謝雨莎 張鵬程 田黎明1,,4* 柯 丹

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢，430065；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢，430022；3.武漢市第一醫(yī)院皮膚感染和免疫湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢,430022；4.湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所，湖北 武漢,430065；5.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶，400000）

黃褐斑是一種發(fā)生于皮膚光暴露部位的慢性色素沉著性疾病，目前認(rèn)為遺傳易感性、光暴露、性激素水平變化等是最主要的致病因素，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探索[1]。黃褐斑的治療以減少黑色素生成、消除炎性反應(yīng)、抑制血管增生、修復(fù)皮膚屏障、抗光老化為指導(dǎo)原則[2]。由于單一治療療效欠佳，目前常采用多手段聯(lián)合治療，其中加用中藥口服治療療效可觀[3-5]。桃紅四物湯是活血化瘀代表方，具有擴(kuò)張血管、抗感染、降脂、補(bǔ)充微量元素等作用[6]。目前已有研究證明，桃紅四物湯可以改善患者黃褐斑皮損狀況，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[7]。生物信息學(xué)分析相較于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)更加簡(jiǎn)便易行，是臨床研究中常用的分析手段，本研究擬采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建藥物活性成分互作網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)藥物主要活性成分與疾病核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度，以期尋找桃紅四物湯治療黃褐斑的核心靶點(diǎn)及相關(guān)通路，初步揭示桃紅四物湯治療黃褐斑的潛在分子機(jī)制，為中藥復(fù)方治療黃褐斑的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 桃紅四物湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）檢索桃紅四物湯中有效成分，以“桃仁、紅花、熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎”為檢索詞。根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)原理，以藥物口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出藥物有效成分并收集對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。以下五個(gè)數(shù)據(jù)庫用于收集活性化合物的靶標(biāo)：TCMSP 數(shù)據(jù)庫，Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，SymMap 數(shù)據(jù)庫，GeneCards 數(shù)據(jù)庫，STITCH 數(shù)據(jù)庫，比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD）。利用UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的靶基因，查詢不到的靶點(diǎn)通過PubChem 數(shù)據(jù)庫查詢SMILES 號(hào)后進(jìn)行預(yù)測(cè)，最后刪除最終仍無對(duì)應(yīng)基因名的靶蛋白。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

以“melasma”“chloasma”為關(guān)鍵詞，通過Drugbank數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫篩選黃褐斑相關(guān)疾病基因靶點(diǎn)，匯總并刪除重復(fù)基因。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將桃紅四物湯靶基因和黃褐斑靶基因?qū)胛⑸牌脚_(tái)，繪制韋恩圖。將兩者交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因間蛋白互作分析，物種限定為Homo sapiens，設(shè)定置信度＞0.4 代表兩個(gè)蛋白間有互作關(guān)系，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用工具CytoNCA 分析各靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，以網(wǎng)絡(luò)中各靶基因的節(jié)點(diǎn)連接度值（Degree）為指標(biāo)，篩選出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。

1.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

基于桃紅四物湯活性成分與黃褐斑靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)中各靶基因的節(jié)點(diǎn)連接度值（Degree）為指標(biāo)，篩選出前10 位中藥活性成分。

1.5 GO 分析與KEGG 富集分析

使用Metascape 數(shù)據(jù)庫對(duì)交集基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析。按P 值升序排序，對(duì)GO 分析中的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）均取前10 個(gè)條目，KEGG 富集結(jié)果選擇前20 個(gè)條目，制作成氣泡圖做可視化處理。

1.6 分子對(duì)接

從PDB 數(shù)據(jù)庫下載PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心蛋白的pdb 格式文件，再從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載網(wǎng)絡(luò)圖中Degree 值前10 的藥效分子的sdf 格式文件。利用AutoDockTools 1.5.7 軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)化后進(jìn)行分子對(duì)接模擬，再用PyMol 2.5.4 對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 桃紅四物湯活性成分及靶點(diǎn)篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到桃紅四物湯中成分730 個(gè)，其中桃仁66 個(gè)，紅花189 個(gè)，熟地黃76 個(gè)，白芍85 個(gè)，當(dāng)歸125 個(gè)，川芎189 個(gè)，以“OB≥30%和DL≥0.18”為條件篩選并剔除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分后，得到桃紅四物湯有效成分共58 個(gè)，見表1。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫、SymMap 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫、STITCH 數(shù)據(jù)庫、CTD數(shù)據(jù)庫中篩選出作用靶點(diǎn)，去重后經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫查詢簡(jiǎn)化得到桃紅四物湯靶點(diǎn)基因11 139 個(gè)。

表1 桃紅四物湯有效成分及編號(hào)

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選

在Drugbank 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、TTD 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫以“Melasma”“Chloasma”為關(guān)鍵詞，篩選并去重后收集到黃褐斑靶點(diǎn)基因55 個(gè)。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

將桃紅四物湯的11 139 個(gè)靶點(diǎn)和黃褐斑的55 個(gè)靶點(diǎn)輸入微生信平臺(tái)，繪制韋恩圖，兩者交集為桃紅四物湯活性成分與黃褐斑的共同靶點(diǎn)，共53 個(gè)，見圖1。圖中粉色代表桃紅四物湯活性成分靶基因，綠色代表黃褐斑靶基因，二者交集為桃紅四物湯活性成分-黃褐斑共同靶基因。將篩選出的交集靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白互作分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，每條邊則表示蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)中共53 個(gè)節(jié)點(diǎn)，191 條邊，節(jié)點(diǎn)平均度為7.21。通過Cytoscape 3.9.1 軟件繪制桃紅四物湯-黃褐斑核心靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，其中ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 是桃紅四物湯作用于黃褐斑的核心靶點(diǎn)。

圖1 桃紅四物湯-黃褐斑交集靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Cytoscape PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

網(wǎng)絡(luò)圖共包括115 個(gè)節(jié)點(diǎn)，485 條相互作用關(guān)系，見圖4。圖中紅色代表疾病，綠色代表中藥，藍(lán)色代表藥物有效成分，黃色代表共有靶點(diǎn)。根據(jù)Degree 值篩選出關(guān)鍵活性成分主要為葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素、膽固醇、黃芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。

圖4 “桃紅四物湯-活性成分-靶點(diǎn)-黃褐斑”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 分析與KEGG 富集分析

GO 分析結(jié)果顯示，53 個(gè)交集靶點(diǎn)基因在509 個(gè)生物過程（BP）、32 個(gè)細(xì)胞組成（CC）和47 個(gè)分子功能（MF）中顯著富集，共588 個(gè)條目（P＜0.01）。治療靶點(diǎn)集中于黑素小體、黑素顆粒、囊泡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等區(qū)域，主要針對(duì)信號(hào)受體配體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合等過程發(fā)揮作用。每個(gè)模塊分別根據(jù)P 值升序排序取前10 位繪制氣泡圖，見圖5。KEGG 通路富集分析共得到68 條信號(hào)通路，篩選升序排名前20 條條目繪制氣泡圖，見圖6，提示治療黃褐斑主要通過黑色素生成、雌激素信號(hào)通路、癌癥與其糖蛋白、甲狀腺激素信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、Rap1 信號(hào)通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路等途徑。

圖5 GO 分析

圖6 KEGG 富集分析

2.6 分子對(duì)接

將關(guān)鍵活性成分與核心靶基因進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。結(jié)合能＜0 表明配體和受體可以在沒有外力的情況下自發(fā)結(jié)合，一般認(rèn)為結(jié)合能＜-5 kcal/mol 表明配體與受體易于相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)，活性成分與核心靶蛋白對(duì)接結(jié)果均小于該值，顯示出良好的結(jié)合力和穩(wěn)定性，取對(duì)接結(jié)果最佳的前三位做可視化處理，結(jié)合模式見圖7。

圖7 部分藥物活性成分與靶點(diǎn)對(duì)接示意圖

表2 分子對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

黃褐斑是一種常見的獲得性色素沉著性疾病，多由暴露于外部因素、激素水平異常、遺傳易感性以及皮膚炎性反應(yīng)引起[8]。其病理表現(xiàn)為黑素細(xì)胞活化、纖維變性、基底膜帶改變、血管化增加以及肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)增加[9-10]。這提示黃褐斑不僅是一種局限于黑素細(xì)胞的疾病，更是一種光老化疾病[11]。桃紅四物湯已被發(fā)現(xiàn)具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血管微循環(huán)等作用[7]。目前用于多種皮膚病的臨床治療當(dāng)中，但其治療黃褐斑的機(jī)制尚未明確。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘出桃紅四物湯活性成分58個(gè)，對(duì)應(yīng)桃紅四物湯靶基因11 139 個(gè)，發(fā)掘黃褐斑疾病靶點(diǎn)55 個(gè)，兩者取交集得到53 個(gè)交集靶點(diǎn)。其中桃紅四物湯的核心成分為葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素、膽固醇、黃芩苷、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚。核心藥物活性成分主要可以分為以下幾類：①多酚類：槲皮素、（+）-兒茶素、木脂素、黃芩苷、木犀草素、山奈酚；②固醇類：膽固醇、β-谷甾醇；③萜類：β-胡蘿卜素；④維生素類：葉酸。多酚具有消除炎性反應(yīng)、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降糖降脂等多種作用，可以通過調(diào)控PKA/CREB/MITF 通路和ROS 的產(chǎn)生來抑制酪氨酸酶活性和黑色素生成，還能調(diào)節(jié)腸道屏障功能，通過腸腦軸對(duì)代謝、神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫產(chǎn)生影響[12-13]。研究表明，固醇類化合物與抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等多種作用有關(guān)，其中β-谷甾醇可以抑制腸道對(duì)膽固醇的吸收，膽固醇參與囊泡的合成與釋放，能調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)交流和分泌功能[14-15]。萜類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗癌、抗感染、保肝等[16]。類胡蘿卜素是膚色的影響因素之一，作為抗氧化劑抑制ROS起到光保護(hù)作用，還具有預(yù)防皮膚老化和皮膚癌的作用[17-18]。葉酸又稱維生素B9，參與光生物學(xué)過程，研究發(fā)現(xiàn)其可抑制ALB 的糖基化，減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞炎癥的發(fā)生，調(diào)節(jié)黑色素的生物合成[19-20]。

本研究通過富集分析與分子對(duì)接技術(shù)推測(cè)，桃紅四物湯可能通過調(diào)控ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等靶點(diǎn)，來干預(yù)黑色素生成、內(nèi)分泌抵抗、Rap1 信號(hào)通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路等生物過程，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)黃褐斑的治療作用。ALB 負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)人體生理功能，是人體血漿抗氧化能力的主力軍，已被廣泛用作血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、干擾素、白介素、抗體分子等的穩(wěn)定劑[21]。VEGFA 參與許多血管生成依賴性疾病的發(fā)生及其進(jìn)展，有研究報(bào)道，通過ATM-SerRS 通路介導(dǎo)可以控制紫外線暴露時(shí)VEGFA 的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防紫外線造成的血管生成相關(guān)病理變化的目的，如皮膚老化、皮膚腫瘤形成等[22]。此外，VEGF 還受ROS 水平的影響，ROS 導(dǎo)致的線粒體DNA 損傷會(huì)抑制VEGF 的上調(diào)，導(dǎo)致血管生成受損[23]。ESR1 參與雌激素分泌、內(nèi)分泌抵抗、乳腺癌等多個(gè)信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)內(nèi)分泌抵抗和腫瘤進(jìn)展，突變后能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄活性[24]。CD4 位于T 細(xì)胞表面，與免疫密切相關(guān)，已有研究發(fā)現(xiàn)光暴露導(dǎo)致的皮膚病變上的炎性浸潤(rùn)主要由CD4+T 細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞組成，這些細(xì)胞通過增強(qiáng)促炎介質(zhì)的合成，可以進(jìn)一步激活酪氨酸酶，從而促進(jìn)黑色素生成[25]。分子對(duì)接中CREB1 與藥物活性成分對(duì)接結(jié)果最優(yōu)，CREB1 是黑色素生成通路中的關(guān)鍵蛋白，通過促進(jìn)MITF 的表達(dá)激活酪氨酸酶，從而導(dǎo)致黑色素生成[26]。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，分析了桃紅四物湯作用于黃褐斑的相關(guān)靶點(diǎn)及通路，推斷桃紅四物湯活性成分葉酸、槲皮素、β-胡蘿卜素、（+）-兒茶素、木脂素等可通過調(diào)節(jié)ALB、VEGFA、CD4、ESR1、CREB1 等相關(guān)靶點(diǎn)達(dá)到抗凝血、抗黑素、抗感染、抗氧化和抗凋亡的作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)黃褐斑的治療作用。本研究為黃褐斑的中藥治療遣方用藥提供了借鑒，為課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。但本研究的結(jié)果受數(shù)據(jù)庫更新情況、數(shù)據(jù)庫間信息差異、疾病研究進(jìn)展等問題的限制，可能存在一定的偏倚，仍需要通過進(jìn)一步的臨床和實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。