王 曦,陳 丹,羅 丹,陳 璇,馬佳月升,張亮韜,劉 衛(wèi)2,Δ

[1.武漢百思凱瑞生物科技有限公司,湖北 武漢 430075;2.華中科技大學(xué)國(guó)家納米藥物工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430075;3.華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湖北 武漢 430074;4.樣美生物科技(北京)有限公司,北京 100020]

九肽-1是一種含有9個(gè)氨基酸的小分子肽,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性方式與黑色素皮質(zhì)素受體1相結(jié)合,阻礙酪氨酸酶活化,進(jìn)而抑制黑色素的生成[1]。依克多因能阻止應(yīng)激因子損傷細(xì)胞,隔離紫外線輻射、變應(yīng)原、污染物等對(duì)皮膚的損害,1.0%依克多因能有效防止皮膚細(xì)胞損傷,皮膚自愈修復(fù)速度提升了2～3倍[2-3]。利用納米脂質(zhì)體包載技術(shù),可以改善皮膚功效活性成分的穩(wěn)定性,促進(jìn)活性成分進(jìn)入靶細(xì)胞,有效提高活性成分的生物利用率[4-5]。本研究探討了九肽-1/依克多因經(jīng)皮共遞送納米脂質(zhì)體(Non/Ect-NLPs)的皮膚美白和修復(fù)作用,以期為研制具有美白修復(fù)功效的護(hù)膚品提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1主要試劑與細(xì)胞 九肽-1購(gòu)自南京萊昂生物科技公司;依克多因購(gòu)自濟(jì)南華熙生物科技公司;卵磷脂購(gòu)自上海太偉藥業(yè)公司;聚乙二醇-40(PEG-40)氫化蓖麻油購(gòu)自德國(guó)巴斯夫公司;1,3-丙二醇、1,2-己二醇、甘油購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gbico公司;L-多巴、酪氨酸、TritonX-100、3% H2O2、α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;人源水通道蛋白-3(AQP3)、絲聚合蛋白(FLG)、緊密連接蛋白1(Claudin-1)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自江蘇酶免生物科技公司。人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)、小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

1.3方法

1.3.1Non/Ect-NLPs的制備及粒徑等測(cè)定 稱取處方量卵磷脂、膽固醇、PEG-40氫化蓖麻油和1,3-丙二醇為A相,另稱取處方量九肽-1、依克多因、1,2-己二醇和甘油等溶于適量超純水中為B相,于40 ℃水浴混勻,將A相和B相混合,繼續(xù)攪拌,高壓均質(zhì)機(jī)均質(zhì)溶液3次后,得到Non/Ect-NLPs。取適量Non/Ect-NLPs,稀釋適當(dāng)倍數(shù),測(cè)定粒徑、多分散性指數(shù)(PDI)和Zeta電位。

1.3.2觀察細(xì)胞攝取行為 采用異硫氰酸熒光黃(FITC)代替活性成分制備FITC標(biāo)記的納米脂質(zhì)體(FITC-NLPs),與游離FITC中熒光標(biāo)記水平相同。將B16F10細(xì)胞以3×105/mL的密度接種于共聚焦皿,每皿2 mL,培養(yǎng)24 h,棄上清液,加入含游離FITC、FITC-NLPs(FITC均為1 μg/mL)的培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱攝取4 h,棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次,采用組織固定液固定細(xì)胞,在避光環(huán)境下,依次用羅丹明B(RhoB)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(均為1 μg/mL)染色各15 min,采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3.3細(xì)胞安全性評(píng)價(jià) 將1.5×105/mL的HaCaT細(xì)胞加入96孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h,每孔分別加入100 μL含有62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs(Non/Ect-NLPs組)及游離成分溶液(游離成分溶液組,與Non/Ect-NLPs組中活性成分水平相同)的DMEM完全培養(yǎng)基,對(duì)照組僅加100 μL DMEM完全培養(yǎng)基。每組3個(gè)平行孔,重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4酪氨酸酶活性測(cè)定 將5.0×104/mL的B16F10細(xì)胞加入24孔板,每孔500 μL,培養(yǎng)24 h。對(duì)照組僅加入完全培養(yǎng)基,模型組、游離成分溶液組及Non/Ect-NLPs組加入100 nmol/L α-MSH制備黑素高表達(dá)細(xì)胞模型。Non/Ect-NLPs組同時(shí)加入125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs,游離成分溶液組與Non/Ect-NLPs組中活性成分水平相同,均用DMEM完全培養(yǎng)基配制。每組3個(gè)平行孔,重復(fù)3次。培養(yǎng)48 h后,棄去上清液,每孔加入1% TritonX-100的PBS 200 μL于-80 ℃冰箱裂解,取細(xì)胞裂解液離心,取各孔上清液100 μL,加入0.1% L-多巴100 μL,37 ℃放置1 h,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,計(jì)算酪氨酸酶活性[6]。

1.3.5黑色素水平測(cè)定 將5.0×104/mL的B16F10細(xì)胞加入6孔板,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h。各分組及加樣方式同“1.2.4”。每組設(shè)3個(gè)平行孔,重復(fù)3次。培養(yǎng)48 h后,PBS清洗細(xì)胞后,每孔加入含有10%二甲基亞砜的1.0 mmol/L氫氧化鈉溶液300 μL,在90 ℃水浴裂解細(xì)胞3 h,于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度,計(jì)算黑色素水平[6]。

1.3.6細(xì)胞抗氧化分析 將1.5×105/mL的HaCaT細(xì)胞加入96孔板,每孔100 μL,培養(yǎng)24 h。各分組及加樣方式同“1.2.4”,僅在造細(xì)胞氧化損傷模型時(shí),將100 nmol/L α-MSH替換為0.8 mmol/L H2O2。每組3個(gè)平行孔,重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.7細(xì)胞遷移分析 將5.0×105/mL的HaCaT細(xì)胞加入6孔板,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h。用黃色槍頭在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃1條線,PBS清洗細(xì)胞3次,顯微鏡拍照觀察加樣前的劃痕寬度。拍照后,對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基,其他組分別加入250.0 μg/mL Non/Ect-NLPs與游離成分溶液的無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,用顯微鏡拍照觀察加樣后的劃痕寬度,計(jì)算細(xì)胞遷移率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[7]。

對(duì)電力行業(yè)而言，電力生產(chǎn)涉及的運(yùn)行工況、參數(shù)、設(shè)備運(yùn)行狀態(tài)等實(shí)時(shí)生產(chǎn)數(shù)據(jù)，現(xiàn)場(chǎng)總線系統(tǒng)所采集的設(shè)備檢測(cè)數(shù)據(jù)以及發(fā)電量、電壓穩(wěn)定性等方面的數(shù)據(jù)，電力企業(yè)運(yùn)營(yíng)和管理數(shù)據(jù)，共同構(gòu)成了“電力大數(shù)據(jù)”。[1]目前，大數(shù)據(jù)分析技術(shù)在變電站生產(chǎn)運(yùn)維和安全管控中的應(yīng)用較少。而大數(shù)據(jù)技術(shù)應(yīng)用到電力生產(chǎn)運(yùn)維工作中將發(fā)揮巨大的作用和產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。[2]本文將大數(shù)據(jù)技術(shù)與最優(yōu)運(yùn)維策略、設(shè)備狀態(tài)趨勢(shì)預(yù)判、現(xiàn)場(chǎng)作業(yè)安全管控、順控操作時(shí)遠(yuǎn)方視頻驗(yàn)證等方面進(jìn)行結(jié)合，來(lái)闡述對(duì)變電站運(yùn)維模式的改進(jìn)和提高運(yùn)維效率的作用。

1.3.8皮膚修復(fù)相關(guān)因子檢測(cè) 將1.0×105/mL的HaCaT細(xì)胞加入24孔板,每孔500 μL,培養(yǎng)24 h。對(duì)照組僅加DMEM完全培養(yǎng)基,其他組分別加入含有125.0、250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs與游離成分溶液的DMEM完全培養(yǎng)基。每組3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,檢測(cè)上清液中AQP3、FLG、Claudin-1水平。

2 結(jié) 果

2.1粒徑、PDI和Zeta電位 Non/Ect-NLPs為淡黃色透明液體,測(cè)得其粒徑為(34.3±0.1)nm,PDI為(0.195±0.007),Zeta電位為(-31.7±0.9)mV。

2.2黑素細(xì)胞攝取情況 孵育相同時(shí)間,FITC-NLPs細(xì)胞質(zhì)中熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于游離FITC,而游離FITC主要聚集于B16F10細(xì)胞表面。FITC-NLPs能夠被快速攝取進(jìn)入B16F10細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

注：Merge是將DAPI、RhoB、FITC圖片進(jìn)行組合。

2.3細(xì)胞安全性比較 不同水平Non/Ect-NLPs組和游離成分溶液組中HaCaT細(xì)胞活性均在80%以上,無(wú)細(xì)胞毒性。見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組比較,bP<0.01;A～E組分別為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/mL Non/Ect-NLPs組與相應(yīng)游離成分溶液組。

2.4酪氨酸酶活性比較 與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為250.0、500.0 μg/mL時(shí),其對(duì)B16F10細(xì)胞酪氨酸酶活性顯著降低(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素細(xì)胞酪氨酸酶的能力強(qiáng)于同劑量游離成分。見(jiàn)圖3。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.5黑色素水平比較 與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為125.0、500.0 μg/mL時(shí),其能顯著抑制B16F10細(xì)胞分泌黑色素(P<0.05)。Non/Ect-NLPs抑制黑素細(xì)胞黑色素分泌能力強(qiáng)于同劑量游離成分。見(jiàn)圖4。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.05,cP<0.01。

2.6細(xì)胞抗氧化能力比較 采用0.8 mmol/L H2O2損傷HaCaT細(xì)胞后,其存活率為50.36%,細(xì)胞氧化損傷明顯。與模型組比較,Non/Ect-NLPs水平為250.0、500.0 μg/mL時(shí),可顯著提高氧化損傷細(xì)胞的存活率(P<0.05)。與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs水平為500.0 μg/mL時(shí),可顯著提高氧化損傷細(xì)胞的存活率(P<0.01)。Non/Ect-NLPs的細(xì)胞抗氧化功效更為顯著。見(jiàn)圖5。

注：與模型組相比,aP<0.01;與同水平游離成分溶液組相比,bP<0.01。

2.7細(xì)胞遷移能力比較 與對(duì)照組比較,游離成分溶液組和Non/Ect-NLPs組能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移(P<0.01)。與游離成分溶液組比較,Non/Ect-NLPs組能顯著促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移(P<0.01)。Non/Ect-NLPs促進(jìn)HaCaT細(xì)胞遷移的能力優(yōu)于游離成分溶液。見(jiàn)圖6、7。

圖6 對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響

注：與對(duì)照相比,aP<0.01;與游離成分溶液組相比,bP<0.01。

2.8皮膚修復(fù)相關(guān)因子水平比較 與對(duì)照組比較,游離成分溶液組、Non/Ect-NLPs組AQP3、FLG、Claudin-1水平顯著增高(P<0.05)。與游離成分溶液組比較,500 μg/mL Non/Ect-NLPs組AQP3、FLG水平顯著升高(P<0.05);250.0、500.0 μg/mL Non/Ect-NLPs組Claudin-1水平顯著升高(P<0.05)。Non/Ect-NLPs較相同水平游離成分溶液具有更好的皮膚保濕修復(fù)功效。見(jiàn)圖8。

注：與對(duì)照組相比,aP<0.05,bP<0.01;與同濃度游離成分溶液組相比,cP<0.05,dP<0.01。

3 討 論

目前,功效性化妝品產(chǎn)品大多存在功效成分單一、透皮吸收困難等問(wèn)題。納米脂質(zhì)體作為一種新型給藥遞送系統(tǒng),制劑質(zhì)量穩(wěn)定,且所載活性成分經(jīng)包裹后能有效提高成分穩(wěn)定性。納米脂質(zhì)體粒徑小,能增強(qiáng)藥物活性成分的經(jīng)皮擴(kuò)散速率及藥物的經(jīng)皮吸收[8]。共輸送納米載體可同時(shí)負(fù)載多種美白作用機(jī)制的功效成分,實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)多效護(hù)膚功效成分協(xié)同增效[6]。采用經(jīng)皮給藥納米載體技術(shù),將九肽-1和依克多因共包載于同一納米脂質(zhì)體中,解決活性成分極性強(qiáng)、難透皮吸收、難緩釋等問(wèn)題,可實(shí)現(xiàn)將美白修復(fù)活性成分的皮膚靶向共輸送,達(dá)到協(xié)同增效及緩釋作用[8-9]。在本團(tuán)隊(duì)已完成的工作基礎(chǔ)上[7,10],本研究對(duì)Non/Ect-NLPs的皮膚美白和修復(fù)作用進(jìn)行了探索。

本文構(gòu)建的Non/Ect-NLPs平均粒徑為(34.3±0.1)nm,PDI為(0.195±0.007),Zeta電位為(-31.7±0.9)mV。Non/Ect-NLPs能促進(jìn)B16F10細(xì)胞對(duì)活性成分的攝取,抑制B16F10細(xì)胞的酪氨酸酶活性和黑色素水平,緩解皮膚細(xì)胞氧化損傷,從而直接減少黑色素的產(chǎn)生[11-12]。Non/Ect-NLPs可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移,提高皮膚修復(fù)因子AQP3、FLG、Claudin-1的分泌量,提高皮膚保濕修復(fù)功能。

綜上所述,Non/Ect-NLPs具有美白皮膚和保濕修復(fù)作用,實(shí)現(xiàn)了不同機(jī)制活性成分的協(xié)同增效作用,在美白修復(fù)護(hù)膚品中有較好應(yīng)用前景。