖原在缺氧條件下轉(zhuǎn)化為丙酮酸并生成少量ATP[2-3]，為細(xì)胞供能。無(wú)氧糖酵解過(guò)程在產(chǎn)能的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生乳酸，使肉的pH值降低[4-5]。

灘羊是寧夏、甘肅、陜西等西北地區(qū)的優(yōu)勢(shì)畜種，寧夏鹽池縣更是被譽(yù)為“灘羊之鄉(xiāng)”。鹽池縣日照時(shí)間長(zhǎng)、晝夜溫差大、極少下雨等地理特點(diǎn)使該地生長(zhǎng)著高營(yíng)養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)牧草[6]，造就了灘羊肉質(zhì)細(xì)嫩、膻腥味低、含脂率低等獨(dú)特的品質(zhì)[7]。然而灘羊宰后貯藏不當(dāng)則會(huì)導(dǎo)致肉質(zhì)降低。因此，有必要深度了解調(diào)控宰后肌肉肉質(zhì)特性的機(jī)理。

宰后肌肉成熟期間，肌肉pH值、糖酵解、肌肉中基因的變化等均會(huì)顯著影響肉品質(zhì)，這些因素共同調(diào)節(jié)肌肉中相關(guān)基因的變化改變肌肉代謝，從而決定肌肉的品質(zhì)，因此，動(dòng)物宰后導(dǎo)致肌肉品質(zhì)改變的重要原因是基因的變化[8]。近年來(lái)，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析肉品品質(zhì)變化已經(jīng)成為了熱點(diǎn)，Wang Zhengwen等[9]揭示了平?jīng)黾t牛與優(yōu)質(zhì)肉牛品種的轉(zhuǎn)錄代謝水平差異，表明平?jīng)黾t牛具有培育高檔肉牛的遺傳潛力。Li Yan等[10]發(fā)現(xiàn)了，MYH1、GADL2、CYP1R1、EEPD3和SHISA1是與牛肉品質(zhì)性狀相關(guān)的新型候選基因。Listyarini等[11]對(duì)10 只表型不同的綿羊進(jìn)行了深度測(cè)序，表明類固醇激素的生物合成是羔羊嫩化的主要途徑，OLFML3、ANGPTL2和THOC5基因突變可能是綿羊嫩度的潛在候選標(biāo)記。Sun Limin等[12]使用RNA測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）從兩種羊肉背最長(zhǎng)肌中獲得了轉(zhuǎn)錄組圖譜。結(jié)果顯示差異表達(dá)基因（differential expression genes，DEGs）有960 個(gè)，其中405 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，555 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。Zuo Huixin等[13]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法研究了宰后貯藏期間牦牛肉品質(zhì)變化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白、肌球蛋白輕鏈和熱休克蛋白27等可能通過(guò)碳代謝、糖酵解、氨基酸合成及丙酮酸代謝影響牦牛肉的品質(zhì)。

雖然轉(zhuǎn)錄組學(xué)在肉品品質(zhì)變化領(lǐng)域的研究加深了對(duì)于宰后肌肉代謝途徑變化的理解，但采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法從基因的水平深度解析成熟期間灘羊肉糖酵解途徑對(duì)肉品質(zhì)變化的影響少有報(bào)道。因此，本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究不同成熟時(shí)間冷卻灘羊肉中的基因表達(dá)情況，篩選并分析DEGs，鑒定出糖酵解途徑上影響灘羊肉品質(zhì)的核心基因，為完善灘羊肉質(zhì)量控制技術(shù)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

公灘羊取自寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)清真食品有限公司；TRIzol試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Gene Read TM 試劑盒德國(guó)Qiagen 公司；NEB fragmentation buffer dNTPs、DNA聚合酶I、RNase H日本TaKaRa公司；AMPure XP beads 美國(guó)Beckman Coultier公司；FastKing RT Kit（with gDNase）天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoPhotometer納米光度計(jì) 德國(guó)Implen公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；Qubit2.0熒光計(jì)美國(guó)Life Technologies公司；Illumina高通量測(cè)序儀 中國(guó)Novogene公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)、GeneAmp PCR system 9700基因擴(kuò)增儀、Thermo Scientific Forma 994-80 ℃超低溫冰箱 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

隨機(jī)選取來(lái)自寧夏鹽池縣大夏牧場(chǎng)清真食品有限公司的6 月齡、品質(zhì)相近、飼養(yǎng)條件相同的閹割公灘羊，屠宰后每個(gè)貯藏時(shí)間段取3 個(gè)羊后腿，共取9 個(gè)灘羊后腿，剔除肉眼可見(jiàn)的脂肪、結(jié)締和筋膜后將其放入聚乙稀薄膜并包裹錫紙。采集于0～4 ℃條件下成熟0、4、8 d的灘羊后腿肉各300 mg，分別記為C0-1、C0-2、C0-3、C4-1、C4-2、C4-3、C8-1、C8-2、C8-3，在液氮中速凍，用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

1.3.2 RNA提取

樣品按照美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司的說(shuō)明使用TRIzol試劑盒進(jìn)行灘羊后腿組織總RNA的提取。RNA樣品的濃度、純度和完整性利用NanoPhotometer納米光度計(jì)和2100生物分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

質(zhì)檢合格后的RNA樣品采用GeneReadTM試劑盒去除核糖體RNA，隨后加入NEB fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段。首先，使用聚T寡核苷酸附著磁珠從總RNA中純化mRNA，然后在NEBNext鏈合成反應(yīng)緩沖液（5×）中使用二價(jià)陽(yáng)離子實(shí)現(xiàn)片段化。使用隨機(jī)六聚體引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-），基于第1鏈，使用DNA聚合酶I和RNase H進(jìn)行第2鏈cDNA合成。cDNA文庫(kù)片段使用AMPure XP系統(tǒng)純化。在37 ℃產(chǎn)生銜接的cDNA 15 min，然后在5 ℃生產(chǎn)95 min，使用Phusion高保真DNA聚合酶，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物和索引（X）引物進(jìn)行PCR，得到最終的文庫(kù)[14]。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0熒光計(jì)進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5 ng/μL，隨后使用2100生物分析儀對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，符合預(yù)期后，使用實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）方法準(zhǔn)確定量文庫(kù)的有效濃度（高于2 nmol/L），確保文庫(kù)質(zhì)量合格。文庫(kù)經(jīng)檢驗(yàn)合格后，在Illumina平臺(tái)上測(cè)序。

1.3.4 質(zhì)量控制、轉(zhuǎn)錄組組裝和基因功能注釋

對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、處理后得到后續(xù)分析使用的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，即Clean reads。利用Hisat 2軟件將Clean reads數(shù)據(jù)比對(duì)到綿羊參考基因組上，然后使用Stringtie軟件在基于比對(duì)到基因組上的結(jié)果，將reads拼接成轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。使用Cuffmerge軟件對(duì)各樣本拼接得到的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行合并，去掉其中鏈方向不確定和長(zhǎng)度不超過(guò)200 nt的轉(zhuǎn)錄本，基因功能基于以下數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋：Nr、Nt、Swiss-Prot、Pfam、基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）。

1.3.5 DEGs分析和功能富集

通過(guò)StringTie分析流程計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本在各樣本中的表達(dá)水平，結(jié)果以FPKM（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）值表示，F(xiàn)PKM用于量化基因表達(dá)水平，是目前最常用的估計(jì)基因表達(dá)水平的方法。利用DESeq 2軟件對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析，以變化倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.8或＜1/1.8且P＜0.05作為組間差異顯著基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。為進(jìn)一步了解組間DEGs的功能和參與的代謝通路，將篩選出的DEGs通過(guò)Omicsbean網(wǎng)站（http://www.omicsbean.cn/）進(jìn)行DEGs的GO富集分析和KEGG途徑分析。

1.3.6 real-time PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取5 個(gè)DEGs進(jìn)行real-time PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)是否可靠。利用FastKing RT Kit（with gDNase）試劑盒將原始樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。內(nèi)參基因選用GAPDH基因，引物均由科技有限公司合成。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)real-time PCR的引物，灘羊后腿肉糖酵解相關(guān)基因磷酸果糖激酶（phosphofructokinase muscle，PFKM）、丙酮酸激酶M1/2（pyruvate kinase M1/2，PKM）、磷酸甘油酸變位酶2（phosphoglycerate mutase 2，PGAM2）、烯醇化酶3（enolase 3，ENO3）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序：95 ℃、30 s預(yù)變性；95 ℃、10 s變性，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)[15]。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，隨后用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，并通過(guò)log2FC進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in real-time polymerase chain reaction (PCR)

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2022b軟件繪制火山圖，通過(guò)Omicsbean網(wǎng)站（http://www.omicsbean.cn/）進(jìn)行DEGs的GO富集分析和KEGG途徑分析。采用Venn網(wǎng)站（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、string網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/）進(jìn)行核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和de novo組裝數(shù)據(jù)分析

對(duì)來(lái)自樣品的9 個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[16]，共獲得57.02 Gb的序列，394、491、196 個(gè)原始序列和380、156、994 個(gè)過(guò)濾序列，其中96、525、684 個(gè)過(guò)濾序列來(lái)自樣品。樣品的堿基測(cè)序錯(cuò)誤率為0.02%。如表2所示，9 個(gè)文庫(kù)過(guò)濾序列的從頭組裝產(chǎn)生了77709 個(gè)單基因，總長(zhǎng)度為59960697 bp，其中N50為672 bp。從頭組裝詳細(xì)信息如表3所示。

表2 Illumina測(cè)序的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of Illumina sequencing data

表3 轉(zhuǎn)錄組從頭組裝結(jié)果Table 3 Results of de novo assembly of transcriptome

2.2 DEGs篩選

以FC＞1.8或＜1/1.8且P＜0.05篩選DEGs，結(jié)果表明，4 d vs 0 d組一共鑒定出1059 個(gè)顯著DEGs，326 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)，733 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)（圖1A）；8 d vs 4 d組一共鑒定出289 個(gè)顯著DEGs，133 個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)，156 個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)（圖1B）。

圖1 不同成熟期灘羊肉DEGs的火山圖Fig.1 Volcano plots of DEGs in Tan lamb meat at different maturity stages

2.3 DEGs生物學(xué)分析

2.3.1 GO功能注釋富集分析

采用GO注釋對(duì)篩選出的DEGs做生物信息分析。生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能的結(jié)果表明，4 d vs 0 d組富集到1653 個(gè)生物過(guò)程、193 個(gè)細(xì)胞組分和326 個(gè)分子功能；8 d vs 4 d組富集到1035 個(gè)生物過(guò)程、114 個(gè)細(xì)胞組分和155 個(gè)分子功能。

由圖2A可知，宰后成熟0～4 d，DEGs涉及的生物過(guò)程主要包括翻譯、肽代謝過(guò)程、酰胺生物合成和有機(jī)氮化合物代謝等；分子功能主要包括核糖體、核糖體蛋白質(zhì)復(fù)合體和細(xì)胞內(nèi)核糖蛋白復(fù)合體等；細(xì)胞組分主要包括核糖體結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性、肽酶調(diào)節(jié)活性等；以上結(jié)果表明，宰后初期核糖體、收縮纖維、肌原纖維等構(gòu)成灘羊肌肉結(jié)構(gòu)和影響灘羊能量代謝的基因發(fā)生變化，可能引起了骨骼肌收縮和結(jié)構(gòu)分子活性降低，這些基因位于細(xì)胞質(zhì)中，主要負(fù)責(zé)離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合等功能。李升升[17]研究結(jié)果表明肌肉收縮狀態(tài)可以改變肌肉的結(jié)構(gòu)，從而影響肌肉品質(zhì)變化。

圖2 不同成熟期灘羊肉DEGs的GO注釋（前10）Fig.2 Gene ontology annotation of DEGs in Tan lamb meat at different maturity stages (top 10 terms)

由圖2B可知，宰后成熟4～8 d，DEGs涉及的生物過(guò)程主要包括細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程、ATP代謝過(guò)程、骨骼肌收縮和多細(xì)胞生物運(yùn)動(dòng)等；細(xì)胞組分主要包括細(xì)胞骨架部分、核糖體和大核糖體亞基等；分子功能主要包括核苷三磷酸酶活性、水解酶活性和核糖體結(jié)構(gòu)等。以上結(jié)果表明，成熟4 d后的灘羊肉，DEGs變化除了引起肌肉收縮、細(xì)胞酰胺代謝，還涉及了ATP等代謝過(guò)程和酶活性的變化。

2.3.2 KEGG 通路分析

采用KEGG通路對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行通路注釋分析。4 d vs 0 d組富集到5 個(gè)通路，8 d vs 4 d組顯著富集到6 個(gè)通路。由圖3A可知，DEGs在宰后成熟0～4 d參與的通路主要有核糖體、糖酵解、心肌收縮、p53信號(hào)通路、膽汁酸生物合成；由圖3B可知，DEGs在宰后成熟4～8 d參與的通路主要有核糖體，糖酵解，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，趨化因子信號(hào)通路等。這些代謝過(guò)程可能通過(guò)影響相關(guān)基因參與的生物學(xué)過(guò)程間接影響肌肉的品質(zhì)。

圖3 不同成熟期灘羊肉DEGs的KEGG通路注釋Fig.3 KEGG pathway annotation of DEGs in Tan lamb meat at different maturity stages

2.4 核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Venn篩選不同成熟期共有的DEGs，發(fā)現(xiàn)0～4 d與4～8 d兩個(gè)成熟期共有的DEGs為50 個(gè)（圖4）。通過(guò)String對(duì)共有的DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明該網(wǎng)絡(luò)中PPI富集的P值為2.16×10-9，聚類系數(shù)為0.334，發(fā)現(xiàn)了47 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)，33 條邊位于該互作網(wǎng)絡(luò)中（圖5），該結(jié)果表明，24 個(gè)DEGs之間具有明顯的互作關(guān)系。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1進(jìn)行核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選，5 個(gè)糖酵解相關(guān)基因處于該核心網(wǎng)絡(luò)中（圖6）。

圖4 不同成熟期灘羊肉DEGs的Venn圖Fig.4 Venn diagram of DEGs in Tan lamb meat at different maturity stages

圖5 共有DEGs的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Interaction network diagram of shared DEGs

圖6 核心互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建Fig.6 Construction of core protein-protein interaction network

PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH基因均為灘羊后腿肉糖酵解相關(guān)基因。由表4可知，PFKM、PKM、PGAM2和ENO3在0～4 d內(nèi)上調(diào)表達(dá)可能是由于肉屠宰后糖酵解被迅速開(kāi)啟，維持肌細(xì)胞無(wú)氧代謝。4～8 d內(nèi)約半數(shù)基因發(fā)生下調(diào)，表明成熟后期多數(shù)糖酵解相關(guān)基因可能由于灘羊肉中的環(huán)境和微生物等的相互作用被降解。

表4 核心網(wǎng)絡(luò)中DEGs的變化趨勢(shì)Table 4 Trends of DEGs in core networks

5 個(gè)DEGs位于細(xì)胞器上，與離子或細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與ATP代謝以及骨骼肌收縮，富集于糖酵解代謝通路，表明這些DEGs通過(guò)改變肌肉結(jié)構(gòu)分子活性和水解酶活性，從而影響灘羊肉的品質(zhì)。

2.5 real-time PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq結(jié)果，選擇核心網(wǎng)絡(luò)中5 個(gè)糖酵解途徑上的DEGs，并應(yīng)用real-time PCR測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)水平（圖7）。表5顯示，基因表達(dá)與來(lái)自RNA-Seq結(jié)果的FPKM值一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)可靠。

圖7 DEGs的real-time PCR結(jié)果Fig.7 Real-time PCR analysis of DEGs

表5 5 個(gè)代表性DEGs的RNA-Seq和real-time PCR結(jié)果比較Table 5 Comparison of RNA-Seq and real-time PCR results of five representative DEGs

3 討論

宰后肉質(zhì)的變化涉及一系列生化反應(yīng)。在這些變化中，糖酵解、尸僵和蛋白水解是決定大多數(shù)重要的肉質(zhì)屬性的根本原因，如pH值、顏色、嫩度、持水能力，甚至烹飪后的肉味[18]。放血后，肌細(xì)胞不會(huì)立即死亡，而是存活一定的時(shí)間，在此期間，細(xì)胞從有氧代謝切換到糖酵解以產(chǎn)生ATP，試圖維持體內(nèi)平衡和細(xì)胞功能。為揭示宰后灘羊肉成熟過(guò)程中能量代謝變化對(duì)肉品質(zhì)的影響，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究宰后成熟期間灘羊肉轉(zhuǎn)錄組的變化。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，總共組裝了77709 個(gè)單基因，N50為672 bp，其中64.46%可以被注釋。采用GO和KEGG富集分析對(duì)1348 個(gè)DEGs進(jìn)行了分類。4 d vs 0 d組GO富集的3 個(gè)功能類別中最主要的分別是有機(jī)氮化合物代謝、核糖體蛋白質(zhì)復(fù)合體和結(jié)構(gòu)分子活性（圖2A），8 d vs 4 d組這3 個(gè)功能類別中最主要的分別是細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程、細(xì)胞骨架成分、核苷三磷酸酶和水解酶活性（圖2B）。表明0～4 d期間，位于核糖體的基因參與有機(jī)氮化合物代謝過(guò)程等，這些基因編碼的蛋白質(zhì)具備結(jié)構(gòu)分子活性等功能。4～8 d期間，位于細(xì)胞骨架的基因參與調(diào)控細(xì)胞酰胺代謝等過(guò)程，這些基因編碼的蛋白質(zhì)具備ATP酶和水解酶等功能。這些變化的基因引起線粒體ATP合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致灘羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)變化，從而引起肉能量水平及品質(zhì)的改變。此外，KEGG富集分析表明，4 d vs 0 d組富集DEGs較多的是核糖體、糖酵解、心肌收縮、p53信號(hào)通路、膽汁酸生物合成（圖3A），8 d vs 4 d組富集DEGs較多的是核糖體、糖酵解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、趨化因子信號(hào)通路等（圖3B）。其中糖酵解、核糖體和p53信號(hào)通路為不同貯藏期間DEGs共同注釋到的代謝通路，這些途徑是肌肉細(xì)胞功能的關(guān)鍵部分。核糖體是mRNA進(jìn)行翻譯的主要場(chǎng)所，主要由核糖體RNA和多種核糖體蛋白構(gòu)成，是一類高度復(fù)雜的細(xì)胞器[19]。為了增殖，活細(xì)胞在細(xì)胞周期中生長(zhǎng)和分裂，細(xì)胞周期受到各種檢查點(diǎn)的嚴(yán)格控制，p53信號(hào)通路就是公認(rèn)的對(duì)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要的通路，p53基因能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/Akt）途徑發(fā)出生長(zhǎng)因子可用性的信號(hào)，并刺激營(yíng)養(yǎng)攝取以支持mTOR依賴性細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，而AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑則發(fā)出能量不足的信號(hào)并觸發(fā)p53依賴性應(yīng)激反應(yīng)[21]。Chen Li等[22]研究發(fā)現(xiàn)宰后早期的蛋白質(zhì)磷酸化可能通過(guò)調(diào)節(jié)參與糖酵解和肌肉收縮的蛋白質(zhì)間接影響糖酵解途徑，其中PFKM為磷酸蛋白，PFKM在被AMPK磷酸化后被激活，以上調(diào)糖酵解并維持細(xì)胞內(nèi)ATP穩(wěn)態(tài)。糖酵解是宰后肌肉產(chǎn)生能量的主要途徑，Jiang Shengwang等[18]研究表明，糖酵解和肌肉pH值、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、肌肉收縮和僵硬、鈣信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白水解、次黃嘌呤核苷酸合成和肉味發(fā)育，甚至調(diào)節(jié)色素蛋白和肉色的穩(wěn)定性都能影響肉質(zhì)變化。因此，宰后肌肉代謝的轉(zhuǎn)換和肉品質(zhì)變化均與貯藏期間肌肉轉(zhuǎn)錄水平的變化密切相關(guān)。

對(duì)篩選到不同成熟期共有的50 個(gè)DEGs進(jìn)行核心互作網(wǎng)絡(luò)篩選，結(jié)果表明，PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH處于該核心網(wǎng)絡(luò)中，且全部為灘羊肉糖酵解途徑上調(diào)控肉質(zhì)的相關(guān)基因，幾個(gè)基因之間具有密切的調(diào)控關(guān)系，某一基因表達(dá)水平改變就會(huì)影響其他幾個(gè)糖酵解基因表達(dá)水平的變化[23]。核心基因?qū)μ墙徒馔緩降恼{(diào)控如圖8所示，PFKM是催化6-磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖這一不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，是PFK的一個(gè)亞型。6-磷酸果糖激酶主要通過(guò)PFKM基因影響糖酵解的速率，并且PFKM基因的相對(duì)表達(dá)量直接影響糖酵解的反應(yīng)速率。許金蔓[24]研究發(fā)現(xiàn)PFKM表達(dá)改變也可以導(dǎo)致線粒體功能的改變，導(dǎo)致肌肉變質(zhì)。PKM是糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸的最后一個(gè)關(guān)鍵酶[25]，PKM在糖酵解骨骼肌的長(zhǎng)胸肌中顯著表達(dá)，其豐度與肉品質(zhì)的pH值和滴失有關(guān)[26]。此外，GAPDH還通過(guò)降低屠宰后肌肉的pH值影響肉質(zhì)[27]。研究表明，PFKM、PKM、GAPDH是糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，影響糖酵解肌肉表型。PGAM是糖酵解中的關(guān)鍵酶，可將3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以兩種亞型表達(dá)：腦（PGAM1）和肌肉（PGAM2）。PGAM2基因編碼一種肌肉酶亞型，該亞型參與丙酮酸厭氧轉(zhuǎn)化為乳酸之前糖酵解途徑的最后步驟之一。PGAM2的過(guò)表達(dá)增加了3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸水平。Okuda等[28]研究發(fā)現(xiàn)PGAM2與死后乳酸水平密切相關(guān)，Yang Haoxin等[29]研究表明PGAM2表達(dá)水平與持水能力呈負(fù)相關(guān)，這種基因在協(xié)調(diào)能量產(chǎn)生與還原力的產(chǎn)生以及核苷酸前體和氨基酸的生物合成方面起著重要作用[30]。ENO3也是一種糖酵解酶，主要存在于肌肉組織中，具有強(qiáng)大的能量代謝功能。Wu Jian等[31]等分離出豬ENO3基因的全長(zhǎng)cDNA，發(fā)現(xiàn)ENO3轉(zhuǎn)錄本1在肝臟和肺中高表達(dá)，轉(zhuǎn)錄本2在骨骼肌和心臟中高表達(dá)，表明烯醇化酶可能在骨骼肌發(fā)育和肌肉分化過(guò)程中起重要作用，且ENO3基因可能是動(dòng)物育種中肉質(zhì)和胴體性狀的重要候選基因，并可能參與肌肉發(fā)育機(jī)制。綜上所述，灘羊宰后通過(guò)影響糖酵解核心基因?qū)γ负蛷?fù)合物活性、結(jié)構(gòu)蛋白的降解程度、ATP的產(chǎn)生及肌纖維結(jié)構(gòu)的改變影響品質(zhì)。

圖8 核心基因作用糖酵解途徑的機(jī)制圖Fig.8 Diagram of the mechanism of the glycolytic pathway of core gene action

4 結(jié)論

利用RNA-Seq篩選出的DEGs位于細(xì)胞器、細(xì)胞外區(qū)和核糖體，與離子或細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與ATP酶活性的調(diào)節(jié)以及肌肉收縮，引起線粒體ATP合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、氫離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致灘羊肉肌纖維結(jié)構(gòu)變化，從而引起肉能量水平及品質(zhì)的改變。分析鑒定出PFKM、PKM、PGAM2、ENO3、GAPDH為影響灘羊肉品質(zhì)的核心基因，且全部為糖酵解途徑相關(guān)基因，通過(guò)影響肌纖維結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)蛋白的降解程度、糖酵解酶活性、ATP的產(chǎn)生和復(fù)合物活性等進(jìn)一步影響肉品質(zhì)。