韓 榮，朱建明，趙華林

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.海南志勤畜牧業(yè)技術(shù)研究院，海南 三亞 572000）

奶牛“兩病”是指布魯氏菌病和牛結(jié)核病，兩者均為我國二類動(dòng)物疫病[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B 類動(dòng)物疫病。布魯氏菌病（布?。┦且环N由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病，也被稱為“馬耳他熱”或“波浪熱”[2]。它在臨床上的特征是母畜發(fā)生流產(chǎn)和不孕，而公畜則發(fā)生睪丸炎、附睪炎和關(guān)節(jié)炎[3]。牛結(jié)核病是一種慢性傳染病，由牛結(jié)核桿菌引起，也會(huì)在人畜之間傳播[4]，其臨床特點(diǎn)是產(chǎn)乳量迅速下降，懷孕母?？赡馨l(fā)生流產(chǎn)，體溫可上升到40 ℃以上，呈稽留熱、呼吸極度困難，最后窒息而死[5]。海南省目前沒有發(fā)現(xiàn)牛種布魯氏菌，主要是羊種3 型和豬種3 型[6-7]，未發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核病[8]。牛布病診斷方法主要是通過血清學(xué)技術(shù)，虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）進(jìn)行初次篩查、試管凝集試驗(yàn)（SAT）做確診；牛結(jié)核病檢測(cè)方法主要為免疫學(xué)檢測(cè)，即牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（PDD）。

隨著海南建設(shè)“自由貿(mào)易港”和“國際旅游島”的快速發(fā)展，牛肉及牛奶制品需求量猛增，保證畜產(chǎn)品安全和高質(zhì)是海南畜牧業(yè)在新時(shí)代面臨的緊迫要求。同時(shí)海南省屬我國的無規(guī)定動(dòng)物疫病區(qū)重點(diǎn)建設(shè)省份之一[9-10]，防控和凈化奶牛場(chǎng)“兩病”是建設(shè)“無疫區(qū)”的重點(diǎn)內(nèi)容。持續(xù)開展奶牛場(chǎng)“兩病”監(jiān)測(cè)對(duì)保證海南奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全具有重大意義。加大對(duì)奶牛主要疫病的凈化，將為海南畜牧業(yè)建設(shè)動(dòng)物多病種無疫區(qū)提供基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 牛場(chǎng)背景

海南省某牛場(chǎng)于2017 年從澳大利亞引進(jìn)娟珊牛500 頭。通過自繁自育，現(xiàn)有育成牛229 頭、生產(chǎn)母牛168頭、犢牛90頭，均未免疫接種牛布魯氏菌病、牛結(jié)核病疫苗。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

布魯氏菌病虎紅平板凝集抗原、布魯氏菌病陽性血清、布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗原、提純牛型結(jié)核菌素、虎紅反應(yīng)板，均購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司。

1.2.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱、微量加樣器、游標(biāo)卡尺、5 mL注射器、微量振蕩器、冰箱、離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方案

1.3.1 布病檢測(cè)

采集奶牛血樣，按照國標(biāo)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646-2018）[11]操作先進(jìn)行RBT 初次篩查，然后將初篩為陽性個(gè)體再進(jìn)行SAT 復(fù)檢。確診為布病陽性的奶牛為陽性個(gè)體；陽性個(gè)體所在的場(chǎng)群為陽性污染場(chǎng)群。對(duì)陽性場(chǎng)開展全群采樣檢測(cè)，撲殺陽性個(gè)體，隔離飼養(yǎng)其余健康牛，以后每月進(jìn)行一次隨機(jī)采樣檢測(cè)；連續(xù)三個(gè)月未檢測(cè)到布病陽性后，將該場(chǎng)設(shè)定為假設(shè)健康場(chǎng)群，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(cè)。

1.3.2 牛結(jié)核檢測(cè)

按照國標(biāo)《動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645-2020）[12]進(jìn)行操作，通過PDD 檢測(cè)牛結(jié)核病，對(duì)初檢陽性的牛60 d后復(fù)檢，對(duì)復(fù)檢陽性的牛進(jìn)行撲殺與無害化處理。

1.4 樣品采集

常規(guī)消毒后，采集6月齡的母牛與產(chǎn)后半月至1個(gè)月的犢牛靜脈血樣2～5 mL。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）

（1）提前1 h從冰箱取出被檢血清、布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清和虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)抗原，平衡到和室溫一致；

（2）將30 uL 被檢血清和30 uL 虎紅抗原加在一次性虎紅反應(yīng)板內(nèi)，使用滅菌槍頭快速混勻，4 min內(nèi)讀取結(jié)果；

（3）每批次試驗(yàn)同時(shí)用陰性、陽性血清各一份作對(duì)照；

（4）結(jié)果判定：在標(biāo)準(zhǔn)陰性血清不出現(xiàn)凝集，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清出現(xiàn)凝集時(shí)，試驗(yàn)成立，方可對(duì)受檢血清進(jìn)行判定。出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)判定為陽性，記為“+”，無凝集現(xiàn)象且反應(yīng)混合液呈均勻粉紅色者判定為陰性，記為“-”。

1.5.2 試管凝集試驗(yàn)（SAT）

（1）提前1 h從冰箱取出被檢血清，布魯氏菌病陽性血清和試管凝集抗原，平衡到和室溫一致；

（2）取6 支試管放于試管架上，依次編號(hào)，1 號(hào)管為血清對(duì)照管，2～5 號(hào)為試驗(yàn)管，6 號(hào)為抗原對(duì)照管；

（3）血清稀釋：1號(hào)管加2.3 mL生理鹽水；2號(hào)管不加，第3～6號(hào)管各加入0.5 mL生理鹽水。取受檢血清0.2 mL，加人1號(hào)管內(nèi)，并混合均勻；從1號(hào)管中吸0.5 mL 混合液加入2號(hào)管并充分混勻，以此類推，做倍比稀釋，到第5號(hào)管棄去混勻液0.5 mL；

（4）試管凝集抗原做10倍稀釋：即1 mL抗原加9 mL生理鹽水混勻；從2號(hào)管開始各加入0.5 mL，加入抗原之后血清的最終稀釋倍數(shù)為：從2號(hào)管開始為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400；

（5）標(biāo)準(zhǔn)比濁管的配置:取5 支試管依次編號(hào)；取2 mL 生理鹽水和（4）中抗原稀釋液2 mL 加入燒杯中混勻；1號(hào)管加1 mL生理鹽水，2號(hào)管加0.25 mL抗原稀釋液和0.75 mL生理鹽水，3號(hào)管加0.5 mL抗原稀釋液和0.5 mL 生理鹽水，4 號(hào)管加0.75 mL 抗原稀釋液和0.25 mL 生理鹽水，5 號(hào)管加1 mL 抗原稀釋液；

（6）將加樣后的試管充分搖勻置37 ℃培養(yǎng)箱20～24 h，取出室溫下放置1 h，檢查并記錄結(jié)果；

（7）結(jié)果判斷：1號(hào)血清對(duì)照管清亮無沉淀，6號(hào)抗原對(duì)照管均勻渾濁，在兩種對(duì)照管都成立的情況下將試驗(yàn)管與標(biāo)準(zhǔn)比濁管作比較，如果試驗(yàn)管透明度與1號(hào)比濁管相近，菌體呈傘狀沉淀或塊狀沉淀，標(biāo)記為“++++”呈100%凝集；試驗(yàn)管透明度與2號(hào)比濁管相近，菌體呈傘狀沉淀，標(biāo)記為“+++”呈75%凝集；試驗(yàn)管與3號(hào)比濁管相近，菌體呈較薄傘狀沉淀，標(biāo)記為“++”呈50%凝集；試驗(yàn)管與4號(hào)比濁管相近，管底有不明顯的傘狀沉淀，標(biāo)記為“+”呈25%凝集；如果試驗(yàn)管不透明無沉淀，標(biāo)記為“-”呈陰性。

1.5.3 牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（PDD）

（1）提前1 d在牛頸中部上1/3處剪毛或剃毛，三月齡以內(nèi)的犢牛在肩胛部作試驗(yàn)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部中央皮皺厚度，作好詳細(xì)記錄；

（2）用生理鹽水稀釋每毫升含10萬國際單位后使用。不論牛只大小，一律皮內(nèi)注射0.1 mL；

（3）注射后72 h 后，觀察局部有無熱痛腫脹等炎性反應(yīng)，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量術(shù)部皮皺厚度，作好詳細(xì)記錄；

（4）凡判斷為可疑反應(yīng)的牛，即刻在另一頸部以同一批結(jié)核菌素進(jìn)行第二次注射，再經(jīng)72 h后觀察反應(yīng)；

（5）判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性反應(yīng)，局部有炎性反應(yīng)，皮厚差等于或大于4.0 mm；可疑反應(yīng)，局部炎性反應(yīng)較輕，皮厚差在2.1～3.9 mm；陰性反應(yīng)，無炎性反應(yīng)，皮厚差在2.00 mm以下。

2 結(jié)果與分析

2.1 布病檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)

2020-2023 年采集牛血樣共2 104 份。其中，RBT 初篩陽性73 份，平均個(gè)體陽性率為3.5%；SAT試驗(yàn)確診陽性0份，陽性率為0，見表1。表明該奶牛場(chǎng)未檢出布魯氏菌病。

表1 奶牛場(chǎng)布病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 時(shí)間分布

如表1 所示，該奶牛場(chǎng)的RBT 陽性率2020 年為5.7%，2021 年為3.3%，2022 年為2.3%，2023 年為1.8%，呈逐年下降趨勢(shì)，表明該牛場(chǎng)布病凈化工作效果顯著。

根據(jù)布魯氏菌病初檢結(jié)果，一個(gè)月后重新采集73頭RBT陽性奶牛的血清，再次進(jìn)行布魯氏菌病RBT 初篩與SAT 確診。結(jié)果顯示，RBT 陽性依然為73 頭，SAT 確診陽性依然為0 份。綜上表明該奶牛場(chǎng)為未患布魯氏菌病牛場(chǎng)。

2.2 牛結(jié)核檢測(cè)結(jié)果

2020—2023 年，總計(jì)對(duì)2 063 頭奶牛進(jìn)行PDD 試驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果顯示，疑似PDD 陽性奶牛總計(jì)80頭，見表2。對(duì)初檢疑似PDD 陽性的80 頭奶牛60 d 后進(jìn)行PDD 復(fù)檢，結(jié)果顯示，陽性頭數(shù)均為0，表明該牛場(chǎng)為未患牛結(jié)核病牛場(chǎng)。

3 討 論

目前海南省對(duì)奶?！皟刹　眱艋裱皺z測(cè)-撲殺-監(jiān)測(cè)-凈化”原則。從2020-2023年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，海南該牛場(chǎng)未發(fā)現(xiàn)“兩病”病例，達(dá)到了凈化標(biāo)準(zhǔn)，表明該牛場(chǎng)已初步建成奶牛“兩病”凈化場(chǎng)。

在凈化監(jiān)測(cè)中，RBT 檢測(cè)初篩的陽性率為3.5%，而SAT 檢測(cè)確診的陽性率為0%，此情況與劉坤洋等[11]研究報(bào)道相一致。本研究顯示，RBT檢測(cè)很容易受到特異性抗體的影響呈假陽性。因此在檢測(cè)中應(yīng)當(dāng)保證樣品新鮮，避免樣品反復(fù)凍融和溶血等因素的干擾。而SAT具有較高的特異性和敏感性[12]，能更準(zhǔn)確的檢測(cè)出布病。PDD 疑似陽性率為3.8%，復(fù)檢陽性率為0%，此情況與李文文和雷程紅等[13-14]研究報(bào)道相一致。本研究表明，感染其他分支桿菌而致敏的動(dòng)物沒有特異性，因此不能判斷病情，同時(shí)因病情嚴(yán)重而導(dǎo)致免疫反應(yīng)低下的動(dòng)物也易出現(xiàn)假陽性。此外，提純結(jié)核菌素質(zhì)量、劑量、判定標(biāo)準(zhǔn)及操作等因素的影響也易產(chǎn)生誤差[15]。如荷蘭英特威的結(jié)核菌素，每頭牛的劑量為3 000IU[16]，而國產(chǎn)為10 000IU[17]，國際獸疫局規(guī)定為3 250IU，不低于2 000IU[18]。國內(nèi)結(jié)核菌素檢疫劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國際標(biāo)準(zhǔn)劑量，這就導(dǎo)致了結(jié)核病陽性和疑似病例的數(shù)量增加。因此，本研究嚴(yán)格按照說明書劑量檢疫，對(duì)于初檢判為疑似反應(yīng)的80頭奶牛距上次檢疫60 d后復(fù)檢，結(jié)果陽性0頭，陽性率為0，由此可見，該牛場(chǎng)未患有牛結(jié)核病。

4 結(jié) 論

海南該奶牛場(chǎng)2020-2023年連續(xù)4年未檢出布魯氏菌病和牛結(jié)核病，凈化工作成效明顯，表明該奶牛場(chǎng)已進(jìn)入凈化維持階段，已建成海南省首個(gè)奶?！皟刹　眱艋瘓?chǎng)。針對(duì)海南奶牛場(chǎng)的實(shí)際氣候環(huán)境和飼養(yǎng)管理狀況，該牛場(chǎng)將繼續(xù)提高疫病防控執(zhí)行力度，每年至少進(jìn)行兩次針對(duì)奶牛布魯氏菌病和牛結(jié)核病的有效檢測(cè)，保障當(dāng)?shù)啬膛I(yè)穩(wěn)定發(fā)展。