馬超群 李海強 吳煒

頜面部由于腫瘤,外傷及先天性發(fā)育不良導(dǎo)致的軟骨缺損畸形嚴(yán)重影響了患者的美觀和心理健康,在臨床上需要通過外科手術(shù)的方式借助軟骨移植體進行修復(fù)和整形。常用的移植材料包括人工合成材料和自體軟骨,然而人工材料易引起多種并發(fā)癥[1-2]。因此自體軟骨仍然是臨床修復(fù)移植的金標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。目前常用的自體軟骨包含鼻中隔軟骨,耳軟骨以及肋軟骨[5]。鼻中隔軟骨是最常用于鼻背側(cè)重建的移植體,不需要額外的手術(shù)切口,同時提供了良好的剛性支持[6]。鼻中隔軟骨優(yōu)勢顯著,但可取量不足限制了應(yīng)用[7]。耳軟骨作為另一種選擇,自然彎曲形態(tài)及組織學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其難以雕刻,且質(zhì)地偏脆,遠(yuǎn)期移植的畸形和翹曲發(fā)生率較高[8-9]。肋軟骨的優(yōu)勢在于其豐富的可用性。對于需要大量移植材料的病例,肋軟骨是首選的移植供體[10-11]。肋軟骨相對容易雕刻成形,吸收率低,但是易發(fā)生不可預(yù)測的翹曲[12]。

為解決以上問題,臨床上通常將軟骨切割為直徑1～3 mm左右的碎塊,避免了塊狀移植帶來的翹曲和變形,有利于精確充填不規(guī)則的缺損畸形[13]。碎片化的軟骨結(jié)構(gòu)單元有利于周圍纖維組織和血管的長入,便于移植體的營養(yǎng)交換和長期存活[14]。但碎塊大小往往依賴于術(shù)者的經(jīng)驗,缺乏準(zhǔn)確的評估。不均勻的碎片移植會導(dǎo)致外觀的不平整和顆粒感明顯而影響美觀效果。本研究探索了一種冷凍研磨的快速軟骨顆粒化處理方式,能夠短時間內(nèi)將軟骨塊處理為均勻的顆?；浦矄卧?結(jié)合富血小板凝膠(platelet-rich gel, PRG)共移植評價顆?；浌且浦驳男Ч麃頌樵摲绞降倪M一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物實驗獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號: IACUC-20231257),于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心完成。 6 只2～2.5 kg成年新西蘭白兔,用于獲得新鮮的肋軟骨; 3 月齡健康新西蘭白兔5 只,雌雄不限,體重 2 kg,由耳中央動脈提取PRG; 6～8 周雄性免疫缺陷鼠 15 只(湖南維通利華實驗動物技術(shù)有限公司),用于顆粒軟骨和顆粒軟骨-PRG移植體埋植及鼻背增高模型構(gòu)建。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素鏈霉素、 II型膠原酶(Gibco,美國); 掃描電鏡(S 4800, Hitachi公司,日本); 激光粒度分析儀(Mastersizer 3000, Malvern公司,英國)。

1.3 顆粒軟骨及PRG的制備

過量麻醉處死新西蘭兔,取出肋軟骨,用含1%青霉素-鏈霉素的PBS反復(fù)清洗5 遍。剝除肌肉筋膜及表面纖維,用無菌手術(shù)刀將軟骨切割成直徑3～5 mm的碎塊。碎塊置入研缽后依次進行液氮低溫冷凍和研磨獲得顆粒軟骨。將制備好的顆粒軟骨保存在冰上備用。取200 mg置于蒸餾水中用于粒徑分析。用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管從兔耳中動脈采集15 mL血液轉(zhuǎn)移至無菌離心管, 1 800 r/min離心8 min,將上層血漿轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管, 3 600 r/min離心8 min。棄去上層1/2的血漿,重懸底部黃白色沉淀,即得PRP。 PRP 加入微量凝血酶可成膠為PRG。

1.4 體外培養(yǎng)顆粒軟骨活性評估

將研磨的軟骨顆粒平均分成6 份,每份約200 mg,在六孔板中進行培養(yǎng)。每2～3 d更換培養(yǎng)基,分別于第1、 7、 14 天用0.2% Ⅱ型膠原酶消化過夜。用含血清的培養(yǎng)基終止消化,通過70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后,收集細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min。用300 μL PBS重懸細(xì)胞,與PI避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀分析活死細(xì)胞的比例。

1.5 可注射移植體的制備及表征

對照組(n=5)為500 mg的顆粒軟骨,裝入2.5 mL的注射器中以備裸鼠注射;實驗組(n=5)分別按照60%、 80%以及100%質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)混合PRP與顆粒軟骨,加入微量凝血酶成膠后測定強度以篩選最佳比例,以最佳比例的移植體裝入2.5 mL的注射器以備注射。實驗組移植體用4%多聚甲醛固定48 h,梯度脫水后噴金,掃描電鏡觀察。

1.6 裸鼠注射移植

麻醉裸鼠,碘伏棉球擦拭皮膚,裝有移植體的2.5 mL注射器更換16G無菌針頭,刺入皮下后水平行進至距離進針點2 cm時將移植體擠出。逆著進針方向緩慢抽出針頭,消毒進針口。在8 周解剖分離標(biāo)本,直接稱量記錄濕重,以排水法重復(fù)測量體積記錄并對大體輪廓拍照后4%多聚甲醛固定,梯度脫水,二甲苯透明(2 次),石蠟包埋進行組織切片,分別行HE和番紅染色。

1.7 裸鼠鼻背增高功能模型構(gòu)建

根據(jù)前期結(jié)果,選用實驗組構(gòu)建裸鼠鼻背增高模型(n=5)。麻醉裸鼠,消毒皮膚,將移植體注射入鼻背皮下,抽出針頭,消毒皮膚。記錄注射前后和8 周時的裸鼠鼻背形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 顆粒軟骨活性分析及移植體表征

手動切割的軟骨碎塊(圖1A)經(jīng)過低溫研磨的流程成為白色粉末狀態(tài)的顆粒軟骨(圖1B)。研磨所得顆粒主要分布區(qū)間在15～126 μm,呈近似正態(tài)分布,平均直徑約為76 μm(圖1C)。體外培養(yǎng)實驗中,隨著時間加長顆粒軟骨中細(xì)胞的存活率逐漸上升。在第1 天僅為74.5%,第7 天為80.7%, 第14 天達(dá)到88.1%(圖1D)。對照組移植體呈現(xiàn)流動態(tài)而難以成型(圖1B);實驗組移植體成膠后可以維持形態(tài)((圖2B),掃描電鏡結(jié)果顯示顆粒軟骨被大量纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)連接而形成整體,隨著顆粒軟骨含量增高,纖維蛋白的比例逐漸減少(圖2A);壓縮強度測試顯示80%質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)的移植體在同等大小應(yīng)力下具有較小的應(yīng)變量(圖2C),其彈性模量最高為210 kPa(圖2D)。80%質(zhì)量分?jǐn)?shù)移植體具有最佳的力學(xué)性能,后續(xù)實驗采用該比例。

圖1 顆粒軟骨的制備與活性分析

圖2 可注射移植體的表征

2.2 移植體大體觀察

對照組移植體形態(tài)保持較差,移植物容易與周圍組織分離,表面無包膜,僅可見附著少量血管組織(圖3A);實驗組移植體形態(tài)保持良好,不易與周圍組織分離,表面被光滑的纖維膜包裹,其下有大量血管爬行(圖3D)。與對照組相比,實驗組移植體保留了更飽滿光滑的輪廓和合適的厚度,質(zhì)量保留率為81.64%,而對照組質(zhì)量保留率僅為75.50%(表1)。

表1 移植物的濕重、 體積和質(zhì)量保留率

圖3 可注射移植體的體內(nèi)評估

2.3 組織切片觀察

HE染色顯示,兩組移植體軟骨陷窩結(jié)構(gòu)清晰,實驗組可見大量毛細(xì)血管,而對照組僅偶見毛細(xì)血管。對照實驗組軟骨陷窩周圍陽性著色面積高于對照組,表明細(xì)胞活性更強。實驗組顆粒軟骨與纖維組織結(jié)合緊密,而對照組軟骨顆粒與纖維組織接觸松散(圖3B～3E)。在safranin O染色中,實驗組的陽性染色面積更大, 顯示顆粒軟骨的活性優(yōu)于對照組(圖3C～3F)。CD31免疫熒光染色進一步證實,實驗組移植體新生毛細(xì)血管數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組移植體(圖3G～3I)。

2.4 鼻背增高模型效果觀察

裸鼠鼻背增高模型證實,移植體在注射即刻形成了順應(yīng)鼻背自然曲度的形態(tài),達(dá)到顯著的增高效果(圖4A)。在8 周后,鼻背增高的厚度相較于注射即刻略有減小,但仍然保留了清晰的輪廓和自然的增高曲線(圖4B)。CT結(jié)果顯示了移植物與周圍組織的良好融合(圖4D)。大體觀察顯示移植體表面光滑,并有血管組織爬行,保證了移植體內(nèi)部的營養(yǎng)供應(yīng)(圖4E)。番紅O染色也顯示移植體重塑為一個形態(tài)自然的整體,切片局部證實了顆粒軟骨良好的生存活力(圖4C～4F)。

3 討 論

在頜面部修復(fù)中，平滑的輪廓和自然的形態(tài)是整復(fù)手術(shù)的終極目標(biāo)[15]。有研究利用軟骨細(xì)胞聚集體負(fù)載PRF的方式促進軟骨再生，但是該方法需要復(fù)雜的實驗室培養(yǎng)流程，短期內(nèi)難以實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[16]。目前而言，臨床上碎塊化軟骨的應(yīng)用更加普遍[17-18]。但已有報道是通過手動切割的方式實現(xiàn)軟骨的碎化，過程十分耗時，由此得到的顆粒大小也不均一[19]。在遠(yuǎn)期的效果中，軟骨顆粒大小的不均一會導(dǎo)致形態(tài)的不規(guī)則[20]。除此之外，軟骨經(jīng)過碎化后的移植活力也是影響遠(yuǎn)期效果的重要因素。關(guān)于碎化軟骨的活力也有相關(guān)報道，雖然其中有一些矛盾的結(jié)果，但是多數(shù)研究表明嚴(yán)重程度的擠壓和碎化會降低軟骨細(xì)胞的存活率[21-23]。除此之外，已有報道均是在常溫下對于軟骨組織進行擠壓和切割[24-25]。但已有報道均是在常溫下對于軟骨組織進行擠壓和切割。在本研究中，軟骨塊在低溫下進行物理研磨，有效避免了常溫下機械作用力對于細(xì)胞活力的損傷，流式細(xì)胞術(shù)分析也證實顆粒軟骨中的細(xì)胞存活率仍然能夠達(dá)到80%。

軟骨經(jīng)過顆?；幚碇髸蔀闊o定形狀態(tài),難以實現(xiàn)精確的形態(tài)塑造。許多報道通過筋膜包裹的方式來應(yīng)對這一問題[26-27],但是筋膜的獲取往往造成二次創(chuàng)傷,而且筋膜隔絕了移植體與受體部位的直接接觸導(dǎo)致其組織融合緩慢。利用筋膜包裹移植體也需要開放式的手術(shù)切口,手術(shù)瘢痕難以避免,難以滿足頜面部整復(fù)手術(shù)微創(chuàng)美觀的要求。本研究利用富血小板凝膠中的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)將顆粒軟骨連接為一個整體,解決了顆粒軟骨難以定型的問題,同時利用注射的方式可以避免瘢痕的產(chǎn)生。在動物實驗中,顆粒軟骨與PRG構(gòu)建的移植體展現(xiàn)了良好的形態(tài)維持和顯著的鼻背增高效果。同時可以看到PRG的加入也促進了移植體的血管化和組織融合,組織切片染色更證實了其對于顆粒軟骨活性保持的積極作用。

綜上所述,基于低溫研磨技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)軟骨組織的快速顆?；幚聿⒈ＷC其活性,與富血小板凝膠構(gòu)建的可注射式移植體能夠?qū)崿F(xiàn)更加微創(chuàng)的頜面部軟骨移植修復(fù)。