鄭啟銘，梁纖纖，李曉卓，李 月，劉文鍇，韓翔舒，馮繼紅，翟少華*，夏 俊*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830000；2.新疆草食動(dòng)物新藥研究與創(chuàng)制自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省部共建），烏魯木齊 830000；5.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832061；6.新疆維吾爾自治區(qū)呼圖壁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆 昌吉 831100）

細(xì)菌性疾病引起的犢牛腹瀉，其多數(shù)由大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌引起[1]，其中大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌。犢牛大腸桿菌病又稱犢牛白痢，在臨床上是一種常見(jiàn)疾病，一年四季均可發(fā)生，一般在氣溫多變的冬末春初發(fā)病率較高。感染途徑主要是通過(guò)消化道，子宮和臍帶。該病一旦發(fā)生，病死率很高，有時(shí)可達(dá)100%，牛羊發(fā)病時(shí)呈地方流行性[1]。犢牛感染后主要臨床表現(xiàn)為體溫升高、腹瀉、脫水等急性腸炎癥狀。腹瀉糞便的狀態(tài)多變，有腐臭味，且會(huì)黏附在犢牛尾部和后肢。病牛精神沉郁，繼而發(fā)生脫水和酸中毒[2]。輕度感染的犢?？赡茏杂?，嚴(yán)重感染的犢牛如果不及時(shí)治療，幾天內(nèi)就會(huì)死亡。

大腸桿菌根據(jù)致病性分型為腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌（STEC）、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、侵襲性大腸埃希菌（EIEC）等[3]。各種致病類型的大腸桿菌中的毒素和黏附素等毒力因子是導(dǎo)致牛發(fā)生腹瀉等癥狀的主要原因。黏附素性菌毛是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌特有的一類菌毛，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見(jiàn)[4]。本研究對(duì)新疆昌吉地區(qū)某牛場(chǎng)腹瀉犢牛的分離菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)、耐藥性分析，為該地區(qū)牛場(chǎng)治療犢牛腹瀉提供用藥依據(jù)，同時(shí)為該地區(qū)致病性大腸桿菌的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

采自新疆昌吉市某牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品（包括稀便、血便），共30份。

1.1.2 主要試劑

BHI 液體培養(yǎng)基、馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、100 μL 移液器、10 μL 移液器、藥敏紙片。50×TAE 電泳液按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配置，1×TAE：用規(guī)格100 mL 的量筒稱取20 mL 的50×TAE，再加入980 mL 的蒸餾水混勻，使其稀釋到1×TAE備用。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明雄鼠10 只，35 日齡，體重大致在22～25 g，購(gòu)自新疆疾病預(yù)防與控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離

將每份糞便樣品加入5 mL BHI 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，采用固體平板劃線法將菌液接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取粉紅色單菌落接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行純化，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h并觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.2 革蘭氏染色及鏡檢

移液器取適量純化培養(yǎng)后的細(xì)菌培養(yǎng)液，依據(jù)革蘭氏染色試劑盒的染色步驟進(jìn)行革蘭氏染色，染色完成后經(jīng)顯微鏡鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.2.3 細(xì)菌及毒力基因鑒定

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物合成后按照所提供的引物合成單進(jìn)行各引物稀釋，將上、下游引物稀釋成10 μM濃度，稀釋完后將其置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 引物列表

1.2.3.2 PCR 擴(kuò)增 使用大腸桿菌鑒定引物用于PCR 鑒定，經(jīng)鑒定為大腸桿菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物進(jìn)行PCR 鑒定。采取25 μL 的常規(guī)反應(yīng)體系，上、下游引物各1 μL，2×Taq MasterMix12.5 μL，模板1 μL，水9.5 μL，瞬離后混勻置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，之后94 ℃循環(huán)變性30 s，退火溫度為58 ℃，復(fù)性20 s，72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，最后于4 ℃保存。

1.2.4 致病性試驗(yàn)

10 只小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組及對(duì)照組，每組5 只。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射分離菌株菌液，每只0.2 mL；對(duì)照組小鼠腹腔注射無(wú)菌PBS，每只0.2 mL。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用K-B 紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)。用移液器吸取200 μL 細(xì)菌培養(yǎng)液，之后均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，待吸收完全后，將藥敏片等距放置于培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后判定其結(jié)果，藥敏結(jié)果判定按CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

細(xì)菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊、表面光滑的圓形或橢圓形粉紅色菌落，見(jiàn)圖1。革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)存在的紅色革蘭氏陰性短桿菌，見(jiàn)圖2。

圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖片（100×）

2.2 細(xì)菌及毒力基因鑒定

進(jìn)行大腸桿菌及毒力基因的PCR檢測(cè)后，結(jié)果顯示有效擴(kuò)增出大小為200 bp和543 bp的目的條帶，見(jiàn)圖3、圖4，分離菌株為攜帶毒力基因K99的大腸桿菌。

圖3 細(xì)菌大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

圖4 細(xì)菌毒力基因PCR鑒定結(jié)果

2.3 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠腹腔注射菌液4 h后，陸續(xù)開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、排黏液性糞便、被毛粗亂等癥狀，12 h后開(kāi)始陸續(xù)死亡。對(duì)照組5只全程健康狀況良好，無(wú)死亡。

2.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該分離株對(duì)多黏菌素B 中介；對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥，見(jiàn)表2、圖5、圖6。

圖5 藥敏試驗(yàn)1

圖6 藥敏試驗(yàn)2

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

犢牛腹瀉是基層牛場(chǎng)常見(jiàn)的流行病，多發(fā)于冬末春初等氣溫多變的季節(jié)。根據(jù)犢牛腹瀉的發(fā)病原因及發(fā)病特點(diǎn)，可將其分為消化不良腹瀉與傳染性腹瀉。消化不良性腹瀉常呈現(xiàn)散發(fā)性，一般出現(xiàn)一過(guò)性腹瀉，對(duì)牛場(chǎng)養(yǎng)殖不會(huì)造成較大的損失。傳染性腹瀉又可分為病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、寄生蟲(chóng)性腹瀉以及混合感染性腹瀉。其中較常引起細(xì)菌性腹瀉的病菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌[5]。這些致病菌中，大腸桿菌為引起犢牛腹瀉最主要的致病菌。以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌最為常見(jiàn)，導(dǎo)致?tīng)倥０l(fā)生腹瀉的原因主要為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌所攜帶的毒素及黏附素基因，主要包括K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）及F41，其中以K99 和F41 最為常見(jiàn)[6]。此次在牛源腹瀉糞樣中檢出的E.coli攜帶的毒力因子為K99，通過(guò)致病性試驗(yàn)結(jié)果表明此次分離菌株有致病性。

對(duì)本次分離出的K99 菌毛大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示該分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物均耐藥。以上十七種抗菌藥物涉及八類，但均顯示不同程度的耐藥。該分離菌株只對(duì)多黏菌素b 中介。楊艷麗[7]等研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛源E.coli 對(duì)喹諾酮類藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。許淑蕓[8]等的研究顯示石河子地區(qū)牛源E.coli 對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物頭孢唑林、阿莫西林、青霉素、頭孢他定等抗生素耐藥性較高。郭慶勇[9]等的研究顯示伊犁某牛場(chǎng)的糞源大腸桿菌不同生長(zhǎng)階段均對(duì)氨基糖苷類及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。本試驗(yàn)檢測(cè)分離的E.coli 也對(duì)各類抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，與三人的研究結(jié)果基本一致，同時(shí)對(duì)四環(huán)素類、林可酰胺類及大環(huán)內(nèi)酯類同樣存在耐藥性，這一現(xiàn)象可能是由于該地區(qū)牛場(chǎng)使用這些抗菌藥物較多。本次分離菌株的耐藥性試驗(yàn)可為該牛場(chǎng)犢牛細(xì)菌性腹瀉防控工作提供用藥選擇依據(jù)，并為制定合理的抗菌治療方案提供參考。

綜上所述，在防控細(xì)菌流行病時(shí)，由于抗菌藥物濫用易導(dǎo)致致病菌耐藥性增加從而給牛場(chǎng)防控疫病的工作開(kāi)展造成困難。在治療細(xì)菌流行病時(shí)，應(yīng)根據(jù)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇有效抗菌藥物[10]，并且制定合理的治療方案，杜絕無(wú)理論依據(jù)和臨床指癥的抗菌治療。目前市面上已經(jīng)有效果較好的大腸桿菌疫苗及K99滅活苗，在防控大腸桿菌腹瀉病時(shí)可選擇滅活苗，有效做到未病先防。

4 結(jié) 論

本次從該牛場(chǎng)分離到的攜帶K99 毒力基因的大腸桿菌菌株，對(duì)小鼠有一定的致病力，并且藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素等多種抗菌藥物耐藥。提示該地區(qū)導(dǎo)致?tīng)倥８篂a的大腸桿菌耐藥嚴(yán)重，防治過(guò)程中應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選藥，并規(guī)范使用。此外，也提示大腸桿菌疫苗的開(kāi)發(fā)或引進(jìn)作為防控犢牛大腸桿菌病的另一個(gè)途徑應(yīng)該得到重視。