易 倩,張合富,李官翔,樊麗莎,鄧加加,張伶燕,張 健

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,貴州 貴陽 520025;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究所,貴州 貴陽 520025)

骨骼作為維持機體運動的重要器官,在體內(nèi)發(fā)揮著運動、支持、保護、造血、貯存礦物質(zhì)等功能。正常情況下,機體內(nèi)成骨細胞介導(dǎo)的骨形成能與破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收保持動態(tài)平衡,維持骨骼的正常功能[1]。中老年人,尤其是絕經(jīng)后的婦女,其破骨細胞過度激活、骨吸收增加,使得骨量降低、骨骼脆性增加,在微觀結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)疏松多孔狀態(tài),即骨質(zhì)疏松癥。因此,抑制破骨細胞分化成為防治骨量丟失、治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點。麥冬是我國使用廣泛的傳統(tǒng)中藥。據(jù)張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中記載,麥冬具有養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩等功效。麥冬多糖(OPS)是麥冬的主要成分,在麥冬中的提取率高達35%,這可能與麥冬的功效有關(guān)[2]。近期研究發(fā)現(xiàn),OPS的作用更加廣泛,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、保護心肌、提高機體免疫力等多種功效[2-7]。研究發(fā)現(xiàn),OPS通過降低氧化應(yīng)激對巨噬細胞的損傷,減少細胞凋亡,從而起到保護巨噬細胞的作用[8],但其在骨代謝領(lǐng)域的功能尚未揭示。破骨細胞起源于骨髓單核巨噬細胞(BMMs),是體內(nèi)唯一具有骨吸收能力的終末分化細胞。本研究探討了OPS對核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)誘導(dǎo)的BMMs破骨分化、骨吸收的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周SPF級C57BL/6j雌性小鼠10只,體重18～22 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2022-0011],飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究所動物房[SYXK(黔)2021-0005],溫度20～25 ℃,濕度40%～60%,自由采食及飲水,相關(guān)飼養(yǎng)及實驗操作經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(20220131)。麥冬購于張家港市綠色中藥飲片有限公司(批號：190115)。

1.2主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司),M-CSF、RANKL(美國Peprotech公司)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒(美國Sigma公司),TRAP活性檢測試劑盒、細胞活性試劑盒、青-鏈霉素雙抗、RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒、BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒、BeyoFastTMSYBR Green定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。多功能酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司),相差顯微鏡(日本Olympus公司),T100TMPCP儀(美國Bio-Rad公司),實時熒光定量PCR儀(杭州博日科技有限公司),NanoDrop微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.3方法

1.3.1OPS提取 參照張靖等[9]介紹的方法對麥冬中的OPS進行提取,主要步驟為：取麥冬1 000 g加95%乙醇浸泡后,經(jīng)水浴回流提取2次,隨后藥渣加9倍量水煎煮3次,所有藥液合并濃縮至1 L,進一步經(jīng)醇沉、乙醚、丙酮洗滌后,60 ℃下干燥OPS粗粉末。隨后采用三氯乙酸法去除蛋白質(zhì),以苯酚-硫酸法測定OPS水平。根據(jù)OPS測定結(jié)果(實測值：88.76%)將其制備成含糖量為1 mg/mL的母液,經(jīng)高壓滅菌后,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2小鼠BMMs分離和培養(yǎng) 小鼠BMMs分離和培養(yǎng)步驟：(1)小鼠麻醉后脫頸處死,浸泡于75%乙醇中,置于超凈工作臺上;(2)迅速解剖小鼠并分離出雙側(cè)股骨,剔除附著物,用含雙抗的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后,剪除股骨近、遠端,暴露骨髓腔;(3)使用1 mL注射器抽取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔,吹出骨髓組織,重懸于α-MEM完全培養(yǎng)基,1 200 r/min離心8 min后,棄上清液;(4)使用含50 ng/mL M-CSF完全培養(yǎng)基重懸后,接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿中,過夜;(5)棄培養(yǎng)基,用無菌PBS沖洗3次后,加10 mL含50 ng/mL M-CSF完全培養(yǎng)基,隔天換液;(6)重復(fù)步驟(5)操作直至細胞呈短梭形,密度達80%～90%;(7)培養(yǎng)好的細胞使用PBS沖洗3次,用移液槍吹落后混勻備用,即為BMMs。后續(xù)BMMs培養(yǎng)時使用含50 ng/mL M-CSF完全培養(yǎng)基,進行破骨分化誘導(dǎo)時采用含 0 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF完全培養(yǎng)基。

1.3.3BMMs細胞活性檢測 按每孔3×103個細胞的密度將BMMs接種于96孔板中,按實驗設(shè)計分為對照組和3個不同水平OPS處理組。對照組使用含50 ng/mL M-CSF完全培養(yǎng)基(即0 μg/mL OPS),OPS處理組在此基礎(chǔ)上加入2.5、10.0、或40.0 μg/mL OPS(A、B、C組)。在給藥后48、96 h,每孔加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定每孔吸光度(OD)值,計算細胞活性。

1.3.4BMMs破骨分化誘導(dǎo) 將BMMs按每皿1×105個細胞的密度接種到35 mm培養(yǎng)皿中,過夜后,使用破骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(α-MEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%谷氨酰胺+50 ng/mL RANKL+50 ng/mL M-CSF)進行破骨分化誘導(dǎo),隔天換液。5 d后,在顯微鏡下可見BMMs開始匯聚、融合,出現(xiàn)多核細胞,7 d可見邊界清晰、巨大的成熟破骨細胞。

1.3.5破骨細胞TRAP活性檢測 為研究OPS對TRAP活性的影響,將BMMs按每皿1×105個細胞的密度接種到35 mm培養(yǎng)皿中,過夜、貼壁。隨后,按實驗設(shè)計更換為含不同水平OPS(0、2.5、10.0、40.0 μg/mL)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,隔天換液,7 d后誘導(dǎo)為成熟的破骨細胞。收集各培養(yǎng)孔細胞,并按照TRAP活性檢測試劑盒說明書測定破骨細胞TRAP活性及蛋白水平。

1.3.6破骨細胞形成檢測 將BMMs誘導(dǎo)為成熟的破骨細胞后,棄培養(yǎng)基,用PBS潤洗2次,每孔加500 μL 4%多聚甲醛,固定10 min。棄甲醛、用PBS沖洗2遍后,按照試劑盒說明書介紹方法進行TRAP染色。使用倒置顯微鏡拍攝染色圖,TRAP陽性且細胞核數(shù)目大于或等于3個的細胞計為破骨細胞,并通過ImageJ軟件進行破骨細胞相對大小的計算,破骨細胞相對大小=各組破骨細胞大小/對照組中破骨細胞大小的平均值。

1.3.7破骨細胞骨吸收能力檢測 將BMMs按每孔3×103個細胞的密度接種到骨培養(yǎng)板中,誘導(dǎo)為成熟破骨細胞后,棄培養(yǎng)基,用0.1%次氯酸鈉溶液漂白骨培養(yǎng)板。生物顯微鏡下觀察骨陷窩形成情況,獲取骨吸收圖像,并用Image Pro6.0軟件分析圖像。

1.3.8采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法測定破骨細胞分化標(biāo)志基因mRNA表達 將BMMs按每孔1×104個細胞的密度接種于6孔板中,過夜、貼壁后,按1.3.3分組培養(yǎng)細胞。7 d后棄培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS沖洗1次后,每孔加入300 μL總RNA提取試劑,按照RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒說明書的方法提取細胞總RNA后,用NanoDrop微量分光光度計測定總RNA水平。隨后,按BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒說明書中介紹的方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,檢測碳酸酐酶2(Car2)、組織蛋白酶K(CTSK)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、TRAP、液泡型H+-ATP酶(V-ATPase) mRNA表達水平。RT-qPCR所用引物序列見表1。

表1 破骨細胞分化標(biāo)志基因的引物序列

2 結(jié) 果

2.1不同水平OPS對BMMs細胞活性的影響 A、B、C組48、96 h時OD值比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 不同水平OPS對BMMs細胞活性的影響

2.2不同水平OPS對破骨細胞分化的影響 細胞培養(yǎng)7 d后,經(jīng)固定、TRAP染色,在倒置顯微鏡下觀察可見,對照組中出現(xiàn)大量多核、肥大、煎餅樣的成熟破骨細胞。與未添加OPS的對照組相比,添加OPS會顯著抑制破骨細胞生成。B組成熟破骨細胞數(shù)目顯著下降,C組只有極少量破骨細胞生成。見圖2。與對照組(1.00±0.15)比較,B組成熟破骨細胞數(shù)目降低至(0.61±0.06)(P<0.05),而C組成熟破骨細胞數(shù)目為(0.31±0.03)(P<0.05)。見圖3。

圖2 倒置顯微鏡下觀察各組破骨細胞分化情況(TRAP染色,100×)

圖3 不同水平OPS對破骨細胞分化的影響

2.3不同水平OPS對破骨細胞TRAP活性的影響 與對照組相比,B、C組5 d時破骨細胞TRAP活性顯著降低(P<0.05)。A、B、C組7 d時破骨細胞TRAP活性顯著低于對照組(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同水平OPS對破骨細胞TRAP活性的影響

2.4不同水平OPS對破骨細胞骨吸收能力的影響 對照組中出現(xiàn)大量骨吸收陷窩,A組骨吸收陷窩明顯減少,C組僅可見少量骨吸收陷窩。見圖5。以對照組骨吸收面積為1,進一步統(tǒng)計分析顯示,A、B、C組骨吸收面積僅為對照組的71%、40%和6%(P<0.05)。見圖6。

圖5 骨吸收圖(100×)

圖6 不同水平OPS對破骨細胞骨吸收能力的影響

2.5不同水平OPS對破骨細胞相關(guān)基因mRNA表達水平的影響 與對照組比較,B、C組Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。見圖7。

圖7 不同水平OPS對Car2、CTSK、MMP-9、TRAP、V-ATPase mRNA表達水平的影響

3 討 論

麥冬是一種廣泛使用的傳統(tǒng)中草藥,OPS作為麥冬的主要成分,具有抗炎、抗氧化、降血糖、保護心肌、提高機體免疫力等功效。王曉穎[10]研究發(fā)現(xiàn),麥冬糖漿能顯著降低放射性肺炎模型小鼠血漿中白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β1、肺組織的脯氨酸、超氧化物歧化酶、MMP-2及其組織抑制物蛋白水平。OPS還能夠調(diào)節(jié)單胺氧化酶B、IL-2、TNF-α、IL-6、γ干擾素及IL-10 mRNA表達,增強機體免疫力[11]。最近研究發(fā)現(xiàn),OPS還具有抗腫瘤作用,羧甲基化修飾的OPS能有效地抑制癌細胞增殖[12]。且給S-180荷瘤小鼠灌胃2.0 g/kg OPS,可顯著提高巨噬細胞吞噬能力及血清IL-1β、TNF-α水平[13]。然而,OPS對骨吸收的影響鮮有報道。

破骨細胞來源于單核巨噬細胞系統(tǒng)[14]。破骨細胞的過度激活及伴隨骨吸收功能的過度活化是造成機體骨質(zhì)疏松的重要原因。破骨細胞的活性主要體現(xiàn)在能否從單核巨噬細胞分化為破骨細胞,以及其溶骨功能的強弱。本研究結(jié)果顯示,40.0 μg/mL及以下水平的OPS對BMMs增殖無明顯抑制作用。對RANKL和M-CSF誘導(dǎo)的破骨細胞進行TRAP染色及骨吸收能力檢測,結(jié)果顯示,添加OPS能顯著抑制破骨細胞形成,減少骨吸收,且40.0 μg/mL OPS處理的BMMs幾乎不能形成成熟的破骨細胞。因此,OPS是一種潛在的有效抗骨吸收藥物。OPS對破骨細胞的顯著抑制作用可能與其抗氧化和抗炎功能相關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn),OPS可有效地清除氧自由基,降低HIH/3T3細胞損傷誘導(dǎo)的單線態(tài)氧的產(chǎn)生及炎癥因子表達量[15]。另一方面,麥冬水提物能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中一氧化氮的分泌和TNF-α蛋白表達,從而發(fā)揮抗炎作用[16]。在破骨細胞分化過程中,氧自由基的升高能激活機體的破骨細胞,促進骨吸收[17-19]。多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-11等可顯著促進破骨細胞的分化[20]。既然OPS具有有效的抗氧化及抗炎作用,而且活性氧及炎癥因子在破骨細胞分化過程中發(fā)揮重要作用,那么OPS對破骨細胞分化功能的抑制也與其抗氧化及抗炎作用相關(guān),具體的機制有待進一步研究。

CTSK作為半胱氨酸蛋白酶家族中的一員,在破骨細胞中溶酶體和細胞質(zhì)囊泡中大量表達[21],其參與有機骨基質(zhì)蛋白中Ⅰ型膠原、骨橋接素和骨粘連蛋白的降解,是發(fā)揮骨吸收功能的一個關(guān)鍵酶[22]。人CTSK突變會導(dǎo)致致密性成骨不全,小鼠CTSK基因敲除會出現(xiàn)骨基質(zhì)降解障礙[23]。ATPase屬于質(zhì)子泵的一種,位于破骨細胞膜的褶皺緣處,用于維持破骨細胞封閉區(qū)的酸性環(huán)境。ATPase基因敲除小鼠的破骨細胞成熟度降低、骨吸收功能受到影響,骨骼硬度增加[24]。Car2主要存在于破骨細胞中的胞漿中,能催化二氧化碳的水合作用,產(chǎn)生質(zhì)子[21]。TRAP位于破骨細胞的微粒體中,通過褶皺緣分泌進入封閉區(qū),與其他酶一起參與骨基質(zhì)中礦化物的降解,是骨吸收和破骨細胞活性的良好標(biāo)志物,但其確切的生理作用還不清楚[25]。MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的一員。作為一種胞外蛋白酶,MMP-9在破骨細胞中高度表達,參與細胞外基質(zhì)的降解,最終通過影響破骨細胞的遷移而影響破骨細胞活性[26-27]。MMP-9能特異性溶解非礦化軟骨,促進破骨細胞活化;MMP-9缺乏會延緩破骨細胞募集,抑制骨吸收,同時MMP-9還可以抑制成骨過程中細胞遷移[28]。因此,可通過檢測破骨細胞分化過程中上述基因表達的變化,探索OPS影響破骨細胞分化的機制。

本研究中,OPS可濃度依賴性地抑制M-CSF和RANKL刺激下參與膠原蛋白降解和骨陷窩形成的CTSK和MMP-9 mRNA表達,提示OPS對破骨細胞的骨吸收功能具有明顯的抑制作用。破骨細胞中,Car2催化產(chǎn)生的質(zhì)子經(jīng)V-ATPase轉(zhuǎn)運至破骨細胞褶皺緣,并維持吸收陷窩的酸性環(huán)境。本研究結(jié)果顯示,添加OPS可以抑制破骨細胞中Car2和V-ATPase mRNA表達,提示OPS可能會升高骨陷窩pH值,抑制骨吸收酶活性,降低骨吸收。

綜上所述,OPS可顯著抑制破骨細胞分化功能,抑制骨吸收,但其深層機制仍不清楚,有待進一步研究。