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        牛腸道大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析

        2024-02-06 09:58:58鄭啟銘梁纖纖李曉卓劉文鍇韓翔舒馮繼紅翟少華
        草食家畜 2024年1期
        關(guān)鍵詞:牛場(chǎng)毒力致病性

        鄭啟銘,梁纖纖,李曉卓,李 月,劉文鍇,韓翔舒,馮繼紅,翟少華*,夏 俊*

        (1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830000;2.新疆草食動(dòng)物新藥研究與創(chuàng)制自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830000;3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心,烏魯木齊 830000;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(省部共建),烏魯木齊 830000;5.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832061;6.新疆維吾爾自治區(qū)呼圖壁縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,新疆 昌吉 831100)

        細(xì)菌性疾病引起的犢牛腹瀉,其多數(shù)由大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌引起[1],其中大腸桿菌是引起腹瀉的主要病原菌。犢牛大腸桿菌病又稱(chēng)犢牛白痢,在臨床上是一種常見(jiàn)疾病,一年四季均可發(fā)生,一般在氣溫多變的冬末春初發(fā)病率較高。感染途徑主要是通過(guò)消化道,子宮和臍帶。該病一旦發(fā)生,病死率很高,有時(shí)可達(dá)100%,牛羊發(fā)病時(shí)呈地方流行性[1]。犢牛感染后主要臨床表現(xiàn)為體溫升高、腹瀉、脫水等急性腸炎癥狀。腹瀉糞便的狀態(tài)多變,有腐臭味,且會(huì)黏附在犢牛尾部和后肢。病牛精神沉郁,繼而發(fā)生脫水和酸中毒[2]。輕度感染的犢??赡茏杂?,嚴(yán)重感染的犢牛如果不及時(shí)治療,幾天內(nèi)就會(huì)死亡。

        大腸桿菌根據(jù)致病性分型為腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)、腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)等[3]。各種致病類(lèi)型的大腸桿菌中的毒素和黏附素等毒力因子是導(dǎo)致牛發(fā)生腹瀉等癥狀的主要原因。黏附素性菌毛是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌特有的一類(lèi)菌毛,主要包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)及F41,其中以K99 和F41 最為常見(jiàn)[4]。本研究對(duì)新疆昌吉地區(qū)某牛場(chǎng)腹瀉犢牛的分離菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)、耐藥性分析,為該地區(qū)牛場(chǎng)治療犢牛腹瀉提供用藥依據(jù),同時(shí)為該地區(qū)致病性大腸桿菌的進(jìn)一步研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 樣品來(lái)源

        采自新疆昌吉市某牛場(chǎng)腹瀉犢牛糞便樣品(包括稀便、血便),共30份。

        1.1.2 主要試劑

        BHI 液體培養(yǎng)基、馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒、DL2000 核酸Marker、200 μL 移液器、100 μL 移液器、10 μL 移液器、藥敏紙片。50×TAE 電泳液按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配置,1×TAE:用規(guī)格100 mL 的量筒稱(chēng)取20 mL 的50×TAE,再加入980 mL 的蒸餾水混勻,使其稀釋到1×TAE備用。

        1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

        清潔級(jí)昆明雄鼠10 只,35 日齡,體重大致在22~25 g,購(gòu)自新疆疾病預(yù)防與控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)菌分離

        將每份糞便樣品加入5 mL BHI 液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后,采用固體平板劃線法將菌液接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中,經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后,挑取粉紅色單菌落接種于5 mL BHI液體培養(yǎng)基進(jìn)行純化,置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18 h并觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

        1.2.2 革蘭氏染色及鏡檢

        移液器取適量純化培養(yǎng)后的細(xì)菌培養(yǎng)液,依據(jù)革蘭氏染色試劑盒的染色步驟進(jìn)行革蘭氏染色,染色完成后經(jīng)顯微鏡鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

        1.2.3 細(xì)菌及毒力基因鑒定

        1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物合成后按照所提供的引物合成單進(jìn)行各引物稀釋?zhuān)瑢⑸?、下游引物稀釋?0 μM濃度,稀釋完后將其置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩R镄蛄幸?jiàn)表1。

        表1 引物列表

        1.2.3.2 PCR 擴(kuò)增 使用大腸桿菌鑒定引物用于PCR 鑒定,經(jīng)鑒定為大腸桿菌后再使用K88、K99、F41 毒力基因引物進(jìn)行PCR 鑒定。采取25 μL 的常規(guī)反應(yīng)體系,上、下游引物各1 μL,2×Taq MasterMix12.5 μL,模板1 μL,水9.5 μL,瞬離后混勻置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,之后94 ℃循環(huán)變性30 s,退火溫度為58 ℃,復(fù)性20 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸5 min,最后于4 ℃保存。

        1.2.4 致病性試驗(yàn)

        10 只小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組及對(duì)照組,每組5 只。試驗(yàn)組小鼠腹腔注射分離菌株菌液,每只0.2 mL;對(duì)照組小鼠腹腔注射無(wú)菌PBS,每只0.2 mL。

        1.2.5 藥敏試驗(yàn)

        采用K-B 紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感試驗(yàn)。用移液器吸取200 μL 細(xì)菌培養(yǎng)液,之后均勻涂布于馬丁肉湯瓊脂培養(yǎng)基上,待吸收完全后,將藥敏片等距放置于培養(yǎng)基上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后判定其結(jié)果,藥敏結(jié)果判定按CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)菌分離

        細(xì)菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣整齊、表面光滑的圓形或橢圓形粉紅色菌落,見(jiàn)圖1。革蘭氏染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)存在的紅色革蘭氏陰性短桿菌,見(jiàn)圖2。

        圖1 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

        圖2 革蘭氏染色鏡檢圖片(100×)

        2.2 細(xì)菌及毒力基因鑒定

        進(jìn)行大腸桿菌及毒力基因的PCR檢測(cè)后,結(jié)果顯示有效擴(kuò)增出大小為200 bp和543 bp的目的條帶,見(jiàn)圖3、圖4,分離菌株為攜帶毒力基因K99的大腸桿菌。

        圖3 細(xì)菌大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

        圖4 細(xì)菌毒力基因PCR鑒定結(jié)果

        2.3 致病性試驗(yàn)

        試驗(yàn)組小鼠腹腔注射菌液4 h后,陸續(xù)開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、排黏液性糞便、被毛粗亂等癥狀,12 h后開(kāi)始陸續(xù)死亡。對(duì)照組5只全程健康狀況良好,無(wú)死亡。

        2.4 藥敏試驗(yàn)

        藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,該分離株對(duì)多黏菌素B 中介;對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物耐藥,見(jiàn)表2、圖5、圖6。

        圖5 藥敏試驗(yàn)1

        圖6 藥敏試驗(yàn)2

        表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

        3 討 論

        犢牛腹瀉是基層牛場(chǎng)常見(jiàn)的流行病,多發(fā)于冬末春初等氣溫多變的季節(jié)。根據(jù)犢牛腹瀉的發(fā)病原因及發(fā)病特點(diǎn),可將其分為消化不良腹瀉與傳染性腹瀉。消化不良性腹瀉常呈現(xiàn)散發(fā)性,一般出現(xiàn)一過(guò)性腹瀉,對(duì)牛場(chǎng)養(yǎng)殖不會(huì)造成較大的損失。傳染性腹瀉又可分為病毒性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉、寄生蟲(chóng)性腹瀉以及混合感染性腹瀉。其中較常引起細(xì)菌性腹瀉的病菌包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等腸道致病菌[5]。這些致病菌中,大腸桿菌為引起犢牛腹瀉最主要的致病菌。以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌最為常見(jiàn),導(dǎo)致?tīng)倥0l(fā)生腹瀉的原因主要為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌所攜帶的毒素及黏附素基因,主要包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)及F41,其中以K99 和F41 最為常見(jiàn)[6]。此次在牛源腹瀉糞樣中檢出的E.coli攜帶的毒力因子為K99,通過(guò)致病性試驗(yàn)結(jié)果表明此次分離菌株有致病性。

        對(duì)本次分離出的K99 菌毛大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn),結(jié)果顯示該分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗菌藥物均耐藥。以上十七種抗菌藥物涉及八類(lèi),但均顯示不同程度的耐藥。該分離菌株只對(duì)多黏菌素b 中介。楊艷麗[7]等研究發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)牛源E.coli 對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。許淑蕓[8]等的研究顯示石河子地區(qū)牛源E.coli 對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物頭孢唑林、阿莫西林、青霉素、頭孢他定等抗生素耐藥性較高。郭慶勇[9]等的研究顯示伊犁某牛場(chǎng)的糞源大腸桿菌不同生長(zhǎng)階段均對(duì)氨基糖苷類(lèi)及β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥。本試驗(yàn)檢測(cè)分離的E.coli 也對(duì)各類(lèi)抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,與三人的研究結(jié)果基本一致,同時(shí)對(duì)四環(huán)素類(lèi)、林可酰胺類(lèi)及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)同樣存在耐藥性,這一現(xiàn)象可能是由于該地區(qū)牛場(chǎng)使用這些抗菌藥物較多。本次分離菌株的耐藥性試驗(yàn)可為該牛場(chǎng)犢牛細(xì)菌性腹瀉防控工作提供用藥選擇依據(jù),并為制定合理的抗菌治療方案提供參考。

        綜上所述,在防控細(xì)菌流行病時(shí),由于抗菌藥物濫用易導(dǎo)致致病菌耐藥性增加從而給牛場(chǎng)防控疫病的工作開(kāi)展造成困難。在治療細(xì)菌流行病時(shí),應(yīng)根據(jù)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇有效抗菌藥物[10],并且制定合理的治療方案,杜絕無(wú)理論依據(jù)和臨床指癥的抗菌治療。目前市面上已經(jīng)有效果較好的大腸桿菌疫苗及K99滅活苗,在防控大腸桿菌腹瀉病時(shí)可選擇滅活苗,有效做到未病先防。

        4 結(jié) 論

        本次從該牛場(chǎng)分離到的攜帶K99 毒力基因的大腸桿菌菌株,對(duì)小鼠有一定的致病力,并且藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)青霉素、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢哌酮、鏈霉素等多種抗菌藥物耐藥。提示該地區(qū)導(dǎo)致?tīng)倥8篂a的大腸桿菌耐藥嚴(yán)重,防治過(guò)程中應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果選藥,并規(guī)范使用。此外,也提示大腸桿菌疫苗的開(kāi)發(fā)或引進(jìn)作為防控犢牛大腸桿菌病的另一個(gè)途徑應(yīng)該得到重視。

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