劉姚 李彭生 張金云 陽(yáng)桂芳 張方秋 楊光

摘 要：【目的】為揭示無(wú)花果果實(shí)成熟的分子機(jī)制及無(wú)花果果實(shí)品質(zhì)改良和新品種選育提供參考。【方法】以不同成熟度（S1： 八成熟，S2： 九成熟，S3： 全熟）的‘芭勞奈無(wú)花果果實(shí)為材料，利用Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)de novo 組裝，對(duì)不同成熟度果實(shí)的Unigene 進(jìn)行比較，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子分析、GO 富集分析和KEGG 富集分析?！窘Y(jié)果】通過(guò)測(cè)序共獲得65 676 條Unigene序列，篩選出差異表達(dá)基因15 620 個(gè)，其中八成熟與九成熟果實(shí)有1 508 個(gè)差異表達(dá)基因，九成熟與全熟果實(shí)有11 385 個(gè)差異表達(dá)基因。GO 富集分析結(jié)果表明：八成熟與九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在核糖體相關(guān)的細(xì)胞組分以及糖酵解、ADP 和ATP 代謝等過(guò)程；九成熟與全熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在植物細(xì)胞壁相關(guān)的細(xì)胞組分以及果實(shí)成熟、發(fā)病原和谷氨酸代謝等過(guò)程。KEGG 分析結(jié)果表明：八成熟與九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、丙酮酸代謝、碳代謝和氨基酸合成代謝等途徑；九成熟與全熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、脂肪酸代謝、淀粉和蔗糖代謝以及氨基酸合成代謝等途徑?！窘Y(jié)論】篩選出的調(diào)控果實(shí)成熟的關(guān)鍵基因包括26 個(gè)與乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，44 個(gè)與ABA 合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因。

關(guān)鍵詞：無(wú)花果；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因；果實(shí)成熟度

中圖分類號(hào)：S663.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2023）03—0214—10

無(wú)花果Ficus carica 為桑科Moraceae 無(wú)花果屬Ficus 多年生灌木或小喬木，原產(chǎn)于地中海沿岸，是人類馴化較早的經(jīng)濟(jì)作物之一。其果實(shí)具有極高的營(yíng)養(yǎng)、保健和藥用價(jià)值，享有“21 世紀(jì)人類健康的守護(hù)神”“抗癌斗士”等稱號(hào)[1-2]。無(wú)花果是優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，為高端果樹(shù)品種，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力和價(jià)值[3]。然而，由于成熟的無(wú)花果皮薄多汁，采摘后易腐爛，果實(shí)保存期僅為2 ～ 3 d，嚴(yán)重制約了無(wú)花果大規(guī)模種植和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

根據(jù)成熟生理特性，水果可分為呼吸躍變型和非呼吸躍變型。呼吸躍變型果實(shí)成熟時(shí)，產(chǎn)生大量乙烯，呼吸速率急劇上升，具有較強(qiáng)后熟作用。例如，蘋(píng)果一般在成熟前采摘，在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中完成成熟過(guò)程。非呼吸躍變型果實(shí)在成熟過(guò)程中不出現(xiàn)乙烯釋放高峰和呼吸速率高峰，其發(fā)育和成熟無(wú)明顯階段性，無(wú)后熟現(xiàn)象。例如，草莓必須在完全成熟時(shí)采摘，若在未成熟時(shí)采摘，果實(shí)不能在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中完成成熟過(guò)程[4]。無(wú)花果則表現(xiàn)出特殊的雙重成熟機(jī)制：果實(shí)成熟的后期出現(xiàn)乙烯釋放高峰和呼吸速率高峰。無(wú)花果的果實(shí)成熟后迅速衰老，但無(wú)明顯的后熟現(xiàn)象，只有在樹(shù)上完熟后才能采摘，未成熟果實(shí)采摘后，通過(guò)乙烯處理難以誘導(dǎo)果實(shí)軟化成熟[5]。為了延長(zhǎng)保鮮時(shí)間，果農(nóng)往往根據(jù)經(jīng)驗(yàn)在無(wú)花果果實(shí)八成熟時(shí)采摘。

然而，八成熟與全熟的無(wú)花果果實(shí)間品質(zhì)差別較大。完熟果實(shí)的總糖含量、糖酸比和維生素C 含量顯著高于八成熟果實(shí)，糖酸比呈現(xiàn)跳躍式增長(zhǎng)[6]。市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果也顯示，消費(fèi)者更喜愛(ài)全熟的無(wú)花果果實(shí)[6-7]。無(wú)花果的果實(shí)品質(zhì)和保鮮時(shí)間的矛盾一直困擾著無(wú)花果種植者，限制了無(wú)花果的規(guī)模生產(chǎn)。近年來(lái)，有一些關(guān)于無(wú)花果果實(shí)采收成熟度及采后保鮮的研究報(bào)道，主要的采后保鮮方法包括氯化鈣浸泡、1- 甲基環(huán)丙烯（1-MCP）熏蒸、熱激處理、冷激處理、低溫保存以及過(guò)氧乙酸處理等[8]，但無(wú)法從根本上解決無(wú)花果儲(chǔ)存的問(wèn)題。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段篩選調(diào)控果實(shí)成熟的關(guān)鍵基因，解析無(wú)花果果實(shí)成熟的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于果實(shí)品質(zhì)改良和新品種選育具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是探究植物發(fā)育分子機(jī)制的重要技術(shù)方法[9-11]，已被廣泛應(yīng)用于文冠果[12]、杜仲[13]和忍冬[14] 等非模式植物果實(shí)發(fā)育機(jī)制的研究中。目前，有關(guān)無(wú)花果果實(shí)成熟機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為了探明無(wú)花果果實(shí)不同成熟階段基因表達(dá)情況，為深入開(kāi)展無(wú)花果果實(shí)成熟的分子調(diào)控機(jī)制研究提供參考，本研究中以無(wú)花果主栽品種‘芭勞奈為材料，使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)建立不同成熟度無(wú)花果果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選不同成熟度的差異表達(dá)基因，并進(jìn)行分類、富集分析，重點(diǎn)分析激素合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異表達(dá)基因。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試無(wú)花果果實(shí)采自廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院種質(zhì)資源圃（113°38′E′，23°20′N），無(wú)花果樹(shù)齡為4 a，品種為‘芭勞奈。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，采摘八成熟（S1）、九成熟（S2）和全熟（S3）的果實(shí)。每個(gè)時(shí)期設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)選取3 個(gè)植株的9 個(gè)果實(shí)（每植株3 個(gè)果實(shí)）。切除果實(shí)頭部和尾部，去除果皮，取中間直徑3 cm 左右的果肉部分，將每次重復(fù)的樣品充分混勻，用錫箔紙包裝后置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用EASYspin 植物RNA 快速提取試劑盒提取無(wú)花果果實(shí)的總RNA，使用Nano Photometer 分光光度計(jì)和Qubit 2.0 熒光計(jì)檢測(cè)總RNA 的純度和濃度，使用Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)RNA完整性。經(jīng)檢測(cè)合格的RNA 樣品用于cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，并將mRNA 片段化，以mRNA 短片段為模板，合成cDNA 的2 條鏈[15]。對(duì)雙鏈cDNA 進(jìn)行加工修飾，末端加poly（A）尾并連接測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，完成cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建[15]。采用HiSeq4000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由天津諾禾致源科技有限公司完成。

1.2.2 De novo 組裝

將經(jīng)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)去接頭和引物序列，過(guò)濾掉低質(zhì)量序列，即N 含量超過(guò)該read 堿基數(shù)的10%，或堿基數(shù)（Q ≤ 20）超過(guò)該條read 堿基數(shù)的50%，獲得高質(zhì)量序列[16]。使用Trinity 軟件對(duì)高質(zhì)量序列從頭組裝拼接獲得轉(zhuǎn)錄本序列[17]，然后使用corset 軟件去冗余，篩選最長(zhǎng)的Cluster序列作為Unigene[18]，進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 差異表達(dá)基因篩選及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

采用FPKM（fragments per kilobase of transcriptper million fragments mapped）法衡量基因的表達(dá)量，使用DESeq2 軟件分析不同成熟度果實(shí)樣品之間RNA 的差異表達(dá)情況[19-20]。設(shè)置Rf ＜ 0.05且|log2（Fc）| ≥ 1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)（Rf 為錯(cuò)誤率，Fc 為變化倍數(shù)），篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。使用iTAK 軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子[21]。根據(jù)PlnTFDB和PlantTFDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中定義好的轉(zhuǎn)錄因子家族及規(guī)則[22-23]，通過(guò)hmmscan 比對(duì)的方式鑒定差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.4 差異基因功能富集分析

使用DIAMOND Blastx 軟件將篩選的DEGs序列進(jìn)行GO 注釋和KEGG 注釋分析[24]，并采用clusterProfiler 軟件對(duì)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析[24]。通過(guò)差異基因表達(dá)分析和KEGG 通路富集分析，篩選無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中與乙烯和ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異基因[25]，使用Origin 軟件繪制差異基因熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)無(wú)花果果實(shí)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析，共獲得690 319 966 原始讀序，各樣品的有效堿基平均為10.95 G，測(cè)序錯(cuò)誤率為0.03% ～ 0.04%，Q20 堿基含量最小值為96.12%，Q30 堿基含量最小值為90.56%，GC 含量最小值為46.44%（表1）。經(jīng)組裝獲得65 676 個(gè)Unigenes 序列，平均長(zhǎng)度為1 873 bp，其中長(zhǎng)度不小于1 000 bp 的Unigenes 有43 070 條。一般而言，N50 長(zhǎng)度在800 bp 以上被認(rèn)為組裝序列的完整性較好。本研究中組裝獲得的序列N50 為2 638 bp（表2）。以上各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量可滿足后續(xù)分析的要求。

2.2 差異基因表達(dá)分析

通過(guò)比較不同成熟度的無(wú)花果果實(shí)的基因表達(dá)，共獲得15 620 個(gè)差異基因。與九成熟果實(shí)相比，八成熟果實(shí)有1 508 個(gè)差異基因，其中上調(diào)1 158 個(gè)，下調(diào)350 個(gè)。與全熟果實(shí)相比，九成熟果實(shí)有11 385 個(gè)差異基因，顯著多于與八成熟果實(shí)的差異基因，其中上調(diào)6 502 個(gè)，下調(diào)4 883 個(gè)。與全熟果實(shí)相比，八成熟果實(shí)差異基因最多，為13 932 個(gè)，其中上調(diào)7 986 個(gè)，下調(diào)5 946 個(gè)。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在八成熟和九成熟時(shí)期特異性差異表達(dá)的基因有274 個(gè)，在九成熟和全熟時(shí)期特異性差異表達(dá)的基因有1 219 個(gè)，在八成熟和全熟時(shí)期特異性差異表達(dá)的基因有3 462 個(gè)。此外在八成熟、九成熟、全熟時(shí)期有540 個(gè)共同差異表達(dá)的基因。

2.3 差異基因轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子。通過(guò)對(duì)不同成熟度無(wú)花果果實(shí)的差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，共獲得2 936 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。由圖1 可見(jiàn)，在八成熟和九成熟時(shí)期果實(shí)有113 個(gè)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)有678 個(gè)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子家族排名進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：在八成熟和九成熟時(shí)期顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中占比最高的是Jumonji 家族（11.5%），包含13 個(gè)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其次是NAC 和AP2/ERF-ERF 家族，占比均為8.85%；在九成熟和全熟時(shí)期顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中占比最高的是SET 家族（5.01%），包含34 個(gè)顯著差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其次是bZIP 和bHLH 家族，占比分別為4.57% 和4.42%。

2.4 差異基因的GO 富集分析

對(duì)不同成熟度無(wú)花果果實(shí)的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果表明，差異表達(dá)基因被富集到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能三大類。排名前50 的GO 組分如圖2 所示。在生物學(xué)過(guò)程方面，八成熟和九成熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、ADP 生成ATP、ADP 代謝、嘌呤核苷二磷酸代謝等過(guò)程，而九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在果實(shí)成熟、發(fā)病原和谷氨酸代謝等過(guò)程。在細(xì)胞組分方面，八成熟和九成熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在胞質(zhì)核糖體和核糖核蛋白體亞基，而九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在植物細(xì)胞壁、膜（質(zhì)膜和內(nèi)膜）及錨定組分。在分子功能方面，八成熟和九成熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在丙酮酸激酶活性、乙醇脫氫酶和NAD+ 活性以及堿金屬和鉀離子結(jié)合；而九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在神經(jīng)酰胺和二氫神經(jīng)酰胺葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性。

2.5 差異基因的KEGG 富集分析

對(duì)不同成熟度無(wú)花果果實(shí)的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，富集最顯著的20 條通路如圖3 所示。八成熟和九成熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、丙酮酸代謝、碳代謝和氨基酸合成代謝等途徑。九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、脂肪酸代謝、淀粉和蔗糖代謝以及氨基酸合成代謝等途徑。經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)途徑（脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和甘油脂代謝，以及4 個(gè)糖代謝相關(guān)途徑（淀粉和蔗糖的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換、其他多糖降解和其他類型的O- 聚糖生物合成）在九成熟和全熟時(shí)期果實(shí)的差異表達(dá)基因中特異性富集。

2.6 乙烯和ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)模式分析

在不同成熟度的無(wú)花果果實(shí)中，檢測(cè)到參與乙烯合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因共計(jì)26 個(gè)（圖4）。與八成熟果實(shí)相比，在九成熟果實(shí)中6 個(gè)乙烯合成相關(guān)基因均上調(diào)表達(dá)，包括1 個(gè)SAMS（Cluster-2772.0），1 個(gè)ACS（Cluster-16914.0），3 個(gè)ACO（Cluster-20160.0、Cluster-20160.1、Cluster-20160.2） 和1 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因（Cluster-14830.0）。與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中共檢測(cè)到12 個(gè)乙烯合成基因差異表達(dá)，5 個(gè)上調(diào)表達(dá)，包括2 個(gè)SAMS（Cluster-1868.0 和Cluster-9519.1）， 和3 個(gè)ACO（Cluster-20160.0、Cluster-20160.1 和Cluster-20160.2），7 個(gè)下調(diào)表達(dá)， 包括5 個(gè)SAMS（Cluster-12282.0、Cluster-12970.0、Cluster-17563.0、Cluster-30389.0 和Cluster-9519.0），2 個(gè)ACS（Cluster-16914.0 和Cluster-23294.0）。同時(shí)檢測(cè)到12 個(gè)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因差異表達(dá)，1 個(gè)ETR（Cluster-26426.3）下調(diào)表達(dá)，11個(gè)均上調(diào)表達(dá)，包括8 個(gè)CRT1（Cluster-17679.2、Cluster-17679.5、Cluster-21650.0、Cluster-21650.4、Cluster-21650.6、Cluster-26931.4、Cluster-30212.2和Cluster-30212.5），2 個(gè)MPK6（Cluster-23275.5和Cluster-23275.4）以及1 個(gè)EIN3（Cluster-20645.1）。

在不同成熟度的無(wú)花果果實(shí)中，檢測(cè)到參與ABA 合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異基因共計(jì)44 個(gè)（圖4）。與八成熟果實(shí)相比，在九成熟果實(shí)中檢測(cè)到6 個(gè)ABA 合成基因差異表達(dá)，5 個(gè)上調(diào)表達(dá)，包括4 個(gè)ZEP（Cluster-24371.5、Cluster-24371.6、Cluster-24371.7 和Cluster-30802.0）， 和1 個(gè)SDR（Cluster-13733.0），而1 個(gè)NCED（Cluster-4218.0）下調(diào)表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)到1 個(gè)ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因PP2C（Cluster-29918.2）下調(diào)表達(dá)。與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中檢測(cè)到13 個(gè)ABA 合成基因，7 個(gè)上調(diào)表達(dá)，包括5 個(gè)ZEP（Cluster-24371.0、Cluster-24371.1、Cluster-24371.4、Cluster-24371.5和Cluster-24371.7），2 個(gè)NCED（Cluster-31657.4和Cluster-4218.0），6 個(gè)下調(diào)表達(dá)，包括2 個(gè)ZEP（Cluster-30802.3 和Cluster-30802.4），2 個(gè)NCED（Cluster-10575.0 和Cluster-8141.0），1 個(gè)SDR（Cluster-12339.0）以及1 個(gè)AAO3（Cluster-7523.12）。

同時(shí)檢測(cè)到PP2C、SnRK2 和ABF 共28 個(gè)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。其中，20 個(gè)上調(diào)表達(dá)， 包括13 個(gè)PP2C（Cluster-9481.1、Cluster-9481.0、Cluster-7565.0、Cluster-29918.9、Cluster-29918.8、Cluster-29918.7、Cluster-29918.4、Cluster-29918.2、Cluster-29918.10、Cluster-29918.1、Cluster-19606.0、Cluster-26571.5 和Cluster-28800.8），5 個(gè)ABF（Cluster-18662.1、Cluster-27803.0、Cluster-27803.2、Cluster-27803.4 和Cluster-29950.4）以及2 個(gè)SnRK2（Cluster-25974.0 和Cluster-29585.3），8 個(gè)下調(diào)表達(dá)，包括3 個(gè)PP2C（Cluster-20288.0、Cluster-26431.7 和Cluster-28161.0）以及5 個(gè)SnRK2（Cluster-6322.0、Cluster-29585.8、Cluster-25108.0、Cluster-20892.1 和Cluster-20892.0）。

3 結(jié)論與討論

本研究中利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析了‘芭勞奈無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中基因表達(dá)的變化，共獲得15 620 個(gè)差異表達(dá)基因。八成熟和九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在核糖體細(xì)胞組分、糖酵解、ADP 和ATP 代謝等過(guò)程。九成熟和全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞壁相關(guān)組分以及果實(shí)成熟、發(fā)病原代謝等過(guò)程。KEGG 分析結(jié)果表明，八成熟與九成熟果實(shí)及九成熟與全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因均在糖酵解和氨基酸合成代謝途徑富集。在九成熟和全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因中，脂肪酸代謝、淀粉和蔗糖代謝途徑也顯著富集。通過(guò)進(jìn)一步篩選，獲得26 個(gè)與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因，獲得44 個(gè)與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因?；诒狙芯拷Y(jié)果，利用相關(guān)的激素或關(guān)鍵基因延長(zhǎng)無(wú)花果的保鮮時(shí)間，將是后續(xù)的重點(diǎn)研究工作。

通過(guò)對(duì)不同成熟度無(wú)花果果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得15 620 個(gè)差異表達(dá)基因。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，九成熟與全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因數(shù)量（11 385）是八成熟與九成熟果實(shí)差異表達(dá)基因數(shù)量（1 508）的7.5 倍，其中九成熟與全熟期果實(shí)的差異轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量（678 個(gè)）也顯著高于八成熟與九成熟果實(shí)差異轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量（113 個(gè)），說(shuō)明從九成熟至全熟轉(zhuǎn)變過(guò)程中，無(wú)花果基因表達(dá)十分活躍，果實(shí)內(nèi)部的代謝活動(dòng)更加旺盛，這可能與果實(shí)處于呼吸躍變時(shí)期有關(guān)[26]。

GO 分析結(jié)果表明，八成熟與九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在核糖體相關(guān)的細(xì)胞組分。果實(shí)成熟初期，核糖體蛋白基因可以在翻譯水平上進(jìn)一步調(diào)控成熟相關(guān)基因的翻譯效率[15]。九成熟和全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在植物細(xì)胞壁相關(guān)的細(xì)胞組分。完全成熟的無(wú)花果果實(shí)變軟，說(shuō)明細(xì)胞壁的細(xì)胞成分發(fā)生顯著變化。KEGG 分析結(jié)果表明，八成熟與九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在糖酵解、ADP 和ATP 代謝過(guò)程。有研究結(jié)果表明，果實(shí)開(kāi)始成熟時(shí)，糖酵解途徑的關(guān)鍵酶被活化，呼吸活性增強(qiáng)[27]，使葡萄糖分解生成ATP，為其他代謝活動(dòng)提供部分能量。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與果實(shí)成熟過(guò)程的生理特征變化一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠性。九成熟和全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因主要富集在果實(shí)成熟和發(fā)病原等途徑。推測(cè)由于成熟的無(wú)花果散發(fā)香氣，更易吸引果蠅等病蟲(chóng)從果孔入侵，因此發(fā)病原等途徑顯著富集。部分糖代謝有關(guān)途徑在九成熟和全熟期果實(shí)的差異表達(dá)基因中特異性富集，這可能與九成熟至全熟期間，無(wú)花果果實(shí)中淀粉開(kāi)始分解，葡萄糖和果糖等糖類快速積累有關(guān)[28]。在九成熟和全熟期果實(shí)中脂類相關(guān)代謝途徑也發(fā)生顯著變化，說(shuō)明脂類物質(zhì)的積累也與果實(shí)成熟密切相關(guān)。

乙烯是調(diào)控果實(shí)成熟的關(guān)鍵因素，是觸發(fā)呼吸躍變型果實(shí)成熟的重要啟動(dòng)因素[29]。呼吸躍變型果實(shí)中乙烯合成有2 個(gè)系統(tǒng)：系統(tǒng)Ⅰ負(fù)責(zé)生產(chǎn)低濃度的乙烯，具有自體抑制的特點(diǎn)，控制組織的基礎(chǔ)乙烯含量；系統(tǒng)Ⅱ在呼吸躍變期生產(chǎn)高水平的乙烯，具有自體催化的特點(diǎn)。已有報(bào)道驗(yàn)證植物內(nèi)源乙烯合成的限速酶ACC 合成酶（ACS）和ACC 氧化酶（ACO）調(diào)控番茄[30]、香瓜[31]、梨[32]、獼猴桃[33] 和蘋(píng)果[34] 等多種果實(shí)成熟。本研究中，在八成熟與九成熟果實(shí)的差異表達(dá)基因中6 個(gè)乙烯合成基因和1 個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因均上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明乙烯合成系統(tǒng)Ⅱ已經(jīng)開(kāi)始啟動(dòng)，加速乙烯合成。與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中Cluster-23294.0（ACS） 顯著下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明其可能僅參與乙烯合成系統(tǒng)Ⅰ，躍變期果實(shí)內(nèi)乙烯含量升高，負(fù)反饋調(diào)節(jié)ACS 下調(diào)表達(dá)。Cluster-20160.0，Cluster-20160.1 和Cluster-20160.2（ACO）在果實(shí)成熟過(guò)程（八成熟至全熟）一直上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明其同時(shí)參與乙烯合成系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ，促進(jìn)乙烯合成，刺激果實(shí)成熟。

乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯受體ETR[35] 與CTR1[36] 為負(fù)調(diào)控元件，下游的EIN2[37]、EIN3[38]和ERF[39] 在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起正調(diào)控作用。本研究結(jié)果與之相符，與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中乙烯負(fù)調(diào)控元件ETR 顯著下調(diào)，正調(diào)控元件MPK6 和EIN3 均顯著上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，促進(jìn)果實(shí)成熟。不同的是，在無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中，CTR1 顯著上調(diào)表達(dá)，這與其乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控作用相悖，推測(cè)乙烯調(diào)控?zé)o花果果實(shí)成熟可能存在新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型。

ABA 在水果成熟衰老調(diào)控過(guò)程中起著重要作用。內(nèi)源ABA 含量的升高以及外源ABA 處理均會(huì)導(dǎo)致水果成熟和果肉軟化[40]。張涵等[41] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA 處理能夠促進(jìn)無(wú)花果果實(shí)的成熟，ABA 抑制劑能抑制無(wú)花果果實(shí)的成熟。喬菡[42] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中，內(nèi)源ABA含量持續(xù)增加，ABA 與乙烯協(xié)同作用誘導(dǎo)果實(shí)成熟。目前，尚不清楚ABA 調(diào)控果實(shí)成熟的作用機(jī)制。本研究結(jié)果表明，在無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中，ABA 合成基因發(fā)生顯著變化。植物體內(nèi)ABA是在9- 順式環(huán)氧類胡蘿卜素脫氫酶（NCED）的作用下，由類胡蘿卜素合成而來(lái)，NCED 是調(diào)控ABA 生物合成的關(guān)鍵酶[43]。ABA 醛氧化酶（AAO）可將脫落醛轉(zhuǎn)化為ABA，是催化ABA 生物合成的最后一步，擬南芥AtAAO3 沉默后出現(xiàn)明顯的ABA 缺失[44]。本研究中，與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中檢測(cè)到4 個(gè)NCED 基因（2 個(gè)上調(diào)表達(dá)，2 個(gè)下調(diào)表達(dá)）和1 個(gè)AAO3 基因（下調(diào)表達(dá)）可能參與體內(nèi)ABA 合成調(diào)控。

本研究結(jié)果表明，在無(wú)花果果實(shí)成熟過(guò)程中，ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的PP2C、SnRK2 和ABF關(guān)鍵基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。PP2C 是ABA 信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控元件，SnRK2 是ABA 信號(hào)途徑的正調(diào)控元件。ABA 與受體結(jié)合，抑制PP2C 的酶活性，增加SnRK2 的酶活性，磷酸化下游目標(biāo)蛋白（ABF），ABA 信號(hào)通路被激活[45]。本研究中，與九成熟果實(shí)相比，在全熟果實(shí)中檢測(cè)到5 個(gè)ABF 顯著上調(diào)表達(dá)，表明ABA 的信號(hào)通路被激活。同時(shí)檢測(cè)到3 個(gè)PP2C（Cluster-20288.0、Cluster-26431.7 和Cluster-28161.0） 下調(diào)表達(dá)，2 個(gè)SnRK2（Cluster-25974.0 和Cluster-29585.3）上調(diào)表達(dá)，推測(cè)ABF 可能參與ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控?zé)o花果果實(shí)成熟。

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[ 本文編校：聞 麗]