黃紫薇,羅喜,王希,張伶俐

1.湖南中醫(yī)藥大學,湖南 長沙 410208; 2.湖南中醫(yī)藥大學附屬省直中醫(yī)院,湖南 株洲 412000;3.湖南中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬第一醫(yī)院,湖南省直中醫(yī)醫(yī)院,湖南 株洲 412000

繼發(fā)性閉經(secondary amenorrhea,SA)是指月經初潮后停經超過自身3個月經周期或超過6個月[1]。閉經的發(fā)病率約為5%,SA發(fā)病率約占閉經的95%[2]。隨著生活節(jié)奏加快,工作壓力增加,SA的發(fā)病率呈上升趨勢,嚴重影響女性健康,如低雌激素所致的骨質疏松癥和生殖道萎縮,長期雌激素刺激而無孕激素對抗的子宮內膜過度生長甚至子宮內膜癌,青春期無月經所致的精神心理障礙以及婚后不孕等[3-4]。下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸的神經內分泌功能失調是SA的主要病因[5],臨床上針對相應病變環(huán)節(jié)采用手術、激素以及全身治療等方式能取得一定的臨床療效[6]。但長期和周期性用藥導致的藥物副作用明顯和患者依從性差是亟待解決的問題。中醫(yī)藥治療SA具有辨證論治和整體調節(jié)的優(yōu)勢,且具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點。

川牛膝(CyathulaeRadix)是莧科植物川牛膝(Cyathulaofficinalis)的干燥塊根,主要產于四川省天全縣,性善下行(引血下行),功善逐瘀通經,是臨床治療經閉癥瘕的常用藥[7]。如《本草經疏》言：“血行則月水自通,血結自散”,本品逐瘀通經,故能“療婦人月水不通,血結”(《名醫(yī)別錄》)?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),川牛膝含有多糖、甾酮類、皂苷、阿魏酸等活性成分,具有調節(jié)血液黏稠度、改善微循環(huán)等藥理作用[8]。其所含的甾酮類化合物為天然植物雌激素,可有效治療女性生殖內分泌疾病[9]。但目前川牛膝治療SA的作用機制研究尚且缺乏,對川牛膝藥效成分、靶點及通路的相互作用關系尚不清楚。本研究基于網絡藥理學和分子對接技術探討川牛膝治療SA的可能作用機制,為川牛膝的臨床應用提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 川牛膝活性成分及作用靶點篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)檢索川牛膝的活性成分,藥物動力學參數設置為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18,從而篩選川牛膝的活性成分與作用靶點。

1.2 SA疾病靶點獲取以“Secondary Amenorrhea”為檢索詞,通過GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)獲取SA相關疾病靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選采用R軟件獲取川牛膝作用靶點與SA疾病靶點的交集靶點,將其作為川牛膝治療SA的關鍵靶點,并繪制韋恩圖。將關鍵靶點上傳至STRING數據庫(https：//www.string-db.org/),設置物種為Homo sapiens,置信度為0.9,隱藏游離節(jié)點,得到PPI網絡。然后,通過Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE插件進行聚類分析。

1.4 “藥物-活性成分-關鍵靶點”網絡構建及核心靶點篩選將川牛膝活性成分、關鍵靶點導入Cytoscape 3.8.2軟件,從而構建“藥物-活性成分-關鍵靶點”網絡。應用Network Analyzer插件對PPI網絡進行拓撲分析,以度值(degree)中位數的2倍、介度中心性(between centrality,BC)中位數和緊密中心性(closeness centrality,CC)中位數為條件篩選核心靶點。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析利用R軟件對川牛膝治療SA的關鍵靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析,以P<0.05為篩選條件,取各項結果的前10條數據繪制富集圖,并將其作為川牛膝治療SA的關鍵通路和功能。

1.6 分子對接通過Pubchem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取川牛膝活性成分的小分子結構,將其作為配體蛋白;通過PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)獲取核心靶點的PDB結構,將其作為受體蛋白;然后,通過AutoDock Tools 1.5.6軟件對受體和配體進行去水、加氫等處理,采用Autodock Vina軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 川牛膝活性成分及作用靶點基于TCMSP數據庫初步檢索獲得川牛膝化學成分41個,根據OB≥30%、DL≥0.18進行篩選,最終獲取4個活性成分,見表 1?；赥CMSP數據庫獲取川牛膝的作用靶點178個,其中槲皮素136個,β-谷甾醇26個,甜菜素15個,紅莧甾酮1個。

表1 川牛膝活性成分信息

2.2 川牛膝治療SA的關鍵靶點基于GeneCards數據庫獲取SA相關靶點1 366個,利用R軟件繪制川牛膝作用靶點和SA疾病靶點的韋恩圖,得到56個交集靶點,將其作為川牛膝治療SA的關鍵靶點,見圖1。

圖1 川牛膝作用靶點與SA相關靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡及川牛膝治療SA的核心靶點根據活性成分、關鍵靶點構建“藥物-活性成分-關鍵靶點”網絡,見圖2。由圖可知,川牛膝通過多成分、多靶點發(fā)揮治療作用,活性成分以槲皮素的作用最為顯著。將56個關鍵靶點導入STRING數據庫,獲取川牛膝治療SA的PPI網絡圖,見圖3。應用Cytoscape 3.8.2軟件的MCODE插件進行聚類分析,獲取3個子網絡,其中A有5個節(jié)點、10條邊,得分5.0;B有6個節(jié)點、9條邊,得分3.6;C有4個節(jié)點、5條邊,得分3.3,見圖4。應用Network Analyzer插件進行拓撲分析,根據“Betweenness Centrality”“Closeness Centrality”“Degree”值篩選得到9個核心靶點,包括絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase 1,MAPK1)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等,見表2。

圖2 “藥物-活性成分-關鍵靶點”網絡圖

圖3 川牛膝治療SA的PPI網絡圖

圖4 川牛膝治療SA的PPI聚類分析圖

表2 川牛膝治療SA的核心靶點信息

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R軟件對56個關鍵靶點進行GO和KEGG富集分析(P<0.05),結果顯示,GO功能分析得到 3 255 個生物過程(biological process,BP)、171個細胞組成(cellular component,CC)、323個分子功能(molecular function,MF)。其中,BP主要涉及細胞對化學壓力的反應、對類固醇激素的反應、上皮細胞增殖等,CC主要包括膜微區(qū)、質膜筏等,MF主要包括核受體活性、類固醇激素受體活性等。KEGG通路分析得到135條通路,主要涉及HIF-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗、雌激素信號通路等,見圖5。

圖5 GO功能和KEGG通路富集分析圖(前10位)

2.5 分子對接選擇活性成分槲皮素、β-谷甾醇分別與核心靶點AKT1、MAPK1進行分子對接,結果顯示結合能均小于-5 kcal·mol-1,活性成分與核心靶點通過形成氫鍵等分子作用力相互結合且結合活性較好,見圖6。

圖6 分子對接結合能熱圖

3 討論

SA歸屬于中醫(yī)學“女子不月”“血枯”等范疇[10]。《金匱要略·婦人雜病脈證并治》言：“因虛、積冷、結氣,為諸經水斷絕”,論述了“經水斷絕”的病機,不外虛實兩類;精血不足,血?？仗?因虛閉經者,補而通之;氣血瘀滯,血海阻隔,因實閉經者,瀉而通之;亦或虛實夾雜,補中有通,攻中有養(yǎng)[11]。中藥川牛膝始見于《仙授理傷續(xù)斷秘方》,是主產于四川天全的道地藥材和大宗藥材?！端拇ㄖ兴幹尽酚涊d：“川牛膝能活血祛瘀,催產,引血下行,用于血滯經閉,痛經,難產等[12]?！薄吨袊幍洹芬灿涊d：“川牛膝善于逐瘀通經,性善下行(引血下行)?！贝送?川牛膝能滋補肝腎,兼顧經血之源,是臨床用于婦科瘀滯經閉最為理想的藥物之一[13]。

川牛膝含有甾酮、多糖、皂苷等多種活性成分,藥理活性涉及調節(jié)血液黏稠度、改善循環(huán)、抑制腫瘤細胞生長、增強免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗生育和著床等方面[8]。川牛膝中的多糖成分具有促進血液循環(huán)的作用,可能是其發(fā)揮“逐瘀通經”作用的藥理基礎,作用機制可能與多糖成分降低全血和血漿黏稠度、增強紅細胞變形能力有關[14]。此外,川牛膝提取物能明顯增加細胞遷移,促進血管生成,觸發(fā)血管重構和分化的信號傳導,這可能是其促進月經來潮的機制之一[15]。川牛膝對生殖系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)在對子宮的興奮作用[16]。川牛膝提取物具有抗生育作用,主要分為抗著床和抗早孕兩個環(huán)節(jié)[17]。川牛膝含有多種甾酮類天然植物雌激素,如槲皮素等異黃酮類化合物與17β-雌二醇有相似的結構,具有弱雌激素作用,其對子宮內膜的刺激作用遠小于雌激素,既能發(fā)揮雌激素樣作用,又能降低子宮內膜癌和乳腺癌的風險[15]。此外,異黃酮具有降血糖活性[18],在胰島素抵抗的細胞模型中,蛻皮甾酮能增加胰島素敏感性[15],對于PCOS所致閉經,可在一定程度上緩解內分泌抵抗。

本研究發(fā)現(xiàn)川牛膝主要活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、紅莧甾酮、甜菜素,其中槲皮素作用靶點達136個,表明川牛膝促進月經來潮具有多成分、多靶點的作用特點。黃酮類化合物槲皮素通過抑制血小板聚集和5-羥色胺釋放從而調節(jié)血液循環(huán),同時具有雌激素效應。β-谷甾醇是一種植物甾醇,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗衰老等多種藥理活性[19]。下丘腦功能性閉經常由于精神刺激、體重驟降及過度運動等應激反應導致下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)分泌抑制,形成低GnRH狀態(tài)[2]。研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇結合在小鼠下丘腦GnRH神經元GT-17細胞膜上,通過影響雌激素受體信號通路抑制NF-κB上游因子降解,阻斷NF-κB信號通路激活,從而緩解GnRH分泌減少的狀況[20]。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)川牛膝治療SA主要涉及受體配體活性、信號轉導受體激活劑、RNA聚合酶Ⅱ特異的DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合等生物過程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),川牛膝治療SA的通路主要包括HIF-1信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、內分泌抵抗和雌激素信號通路等。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是具有螺旋-環(huán)-螺旋結構的轉錄因子,由氧調節(jié)亞基α和組成型表達的β亞基組成,能夠誘導血管形成蛋白表達。HIF-lα是低氧反應的重要轉錄因子。Critchley等[21]發(fā)現(xiàn)女性月經周期分泌中期、晚期及月經期的子宮內膜HIF-1αmRNA表達量顯著增加。周芳[22]研究發(fā)現(xiàn)HIF-lα在低氧狀態(tài)和月經出血非缺氧狀態(tài)均被激活,子宮內膜崩解的關鍵時期環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX2)和HIF-1αmRNA表達均增加。張玲[23]研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過受體抑制HIF-1α降解,激活HIF-1α信號通路,啟動下游靶基因如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)合成,促進異位子宮內膜細胞的粘附、侵襲和血管生成。

SA以持續(xù)性月經停閉為特征[24],治療重點在于順應月經周期中陰陽轉化和氣血盈虧的變化規(guī)律,調控腎-天癸-沖任-胞宮軸,從而恢復正常的月經周期[25]。腎虛血瘀型SA是臨床常見證型,李靈芝教授認為SA以腎虛為本、血瘀為標,治療當以祛瘀為先,繼以補腎[26]?！梆鲅混?新血不生”,瘀血阻滯于經絡,阻礙氣血的運行則月經停閉。川牛膝苦泄甘緩,長于活血通經,善引血下行,常與當歸、桃仁、紅花等同用治療血瘀經閉[27]?！睹t(yī)別錄》記載川牛膝可治療“婦人月水不通、血結、益精、利陰氣、止發(fā)白?！蹦I為先天之本,主藏精納氣,肝主藏血,肝腎同源;川牛膝歸肝、腎兩經,可以調補肝腎,調理內分泌,發(fā)揮雌激素樣作用,改善子宮狀態(tài),增加子宮血流量[28],提高人體免疫力,延緩衰老,符合中醫(yī)學的整體觀念[29]。

本文初步探索了川牛膝治療SA的作用機制,挖掘槲皮素、β-谷甾醇等4種活性成分,膜筏、細胞對化學應激的反應及核受體活性等過程,HIF-1信號通路、雌激素信號通路、內分泌抵抗等通路。但川牛膝的產地豐富、品種多樣,他們的化學成分可能存在差異,其具體機制仍需進一步驗證。此外,網絡藥理學方法在不斷完善,各數據庫之間存在數據差異,提高數據庫的共享性、精度和準確度也是未來的研究方向之一。