須凌峰 張月姣 張建昌 余佳 霍婉秋 徐佳麗 王美青

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎與異常咬合刺激關(guān)系密切[1-2]，本課題組前期研究表明，流體剪切力(flow fluid shear stress，F(xiàn)FSS)可通過多種信號途徑，如mTOR途徑[3]，CaSR途徑[4]，引起軟骨細胞凋亡、終末分化等異常反應(yīng)。顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細胞根據(jù)分化程度可分為增殖細胞、前肥大細胞和肥大細胞等不同類型[5]，其中增殖細胞層中含有軟骨祖細胞(chondroprogenitor cells，CPCs)。軟骨祖細胞在關(guān)節(jié)軟骨更新修復(fù)和穩(wěn)態(tài)維持中扮演著重要的角色[6-7]。在課題組構(gòu)建的單側(cè)前牙反動物模型中，位于軟骨深層的肥大細胞會首先凋亡，而位于軟骨淺層(增殖層)的細胞則表現(xiàn)出較強的抵抗機械力刺激的能力[8]。為探索軟骨祖細胞響應(yīng)異常力刺激的規(guī)律，本研究通過第二代高通量RNA測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)，從分子水平分析了軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后的變化，以期深入理解軟骨祖細胞對異常力刺激的反應(yīng)特點。

1 材料與方法

1.1 軟骨祖細胞的分離與培養(yǎng)

取3 周齡雌性SD大鼠,使用手術(shù)刀分離髁突淺層軟骨,組織塊在無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)中漂洗后,在DMEM培養(yǎng)基中將其切碎成1 mm×1 mm組織塊。收集組織,離心,棄上清。胰蛋白酶37 ℃消化20 min,然后使用Ⅰ型膠原酶(2 mg/mL)及Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL)消化1 h。完全培養(yǎng)基終止消化,離心,棄上清,加入完全培養(yǎng)基重懸細胞。細胞培養(yǎng)于37 ℃,含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)至第3 代時用于后續(xù)實驗。

1.2 流式細胞術(shù)

將第一代軟骨祖細胞消化后制成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為1×107/mL。取100 μL上述細胞懸液,對照組不加抗體,實驗組加入FITC anti-rat CD90 Antibody(Biolegend, 美國), 4 ℃孵育30 min。孵育完成后PBS反復(fù)洗滌細胞3 次,進行上機檢測。

1.3 流體剪切力加載

體外培養(yǎng)至第2 代的細胞經(jīng)消化收集后,接種于Flexcell StreamerTM(Flexcellint, 美國)Slips 玻片,約3 d長至80%融合時,對細胞加載1.2 Pa的流體剪切力(flow fluid shear stress, FFSS)刺激2 h。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

使用TRIzol試劑(Ambion, 美國)進行總RNA提取檢測RNA完整性和總量。合格的樣品經(jīng)過構(gòu)建文庫與質(zhì)檢后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina, 美國)測序。測序部分由北京諾禾致源科技股份有限公司提供技術(shù)支持。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 主成分分析及相關(guān)性分析 通過諾禾云平臺(https://magic.novogene.com)進行,用以評估樣品間基因表達模式相似程度與組間可區(qū)分度。差異表達分析使用DESeq2軟件(1.20.0)進行。本文設(shè)定padj<0.05 &|log2(foldchange)|>1為顯著差異表達的閾值。

1.5.2 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通過clusterProfiler(3.8.1)對差異表達基因進行KEGG通路富集分析及GO富集分析,分析結(jié)果分別以氣泡圖和柱狀圖進行展示。

1.5.3 差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析 選擇差異表達基因中|foldchange| Top 500的差異表達基因,通過預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的STRING數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/)提取相互作用關(guān)系。隨后將相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytospcape3.8.2軟件,使用CytoNCA軟件計算各節(jié)點介數(shù)中心度(betweenness, BC)。選擇BC Top 200的節(jié)點構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心節(jié)點篩選,并通過Cytoscape3.8.2繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)

使用TRIzol裂解細胞,按照說明提取總RNA。使用MightyScript 第一鏈 cDNA 合成Master Mix(上海生工)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green染料法Mix(上海生工)進行定量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism9.0.0(GraphPad公司,美國)進行統(tǒng)計分析與繪制統(tǒng)計圖。使用StudentT檢驗進行2 組間差異比較,P<0.05則認為存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 實驗樣本可靠性分析與差異表達

CD90是一種典型的干細胞表面標(biāo)志物。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,提取的大鼠髁突原代軟骨細胞CD90陽性細胞率達到98.51%(圖1)。經(jīng)過Illumina測序后,對結(jié)果進行主成分分析,結(jié)果顯示:對照組三個樣本聚集緊密,而FFSS刺激組樣本稍微分散,但仍能夠很好地區(qū)分對照組和FFSS刺激組(圖2A)。樣本間Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示,對照組組內(nèi)差異較小,而FFSS刺激組組內(nèi)差異略大(圖2B)。即:FFSS刺激后軟骨祖細胞的基因型發(fā)生了明顯變化,并能夠很好地與對照組區(qū)分。

圖1 軟骨祖細胞CD90陽性細胞率

圖2 主成分分析(A)與樣本間相關(guān)性分析(B)

2.2 差異表達基因篩選

在FFSS刺激后的樣本中共篩選出了1 996 個與對照組相比有顯著差異表達的基因,其中1 348 個基因表達上調(diào), 648 個基因表達下調(diào)(圖3)。表2展示了上調(diào)和下調(diào)差異表達基因中排名前10的基因,顯著上調(diào)的基因包括了溶質(zhì)載體蛋白家族成員Slc6a12、 Slc25a48,補體家族成員C3,特異性受體酪氨酸激酶家族成員Adgrv1、脂聯(lián)素家族成員Lcn2等。

圖3 差異表達基因火山圖

表2 Top10差異表達基因

2.3 GO和KEGG富集分析

為更加深入地研究軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后的反應(yīng)機制,我們進行了上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并從中挑選了排名前20的信號通路進行可視化分析。

對上調(diào)差異表達基因的KEGG通路富集分析結(jié)果表明,軟骨祖細胞對FFSS刺激的生物學(xué)反應(yīng)主要集中在與炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程密切相關(guān)的信號通路,如TNF信號通路、IL-17信號通路、TOLL樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路和破骨細胞分化等相關(guān)信號通路;對下調(diào)差異表達基因的KEGG通路富集分析結(jié)果表明,軟骨祖細胞主要受到細胞周期、p53信號通路、細胞外基質(zhì)受體交互、Foxo信號通路、局部黏附、PI3K-Akt信號通路、細胞衰老以及Wnt信號通路等的影響。

對于上調(diào)差異表達基因進行GO功能富集分析后發(fā)現(xiàn),受FFSS異常力刺激后,軟骨祖細胞參與的生物學(xué)過程主要與細菌來源分子反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、血管生成、炎癥反應(yīng)及細胞分裂等相關(guān),在細胞組分方面主要涉及細胞外基質(zhì)、膠原三聚體、細胞膜等;在分子功能方面主要涉及軟骨祖細胞對抗氧化活性、生長因子活性、受配體活性、細胞因子活性等。對于下調(diào)差異表達基因進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn),軟骨祖細胞的生物過程及細胞組分主要集中在多個與細胞分裂相關(guān)的活動中;在分子功能方面,軟骨祖細胞主要涉及細胞骨架結(jié)合與活性改變等內(nèi)容(圖4);GO富集分析結(jié)果則顯示,在生物學(xué)過程和細胞組分這兩方面主要富集在與細胞分裂相關(guān)的活動中。

2.4 炎癥及細胞周期相關(guān)基因表達

本研究在進行富集分析時發(fā)現(xiàn):炎癥反應(yīng)和細胞周期改變是軟骨祖細胞在異常力刺激下發(fā)生的重要生物學(xué)變化之一。為此,利用熱圖分別展示炎癥反應(yīng)相關(guān)基因和細胞周期相關(guān)基因的表達變化情況,結(jié)果表明:炎癥相關(guān)基因(如Il-1α、Il1r1、Hif1-α、 Nfkb1、Ccl7等)的表達顯著上調(diào)(圖5A),細胞增殖相關(guān)標(biāo)志物(如Mki67、 Ccnd1、 Ccnd1、 Pcna等)的表達顯著降低,而周期素依賴性激酶抑制因子1A(Cdkn1a)的表達水平顯著增高(圖5B)。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)了幾個核心基因,包括參與細胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程的白細胞介素-6(Il6)、激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)、蛋白微管相關(guān)蛋白2(Stmn2)、趨化因子配體2(Ccl2)、視黃酸受體(Ret)、蛋白激酶Cγ(Prkcg)、核因子kappa B抑制因子α(Nfkbia)[9-14];涉及細胞移動與黏附相關(guān)生物學(xué)過程的血管細胞黏附分子1(Vcam1)和肌球蛋白(Acta1)[15-16],以及在調(diào)控氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用的超氧化物岐化酶2(Sod2)[17](圖6)。

圖6 差異表達基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選

2.6 核心基因的驗證

為了驗證PPI網(wǎng)絡(luò)挖掘的核心基因,通過qRT-PCR驗證核心基因的表達量。結(jié)果顯示Acta1、 Atf3、 Ccl2、 Il6、 Nfkbia、 Ret、 Vcam1的表達變化與測序結(jié)果一致(圖7),而Sod2、 Stmn2表達無明顯變化,Prkcg表達變化與測序結(jié)果相反(圖7)。

圖7 核心基因驗證

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨是重要的負重組織,關(guān)節(jié)軟骨細胞對負荷變化可做出相關(guān)的生物學(xué)響應(yīng)。本文采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法,探討了下頜髁突軟骨祖細胞響應(yīng)FFSS刺激的生物學(xué)活動特點,結(jié)果表明:軟骨祖細胞對FFSS的響應(yīng)主要集中于炎性反應(yīng)和細胞周期這兩大生物學(xué)過程,信號通路涉及與細胞增殖、凋亡、分化、細胞移動、細胞代謝等生物學(xué)過程,Acta1、Atf3、Ccl2、Il2、Nfkbia、Ret、Vcam1在這些生物學(xué)過程中可能發(fā)揮重要作用。

位于淺層的軟骨祖細胞具有增殖和向成熟軟骨細胞分化的能力[18]。異常生物力在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,并誘發(fā)明顯的炎癥反應(yīng)[19]。白細胞介素-17(IL-17)是一種細胞因子,在骨關(guān)節(jié)炎病理過程可促進IL-1β、TNF、IL-6等炎性因子及基質(zhì)金屬蛋白酶和一氧化氮(NO)的生成[20],并促進骨關(guān)節(jié)炎惡化[21];PI3K/AKT/mTOR的激活能夠促進軟骨細胞增殖能力的恢復(fù),對維持關(guān)節(jié)軟骨組織穩(wěn)態(tài)起重要作用,但該通路也參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展[22],軟骨細胞中IL-17 介導(dǎo)的 PI3K/AKT/mTOR 通路的激活,可促進軟骨退變[23]。JAK-STAT被認為是細胞功能的中心節(jié)點之一,參與免疫適應(yīng)、組織修復(fù)、炎癥、凋亡、等多種生物學(xué)過程[24]。有報道指出:軟骨細胞受到白細胞介素-1(IL-1)刺激時其增殖能力將下降,而抑制JAK2/STAT3信號通路則能部分恢復(fù)受損軟骨細胞的增殖能力[25];而最近一項研究表明,JAK/STAT信號通路的激活能夠促進軟骨祖細胞衰老[26];腫瘤壞死因子-α/核因子-κB(TNF-α/NF-κB)信號通路是炎癥反應(yīng)中最重要的信號通路之一,抑制TNF-α/NF-κB信號通路的激活,可以抑制顳下頜關(guān)節(jié)軟骨祖細胞的炎癥反應(yīng)并維持軟骨生成能力[27]。本研究結(jié)果中PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示, Il6、Nfkbia等炎性和抗炎相關(guān)基因是互作網(wǎng)絡(luò)中的核心分子。先前的研究表明流體剪切力能夠刺激軟骨細胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2),誘導(dǎo)Il6的合成[20]。Atf3是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的關(guān)鍵介質(zhì)。炎性細胞因子通過NF-κB途徑上調(diào)Atf3的表達,而Atf3缺乏會減弱IkB和p65的磷酸化狀態(tài),抑制NF-κB信號, 從而抑制軟骨細胞中細胞因子誘導(dǎo)的Il6轉(zhuǎn)錄[28]。 Vcam1是一種重要的炎性反應(yīng)介質(zhì), Vcam1表達增加與炎癥及組織損傷有關(guān)[29]。而Nfkbia能夠抑制與炎性反應(yīng)相關(guān)的NF-κB/REL復(fù)合物。在FFSS刺激后,軟骨祖細胞Nfkbia表達水平升高, 可能是細胞對于炎性過程的一種保護性反應(yīng)。這些結(jié)果提示炎癥反應(yīng)是軟骨祖細胞對異常力刺激的主要響應(yīng)。

骨關(guān)節(jié)炎軟骨中,軟骨細胞通過改變代謝來適應(yīng)骨關(guān)節(jié)炎中的炎性環(huán)境[30]。溶質(zhì)載體(solute carrier, SLC)是一類負責(zé)物質(zhì)在胞內(nèi)胞外之間運輸?shù)目缒さ鞍?在細胞代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[31]。本研究發(fā)現(xiàn)軟骨祖細胞在受到FFSS刺激后,Slc6a12、Slc25a48的表達水平顯著升高。盡管尚且沒有溶質(zhì)載體蛋白與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的報導(dǎo),但是這些結(jié)果提示溶質(zhì)載體可能與骨關(guān)節(jié)炎病理過程中軟骨細胞代謝改變相關(guān)。

總之, 本研究通過采用第二代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),首次證明軟骨祖細胞對于FFSS刺激的主要響應(yīng)表現(xiàn)為炎癥反應(yīng),并揭示了參與這一過程的幾個重要炎性反應(yīng)相關(guān)信號通路,如NF-κB、IL-17、MAPK、JAK-STAT、PI3K/Akt等,從而為進一步研究軟骨祖細胞在力刺激作用下的功能活動特點及其可能的治療靶向,提供了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究基礎(chǔ)。