劉海燕，李快芬，陳后英，丁貴杰＊

(1. 貴州大學(xué)貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省植物園，貴州 貴陽 550004；3. 貴州省國有龍里林場，貴州 黔南 558000；4. 國家林業(yè)和草原局西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

馬尾松(Pinus massonianaLamb.)作為我國亞熱帶特有樹種，具有分布廣、速生、豐產(chǎn)、適生能力較強(qiáng)等優(yōu)良特性，是我國南方最主要工業(yè)用材樹種之一，種植面積約占2/3 以上[1]，同時(shí)也是典型的先鋒樹種和外生菌根樹種[2]。由于酸沉降、馬尾松自身凋落物和根系分泌物的作用使得馬尾松林地土壤酸化嚴(yán)重，并隨連栽代數(shù)的增加而酸化增強(qiáng)[3]。我國南方馬尾松林土壤心土層pH 值一般小于4.5，交換性鋁含量很高[4]，因而馬尾松常表現(xiàn)出中等以上程度的受害，甚至枯死，進(jìn)而導(dǎo)致林地生態(tài)功能失調(diào)，水土保持功能下降。20 世紀(jì)80 年代，由于鋁毒作用導(dǎo)致我國南方酸雨地區(qū)發(fā)生了馬尾松林衰亡現(xiàn)象[5]。已有大量研究表明，真菌和植物根系形成的共生體——菌根，不僅能促進(jìn)植物的生長，還能通過外延菌絲擴(kuò)大植物根系的吸收面積，增強(qiáng)植物對營養(yǎng)和水分的攝取能力，從而提升宿主對干旱脅迫、鹽分脅迫、低磷脅迫、重金屬毒害等的耐受性[6-10]。菌根化育苗造林必將成為林業(yè)生態(tài)工程綜合治理的重要前沿技術(shù)途徑。而且，在自然界也存在既耐鋁又耐貧瘠的優(yōu)良菌株，如彩色豆馬勃(Pisolithus tinctorius)[11]，篩選更多的優(yōu)良本土菌株，研究其提高寄主植物耐鋁機(jī)制對退化森林的恢復(fù)具有重要意義。

松屬植物（包括馬尾松）是各種外生菌根真菌的天然宿主[12-13]。馬尾松可與約 36 種外生菌根真菌形成菌根，其中，以牛肝菌科（Boletaceace）和紅菇科（Russulaceae）的真菌占優(yōu)勢[14]。接種外生菌根真菌，可以提高馬尾松在酸性土壤中的生存能力和耐鋁性，是因?yàn)橥馍婢梢詫⒅亟饘僭匚?、固定并積聚在菌根菌絲等部位，限制其向植物體內(nèi)運(yùn)輸，也可以通過菌套和哈蒂氏網(wǎng)等菌根結(jié)構(gòu)吸收過濾有毒物質(zhì)[15]。而且菌根分泌的有機(jī)酸降低了活性鋁含量，菌根還可以促進(jìn)土壤中難溶養(yǎng)分的溶解，促進(jìn)植物對土壤養(yǎng)分的吸收[4,9,16]。陳展等[17]也發(fā)現(xiàn)，模擬酸雨處理下接種外生菌根真菌的馬尾松幼苗根系中Al 含量下降，抵消了酸雨脅迫對馬尾松的影響。 接種褐環(huán)乳牛肝菌（Suillus luteus）的馬尾松幼苗，還改變了馬尾松幼苗根系結(jié)構(gòu)從而提高了馬尾松幼苗的耐鋁能力[18]。

植物根系細(xì)胞壁是與鋁接觸的最初部位，鋁在根尖細(xì)胞壁上的積累是鋁對植物根尖產(chǎn)生毒害的先決條件[19]。鋁與細(xì)胞結(jié)合后，會(huì)影響一系列的細(xì)胞過程，如影響細(xì)胞壁酶活性[20]、營養(yǎng)物質(zhì)交換[21]、細(xì)胞器損傷[22]、降低細(xì)胞延展性[23]等。目前，關(guān)于鋁的亞細(xì)胞定位仍然是以推測性的為主[21,23]，而鋁在馬尾松菌根細(xì)胞的亞細(xì)胞定位還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用前期篩選出的優(yōu)良外生菌根真菌褐環(huán)乳牛肝菌接種馬尾松幼苗，采用砂培盆栽澆鋁法，分別設(shè)置4 個(gè)Al3+濃度梯度處理，通過比較研究馬尾松菌根/非菌根幼苗的生理、根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及Al 的亞細(xì)胞分布，分析菌根化苗木對鋁的響應(yīng)及其提高寄主植物耐鋁性的可能機(jī)理，為外生菌根真菌在提高寄主植物抗逆性和育苗造林應(yīng)用等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選取的外生菌根真菌褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteus（SL）采自貴州省龍里林場馬尾松人工純林（107°00'37″ E，26°28'01″ N），菌株保存于貴州省森林資源與環(huán)境中心微生物實(shí)驗(yàn)室。馬尾松種子采自貴州省都勻市馬鞍山林場國家馬尾松良種基地的優(yōu)良半同胞家系黃12 單株，千粒質(zhì)量為11.1 g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以接種褐環(huán)乳牛肝菌的馬尾松半年生苗為試驗(yàn)組（SL），未接種褐環(huán)乳牛肝菌的馬尾松半年生苗為對照組（NE）。采用砂培盆栽，石英砂經(jīng)漂洗、在高壓滅菌鍋內(nèi)(壓力0.14 MPa，121 ℃ ) 連續(xù)滅菌2 h 后，裝入營養(yǎng)缽(口底高：21 cm × 15 cm × 18.5 cm) 備用。選取生長基本一致的半年生馬尾松幼苗移栽至盆內(nèi)，每盆3 株，先正常生長2 周后，用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)2 周后，再開始進(jìn)行不同外源鋁濃度處理。試驗(yàn)采用雙因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，因素1 設(shè)接菌（SL）和未接菌（NE）2 個(gè)處理，因素2 為鋁離子濃度，設(shè)4 個(gè)水平（pH 4.1 ± 0.1），分別為：0（無鋁SL0、NE0）、0.2（低鋁SL02、NE02）、0.4（中鋁SL04、NE04）和0.8（高鋁SL08、NE08）mmol·L-1。鋁以AlCl3形式加入Hoagland 完全營養(yǎng)液；用0.1 mol·L-1的稀HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)pH 值，為了保持鋁的活性，在營養(yǎng)液中同時(shí)加入0.5 mmol·L-1CaCl2，以避免鋁離子與溶液中其它離子的相互作用。每周澆處理液1 次。實(shí)驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。

處理60 d 后，每處理隨機(jī)取樣 20 株，輕輕抖掉根系表面石英砂，流水沖掉根部附著石英砂，超純水清洗，選取新鮮混合根樣用于抗氧化酶活性和MDA 含量測定。將馬尾松根先端0～20 mm 部分用刀片迅速切下，分別用于根先端亞細(xì)胞組分Al 含量測定和組織染色，取根尖0～4 mm 用于根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀測。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 抗氧化酶活性和MDA 含量測定 分別選取不同處理馬尾松幼苗根系鮮樣0.1 g，使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化物酶(POD) 、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛（MDA）含量。

1.3.2 根尖及亞細(xì)胞組分Al 含量的測定 根尖Al 含量的測定：分別稱取不同處理的烘干植物根樣0.3 g 左右于消解管中，向管內(nèi)加入10 mL 優(yōu)級(jí)純濃硝酸，不時(shí)振搖，直至無氣泡；蓋上管蓋，浸泡過夜12 h；打開管蓋，置于全自動(dòng)微波消解儀，按以下升溫梯度消解：80 ℃加熱40 min，130 ℃加熱60 min，165 ℃趕酸至管內(nèi)液體約1 mL。冷卻至室溫，用超純水定容至50 mL，待測。用等離子發(fā)射光譜儀 Prodigy XP 在波長308.21 nm 垂直觀測。

亞細(xì)胞組分Al 含量的測定：參考于姣妲等[21]的方法，采用差速離心法分離不同的細(xì)胞組分，依次得到細(xì)胞壁組分（F1）、細(xì)胞核組分（F2）、線粒體組分（F3）和以液泡為主的含核糖體的可溶組分（F4），全部操作在4 ℃下進(jìn)行。參照LY/T 1 270-1999《森林植物與森林枯枝落葉層全硅、鐵、鋁、鈣、鎂、鉀、鈉、磷、硫、錳、銅、鋅的測定》，采用分光光度法測定各組分Al 含量。

1.3.3 組織染色和顯微觀察 參考余燕[24]的方法采用氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）染色、3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidian，DAB）、熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA；Beyotime， Jiangsu， China） 和 Schiff’ s reagent（Sigma-Aldrich）試劑分別對根尖染色，并在智能型體視熒光顯微鏡（M205FA，德國萊卡）下觀察O2·-、H2O2、ROS 和MDA 的分布。

1.3.4 透射電鏡觀察 鋁處理第60 d，分別采集不同處理的新鮮根尖材料，迅速投進(jìn) 2.5%戊二醛（0.1 mol·L-1PBS 配制，pH 值7.0）的固定液里，抽氣使材料沉底，在4 ℃冰箱里固定24 h 后取出。再經(jīng)漂洗、再固定、梯度脫水后滲透包埋，樣品固化后使用萊卡 EMUC7 超薄切片儀修塊、切片（50～70 nm），3% 醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。使用透射電鏡 JEOL JEM-1 230（80KV）觀察并拍片。

以上數(shù)據(jù)分析處理及圖表在SPSS21.0 和Excel 表格中完成。

2 結(jié)果分析

2.1 不同外源Al3+水平對根系抗氧化酶活性和ROS 產(chǎn)生的影響

隨鋁濃度的升高，菌根和非菌根苗根系SOD、CAT 活性均呈總體上升趨勢，POD 活性則呈先降低后升高趨勢（圖1），且未接菌NE 組的抗氧化酶活性均高于接菌組，表明隨著鋁濃度的提升，根系抗氧化酶活性增強(qiáng)，并且，未接菌NE 組受到鋁的影響程度更大，接種SL在一定程度上緩解了鋁毒害。其中，未接菌NE 組在高鋁（0.8 mmol·L-1）水平時(shí)SOD 活性最高，達(dá)到201.14 U·g-1，且顯著高于其他處理（P＜0.05），其他各處理間差異不顯著。CAT 活性隨鋁濃度的提高呈上升趨勢，在未接菌NE 組中，高鋁和中鋁（0.4 mmol·L-1）水平下的CAT 活性與無鋁比差異顯著，低鋁（0.2 mmol·L-1）與無鋁比差異不顯著，接菌的SL組內(nèi)，高鋁和中鋁水平下CAT 活性與無鋁比差異顯著，低鋁與無鋁比差異不顯著。接菌和未接菌組的POD 活性均在低鋁水平時(shí)最低，但與無鋁比差異不顯著，中鋁與無鋁比差異不顯著，高鋁水平下的POD 活性顯著高于無鋁，且在同一鋁濃度下，接菌組的POD 均低于未接菌組。

圖1 不同Al3+水平對馬尾松根系抗氧化酶活性的影響Fig. 1 Effects on antioxidant enzyme activity in the root of Pinus massoniana seedlings at different aluminum levels

從組織染色（圖2）也可以看出，馬尾松未接菌NE 組根尖DAB、NBT 染色深度和DCHFDA 熒光強(qiáng)度均隨著鋁濃度的升高而逐漸加深，且各鋁處理也使得根尖膨大、變粗、彎曲，表現(xiàn)出明顯的鋁毒害癥狀。而接菌SL組的各項(xiàng)染色均不明顯，表明接菌后根尖的H2O2、O2·-及總活性氧ROS 積累的含量不高，明顯低于NE 組，且各鋁濃度間差異也不明顯。

圖2 不同Al3+水平對馬尾松根尖H2O2、O2·-和ROS 的影響Fig. 2 Effect on H2O2、O2·- and ROS production in the root tips of seedlings at different aluminum levels

2.2 不同外源Al3+水平對根系MDA 的影響

丙二醛（MDA）是表征植物細(xì)胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。從圖3a 可以看出，隨著外源鋁濃度的升高，未接菌NE 組的MDA 含量呈逐漸上升趨勢，在高鋁（0.8 mmol·L-1）水平時(shí)含量最高，達(dá)5.10 nmol·g-1。接菌SL組的MDA 含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，在低鋁（0.2 mmol·L-1）水平時(shí)MDA 含量最低，為3.50 nmol·g-1。并且與無鋁處理相比，從低鋁到高鋁，未接菌組MDA 的增幅均大于接菌組，表明接菌苗緩解了根系細(xì)胞的膜脂過氧化程度，降低了鋁對馬尾松幼苗根尖的毒害作用。從Schiff’s reagent 染色（圖3b）的根尖也可以看出，隨著鋁濃度的升高，未接菌NE 組的根尖染色均有不同程度的加深，表明鋁處理加劇了馬尾松幼苗根系膜脂過氧化程度。而接菌SL組的染色不明顯，外源Al3+對菌根的膜脂過氧化程度影響較小。

圖3 不同Al3+水平對菌根/非菌根幼苗根系MDA 含量的影響Fig. 3 Effect on MDA content in the root of inoculated and non inoculatedseedlings at different aluminum levels

2.3 不同外源Al3+水平下根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

在馬尾松未接菌NE 組中（圖4A～D），在無鋁和低鋁（0.2 mmol·L-1）水平下，根尖細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核、核仁、線粒體、液泡和都清晰可見，在無鋁處理中還觀察到淀粉粒，液泡較大且多；在低鋁時(shí)，液泡則變得少且小，線粒體數(shù)量明顯增加，且膨大變圓，核仁膨大。隨著外源Al3+濃度的增加，在中鋁（0.4 mmol·L-1）時(shí)，細(xì)胞壁明顯增厚，細(xì)胞內(nèi)液泡、細(xì)胞核等細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞空泡化現(xiàn)象十分嚴(yán)重，線粒體被擠壓堆積在一側(cè)，細(xì)胞核核質(zhì)散入細(xì)胞質(zhì)中。到高鋁（0.8 mmol·L-1）時(shí)，細(xì)胞間隙增大，局部胞間層出現(xiàn)空隙，除細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器遭到嚴(yán)重破壞外，由于大量鋁離子的進(jìn)入而出現(xiàn)大面積黑色斑塊。在接菌SL組（圖4E～H），無鋁處理的根尖邊緣細(xì)胞較小，由于菌絲侵入皮層細(xì)胞間，形成哈蒂氏網(wǎng)，因此胞間層較厚且顏色較深。低鋁時(shí)，根尖細(xì)胞內(nèi)液泡增多且小，細(xì)胞核、核仁、線粒體等均清晰可見，線粒體結(jié)構(gòu)完整。中鋁時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體膨大變圓，同時(shí)，由于鋁不斷向液泡轉(zhuǎn)運(yùn)，并在液泡中沉淀為黑色不溶顆粒，使液泡內(nèi)顏色變深，直至結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞質(zhì)顏色變深。細(xì)胞核遭到破壞固縮，核物質(zhì)凝聚，核膜不清晰，核仁膨大，有解體趨勢。高鋁時(shí)，液泡明顯增大增多，細(xì)胞壁局部遭到破壞，發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離，線粒體數(shù)量進(jìn)一步增加，細(xì)胞核膜被破壞，細(xì)胞核形狀不規(guī)則化，核仁解散消失，核內(nèi)染色質(zhì)凝集。

圖4 不同Al3+水平對菌根/非菌根幼苗根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effects on ultrastructure of inoculated and non inoculated seedlings at different aluminum levels

2.4 鋁在馬尾松根尖的積累及其亞細(xì)胞分布

如圖5 所示，在馬尾松幼苗根尖中，隨著外源Al3+濃度的提高，SL和NE 組的根尖鋁含量均呈上升趨勢，同一鋁濃度，SL組的根系鋁含量都高于NE 組。低鋁下，菌根苗根尖吸收的鋁含量顯著高于非菌根苗，高出33.44%，中鋁水平下，菌根苗根尖吸收的鋁含量也高于非菌根苗，但差異不顯著，到高鋁時(shí)，菌根苗吸收的鋁含量又顯著高于非菌根苗，高出38.55%。表明接種褐環(huán)乳牛肝菌能夠顯著提高馬尾松根系吸收鋁的能力。

圖5 不同Al3+水平下未接菌/接菌幼苗根尖鋁含量Fig. 5 Aluminium content in the root of inoculated and non-inoculated seedlings at different aluminum levels

從根尖亞細(xì)胞組分的鋁含量結(jié)果（表1） 可以看出，不同外源Al3+濃度處理下，鋁在馬尾松幼苗根尖的細(xì)胞壁組分(F1) 中含量最高，有鋁處理時(shí)，平均鋁含量在240.89～451.72 mg·kg-1之間，在線粒體組分(F3) 中分布最少，表明鋁在馬尾松幼苗根系內(nèi)主要分布在細(xì)胞壁，這可能是由于細(xì)胞壁對鋁的滯留作用強(qiáng)，而使得其在線粒體內(nèi)分布較少，而且由于菌根的吸附作用，使菌根苗的細(xì)胞壁吸收的鋁更多。隨Al3+濃度升高，鋁在細(xì)胞壁組分(F1) 、細(xì)胞核組分(F2)和線粒體組分(F3)中富集均呈上升趨勢，但在未接菌NE 組中，鋁在以液泡為主的可溶性組分(F4) 中的含量隨鋁濃度的升高反而減少，這可能是由于在高濃度的鋁處理下，NE 組的細(xì)胞核膜被破壞，核仁解體，染色質(zhì)溶解在胞質(zhì)中，在提取細(xì)胞核組分時(shí)，大部分的鋁被提取至細(xì)胞核(F2)組分，而使可溶性組分中的鋁含量下降。結(jié)果表明，鋁脅迫使得馬尾松幼苗根系將大部分鋁吸附在細(xì)胞壁上，隨著外源Al3+濃度的升高，馬尾松幼苗根系亞細(xì)胞組分對鋁的吸收總體呈增加趨勢，隨著鋁脅迫的加強(qiáng)，由于細(xì)胞器受損，亞細(xì)胞組分中鋁含量出現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。

表1 不同Al3+水平下馬尾松幼苗根尖Al 亞細(xì)胞組分分布Table 1 The distribution of Al in subcellular components in the root tips of Pinus massoniana seedlings at different aluminum levels

從鋁在根尖亞細(xì)胞組分的分布（圖6）可以看出，接菌和未接菌組在不同鋁濃度處理下，鋁的亞細(xì)胞分布的比例總體差異不大，其中，細(xì)胞壁(F1)吸附的鋁占據(jù)的比例最大，接菌SL組細(xì)胞壁(F1)所占比例在45.95%～59.98%之間，明顯高于未接菌NE 組。同時(shí)，SL組的細(xì)胞核組分(F2)和線粒體組分(F3)中所占比例則低于NE 組。SL組的可溶性組分所占比在10.25%～20.80%之間，NE 組所占比例8.77%～27.35%之間，差異較大，這可能與細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致的分布失調(diào)有很大關(guān)系。

圖6 鋁在根尖中的亞細(xì)胞分布Fig. 6 Subcellular distribution of aluminum in root tips

3 討論

3.1 不同外源Al3+水平下馬尾松根系的氧化應(yīng)激響應(yīng)

本研究中，隨著鋁脅迫的增強(qiáng)，馬尾松根系吸附的Al3+含量增加，根系的抗氧化酶活性增強(qiáng)，ROS 增加，并進(jìn)一步引起了MDA 含量的增加，膜脂過氧化程度加重，表明鋁對根細(xì)胞膜透性產(chǎn)生了不利影響，這是因?yàn)殇X具有分別與細(xì)胞壁和膜的羧基和磷酸基結(jié)合的能力[25]。植物在鋁脅迫下會(huì)引起線粒體和過氧化物酶體中活性氧（ROS）的產(chǎn)生[26]，由于抗氧化機(jī)制失衡，又進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞成分的氧化損傷[27-28]。鋁引起的ROS 系統(tǒng)失衡和細(xì)胞壁性質(zhì)的改變是造成鋁毒害的兩個(gè)內(nèi)在因素[23]。

Yamamoto 等[29]揭示了大量的鋁會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧（ROS）積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而在本研究中，接菌SL后，丙二醛含量和抗氧化酶活性相對較低，表明SL緩解了馬尾松中與ROS 相關(guān)的損傷，降低了鋁毒性，而接菌組SL和未接菌組NE 之間的差異不明顯，則是由于植物對逆境的生理響應(yīng)往往發(fā)生在逆境初期，經(jīng)過60 d 的處理，植物體內(nèi)的鋁含量和根系介質(zhì)中的鋁含量達(dá)到了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，植物通過前期的各種生理調(diào)節(jié)而逐漸適應(yīng)了現(xiàn)有的鋁濃度，形成新的生理穩(wěn)定狀態(tài)，因而兩組處理中的抗氧化酶活性和MDA 含量往往差異不顯著。褐環(huán)乳牛肝菌（SL）是一種廣泛存在于松林中的外生菌根真菌。大量研究表明SL是一種耐鋁真菌[30-31]，有利于鋁污染地區(qū)松苗的再生和種植。本項(xiàng)研究的結(jié)果完全證實(shí)了前人的發(fā)現(xiàn)，接種SL的馬尾松能夠更好地耐受鋁脅迫。

3.2 不同外源Al3+水平對馬尾松幼苗根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響

細(xì)胞壁是有害金屬進(jìn)入植物根系的第一道屏障[32]。Kopittke 等[33]發(fā)現(xiàn)，植物暴露在鋁環(huán)境下，鋁立即與根表面的細(xì)胞外壁結(jié)合，因此認(rèn)為鋁的主要病變是質(zhì)外體。本研究中，鋁在馬尾松幼苗根系細(xì)胞壁(F1) 中分布最多，這也證明鋁與細(xì)胞壁的結(jié)合是馬尾松耐鋁毒的重要機(jī)制之一。鋁離子主要與細(xì)胞壁的果膠基質(zhì)、帶負(fù)電荷的羧基及質(zhì)膜的外表面結(jié)合[34-35]，結(jié)合區(qū)主要位于根尖的鋁敏感根區(qū)，從而損害質(zhì)外體和共質(zhì)體的細(xì)胞功能。此外，由于細(xì)胞壁含有蛋白質(zhì)和多糖以及大量配位基團(tuán)(羥基、羧基、醛基、氨基等) ，容易吸附Al3+[21]。馬尾松根尖帶負(fù)電的細(xì)胞壁能夠大量吸附帶正電的Al3+。本研究通過細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察也清晰證實(shí)了Al 在細(xì)胞壁周圍聚集。在鋁脅迫下，鋁離子在細(xì)胞壁上強(qiáng)烈而快速的結(jié)合破壞了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，降低了細(xì)胞壁的延展性，從而抑制了根系的伸長。

除細(xì)胞壁組分F1 外，細(xì)胞核組分F2 的鋁含量最高，由根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可見，隨著鋁濃度升高，細(xì)胞核膜、核仁和染色質(zhì)都受到了明顯的破壞，細(xì)胞核內(nèi)核酸等大分子物質(zhì)外滲，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，細(xì)胞功能喪失。細(xì)胞核是細(xì)胞遺傳代謝的調(diào)控中心，鋁離子滲入細(xì)胞核內(nèi)，易與核酸大分子物質(zhì)結(jié)合，造成凝集，染色體斷裂畸變，核酸代謝失常，細(xì)胞核損傷必然嚴(yán)重影響植物正?；虻恼{(diào)控及細(xì)胞分化[21]。鋁對細(xì)胞核結(jié)構(gòu)影響的同時(shí)，也會(huì)對DNA 組成、模板活性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響[36]。鋁還通過增加雙螺旋上的剛性來限制DNA 的復(fù)制[36-38]。

本研究中，未接菌NE 組在高鋁水平下，核膜、質(zhì)膜、線粒體和液泡等的結(jié)構(gòu)和形態(tài)都發(fā)生明顯改變，植株表現(xiàn)出了明顯的受害癥狀。細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)因鋁離子的結(jié)合造成了破壞，其機(jī)制可能是由于鋁離子與生物膜有著強(qiáng)烈的親和力，可以導(dǎo)致膜的僵化變形，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，改變膜的流動(dòng)性，從而使膜功能散失。鋁還通過與脂類、糖類和蛋白質(zhì)作用而破壞膜的延展性，改變膜透性使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)向外滲漏作用加強(qiáng)，干擾細(xì)胞的各種調(diào)節(jié)過程，從而影響植株正常生長。由于生物膜受到破壞，大量線粒體腫脹，空泡增多，質(zhì)膜破壞。凋亡前的核結(jié)構(gòu)破壞被大多學(xué)者認(rèn)為是鋁脅迫的細(xì)胞特征，并認(rèn)為鋁信號(hào)遵循細(xì)胞死亡的線粒體途徑[36,39]。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸制造能量的主要場所，線粒體等細(xì)胞器的消失或破壞會(huì)造成根的呼吸受阻，呼吸效率降低，不利于根的生長和對水分及營養(yǎng)的吸收[40]，這也是本研究中馬尾松幼苗根系抗氧化酶活性增強(qiáng)和MDA 含量增加的原因。同時(shí)，其他生理代謝因受鋁脅迫發(fā)生的變化也可能是細(xì)胞內(nèi)部基因表達(dá)受到抑制或改變而產(chǎn)生的。在本研究中，NE 組在高濃度鋁水平下，由于細(xì)胞膜被破壞，無法阻隔Al3+侵入細(xì)胞核等細(xì)胞器，使植物明顯受到鋁毒害。而接種SL后，由于菌根對鋁的吸附作用，侵入細(xì)胞內(nèi)的鋁離子含量相對較低，從而使得SL組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核組分(F2)和線粒體組分(F3)中的鋁含量維持在較低水平，保護(hù)了亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，維持了細(xì)胞的基本功能，從而緩解了鋁毒性。同時(shí)，植物可以通過液泡的區(qū)室化作用將重金屬吸收在液泡中，降低重金屬毒害，從圖4G 的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可以明顯看出，接種SL在0.4 mmol·L-1鋁水平下，液泡中吸收了大量的Al3+，因而根尖細(xì)胞受到的鋁毒害作用明顯較未接菌組小，受害癥狀也更小。

4 結(jié)論

鋁離子被馬尾松幼苗根系吸收后，對根尖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了一系列的影響。Al3+與帶負(fù)電的細(xì)胞壁結(jié)合，并被大量吸附而沉積，破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能，降低了細(xì)胞壁的延展性，從而抑制了馬尾松幼苗根系的伸長。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Al3+與生物膜有著強(qiáng)烈的親和力，破壞了以蛋白質(zhì)為主要成分的細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，改變了膜的流動(dòng)性和透性，使細(xì)胞器物質(zhì)向外滲漏作用加強(qiáng)，干擾細(xì)胞的各種調(diào)節(jié)過程。核膜的破壞導(dǎo)致大量鋁離子滲入細(xì)胞核內(nèi)，Al3+與核酸大分子物質(zhì)結(jié)合，造成凝集，染色體斷裂畸變，核酸代謝失常。同時(shí)，Al3+使線粒體消失或破壞，造成根的呼吸受阻，在生理水平上造成根系抗氧化酶活性增強(qiáng)和MDA 含量增加。而接種SL后，由于菌根對鋁的吸附作用，侵入細(xì)胞內(nèi)的鋁離子含量相對較低，使細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核和線粒體組中的鋁含量維持在較低水平，并通過液泡的區(qū)室化作用將Al3+隔離在液泡中，保護(hù)了亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，維持了細(xì)胞的基本功能，從而緩解了鋁毒性。進(jìn)一步證明菌根可以通過吸附大量的鋁而達(dá)到減少根尖鋁毒害和提高植物耐鋁能力的目的，這很可能是馬尾松菌根苗的一個(gè)重要外部抗性機(jī)制。