王忠巧,高 妍,司峰志
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤之一,進(jìn)展快,復(fù)發(fā)率高,很多患者初次就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,探索NPC 進(jìn)展分子機(jī)制、 尋找新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。 微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)22nt 的非編碼RNA,參與調(diào)控癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)進(jìn)程。 研究顯示,miR-140-3p 在多種腫瘤組織中差異表達(dá), 參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[1~3]。Zou X 等[4]研究發(fā)現(xiàn),miR-140-3p 在NPC 患者血漿中低表達(dá),對(duì)NPC 具有一定的診斷價(jià)值。然而miR-140-3p 對(duì)NPC的作用及分子機(jī)制尚不明確。自噬是細(xì)胞的一種程序性死亡,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、藥物抵抗等[5]。 抑制自噬可促進(jìn)NPC 細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移,如Zhu Q 等[6]研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-106a-5p 可抑制NPC 細(xì)胞自噬產(chǎn)生,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。但也有文獻(xiàn)報(bào)道,抑制自噬可增強(qiáng)NPC 細(xì)胞的放化療敏感性[7]。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miRNA 參與了腫瘤細(xì)胞自噬的調(diào)控[8,9]。 筆者所在課題組前期通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn),miR-140-3p 與自噬相關(guān)基因5 (autophagy related genes 5,AGT5)存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn),而AGT5 在自噬發(fā)生中扮演著重要角色,因此推測(cè)miR-140-3p 可能通過(guò)靶向AGT5 調(diào)控細(xì)胞自噬影響NPC 進(jìn)展。 基于此, 筆者主要探討了miR-140-3p 對(duì)NPC 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為、自噬的影響及其與AGT5 的靶向調(diào)控關(guān)系,希望為NPC 的防治提供新的靶點(diǎn)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
人NPC 細(xì)胞——CNE2 細(xì)胞、 人鼻黏膜上皮細(xì)胞——HNEpC 細(xì)胞(北納生物,中國(guó))。
1.1.2 主要試劑
達(dá)氏修正伊氏培養(yǎng)液 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)(安徽白鯊生物科技有限公司,中國(guó));胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(百克賽斯生物科技有限公司,中國(guó));lipofectamine 8000(上海碧云天生物有限公司,中國(guó));TRizol(Invitrogen,美國(guó));引物序列、過(guò)表達(dá)(overexpression,OE)-AGT5 質(zhì)粒、OEAGT5 空載體、miR-140-3p 模擬物(mimic)質(zhì)粒、miR-140-3p 抑制劑(inhibitor)質(zhì)粒、miR-140-3p mimic 空載體及miR-140-3p inhibitor 空載體、 野生型(wild type,WT)-AGT5 載體、突變型(mutant,MUT)-AGT5載體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司,中國(guó));CCK-8(cell counting kit-8)檢測(cè)試劑盒(上海生物,中國(guó));CCK-8 試劑盒(杭州赫貝科技有限公司,中國(guó));雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(武漢科謹(jǐn)生物科技有限公司,中國(guó));兔抗人β-actin、微管關(guān)聯(lián)蛋白輕鏈3Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light,LC3Ⅰ)、 微管關(guān)聯(lián)蛋白輕鏈3Ⅱ (microtubule-associated protein 3 light,LC3Ⅱ)、AGT5、自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6 同系物1(ATG6 autophagy related 6 homolog,Beclin1)、p62、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒(上海碧云天生物有限公司,中國(guó))。
1.1.3 主要儀器
酶標(biāo)儀 (美谷分子, 中國(guó));NANOdrop 2000 儀(Bio-rad 公司,美國(guó));十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝膠電泳器械(上海懋康生物科技有限公司,中國(guó));天能VE-586 曝光機(jī)(上海天能科技有限公司, 中國(guó));ABI 7900 PCR 儀(ABI公司, 美國(guó));ARM200F 原子級(jí)分辨率透射電子顯微鏡(電子株式會(huì)社,日本)。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組
CNE2、HNEpC 細(xì)胞使用含有10%胎牛血清、0.1%青霉素/鏈霉素的DMEM 進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件:37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2,每隔2 d 更換新鮮培養(yǎng)液。取傳代3 次對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE2 細(xì)胞接種到6 孔板,細(xì)胞鋪滿(mǎn)50%板面積時(shí)使用lipofectamine 8000 將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為如下各組:miR-140-3p 組(轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 質(zhì)粒),si-miR-140-3p 組(轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 質(zhì)粒),miR-空白對(duì)照(negative control,NC)組 (轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic 空載體),NC 組 (轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 空載體),si-miR-140-3p+OE組(轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 質(zhì)粒、OE-AGT5 空載體),si-miR-140-3p + AGT5 組 (轉(zhuǎn)染miR-140-3p inhibitor 質(zhì)粒、OE-AGT5 質(zhì)粒)。 繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 CCK-8 測(cè)定細(xì)胞活力
制備單細(xì)胞懸液,按照8000/孔(每孔100 μL)的密度接種在96 孔板上, 并在體積分?jǐn)?shù)5 % CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育處理, 分別在24、48、72 h更換新鮮培養(yǎng)液,加入10 μL CCK-8 溶液,培養(yǎng)箱孵育3 h。孵育結(jié)束后采用酶標(biāo)儀在450 nm 處讀取各處理組細(xì)胞的光密度(optical density,OD)。 每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。
1.2.3 Tanswell 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲、遷移能力
對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn), 首先用無(wú)血清培養(yǎng)液配置基質(zhì)膠,向Tanswell 小室的上室中加入60 μL 基質(zhì)膠,放入培養(yǎng)箱中凝固,下室中加入10%胎牛血清,然后制備單細(xì)胞懸液;按照1×104個(gè)細(xì)胞接種到上室,培養(yǎng)48 h后去除培養(yǎng)液,棉簽拭去上室未穿的細(xì)胞,上室穿過(guò)去的細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定10 min,0.1 %結(jié)晶紫染色,光學(xué)顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。 對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn),上室中不加入基質(zhì)膠,其他步驟參考侵襲實(shí)驗(yàn)。
1.2.4 免疫熒光檢測(cè)自噬
制備單細(xì)胞懸液,按照1×104/孔(每孔200 μL)的密度接種在6 孔板, 并在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育處理24 h, 然后每孔加入1 μL Ad-mRFP-GFP-LC3B,繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后激光共聚焦采集圖像。
1.2.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 檢測(cè)miR-140-3p 和AGT5 mRNA 的表達(dá)。
使用TRizol 從各組細(xì)胞中提取總RNA, 測(cè)定濃度、純度。 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后PCR。 體系:cDNA 2 μL, 上下游引物各0.2 μL,2 ×Tip Green qPCR Sper Mix 5 μL, 焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水2.6 μL。條件:95 ℃2 min,95 ℃15 s,60 ℃15 s,共40 個(gè)循環(huán),構(gòu)建溶解曲線。2-△△Ct法表示基因相對(duì)含量。內(nèi)參選擇甘油醛3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、U6。
引物序列:AGT5,forward 5′-AGGCCTATGTGTTCACCTGC-3′,reverse 5′-CACATCTTGGCGCGAAAGTC-3′;miR-140-3p,forward 5′-GACCCAGTTCAAGTAATTCAG-3′,reverse CGAGCCAAGTAATGGAGAA-3′;GAPDH,forward 5′-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3′,reverse 5′-TACGACCAAATCCGTTGACTC-3′;U6,forward 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;reverse 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
1.2.6 Western blot
檢測(cè)AGT5、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1 和p62 蛋白表達(dá)。
將各處理組細(xì)胞裂解物通過(guò)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法進(jìn)行總蛋白定量,按照1 ∶4 的比例向上清液中加入5× 蛋白上樣緩沖液,并于沸水中加熱變性10 min。 取50 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離,采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,用5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后,分別加入AGT5(1 ∶1000)、LC3Ⅰ(1 ∶1000)、LC3Ⅱ(1 ∶1000)、Beclin1(1 ∶1000)及p62(1 ∶1000)一抗,在4 ℃條件下?lián)u床孵育過(guò)夜。 用Tris 鹽緩沖溶液-吐溫 (Tris-buffered saline Tween,TBST)溶液清洗3 次,每次5 min,以辣根酶標(biāo)記的二抗(1 ∶1000)室溫孵育1 h,以TBST 溶液清洗3 次,每次5 min。最后均勻滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)溶液后于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。 采用ImageJ 軟件測(cè)定條帶灰度值,以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin 的比值作為其相對(duì)表達(dá)量。 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。
1.2.7 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-140-3p 與AGT5 的靶向關(guān)系
使用TargetScan 在線網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-140-3p 與AGT5 的靶向關(guān)系。
1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告
在轉(zhuǎn)染前24 h,將CNE2 細(xì)胞以每孔1×104/mL細(xì)胞接種在24 孔板中。 將miR-NC 或miR-140-3p mimics 分別與WT-AGT5、MUT-AGT5 載體共轉(zhuǎn)染到CNE2 細(xì)胞中。 使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染后24 h 進(jìn)行熒光素酶分析。 螢火蟲(chóng)螢光素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)反應(yīng)的海腎螢光素酶活性。
使用Graphpad Prism 軟件8.0(Graphpad Software Inc.,美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 其中計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 兩組及多組間比較分別采用Student t 檢驗(yàn)、方差分析。 P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
miR-140-3p 表達(dá)水平比較
CNE2 細(xì)胞miR-140-3p、AGT5 蛋白及其mRNA表達(dá)水平低于HNEpC 細(xì)胞(P <0.01)。 見(jiàn)圖1、表1。
表1 CNE2、HNEpC 細(xì)胞AGT5 及miR-140-3p 表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of AGT5 and miR-140-3p in CNE2 and HNEpC cells
圖1 Western blot 檢測(cè)AGT5 蛋白表達(dá)電脈圖Fig. 1 Electrophoretograms of AGT5 protein expression detected by Western blot
miR-140-3p 組CNE2 細(xì)胞48 h、72 h 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移數(shù)低于miR-NC 組(P <0.01)。si-miR-140-3p 組CNE2 細(xì)胞48 h、72 h 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移數(shù)高于NC 組(P <0.01)。 見(jiàn)圖2 和表2、3。 說(shuō)明上調(diào)miR-140-3p 可抑制細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。
表3 miR-140-3p 對(duì)4 組CNE2 細(xì)胞侵襲、遷移影響的比較Tab.3 Comparison effect of miR-140-3p on invasion and migration in 4 groups of CNE2 cell
圖2 miR-140-3p 對(duì)CNE2 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響Tanswell 實(shí)驗(yàn)光學(xué)顯微鏡圖Fig.2 Tanswell experiment optical microscope images of miR-140-3p effect on proliferation,invasion and migration of CNE2 cells
miR-140-3p 組CNE2 細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平, 黃色熒光強(qiáng)度高于miR-NC 組,p62蛋白水平低于miR-NC 組(P <0.01);si-miR-140-3p組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平,黃色熒光強(qiáng)度低于NC 組,p62 蛋白水平高于NC 組 (P <0.01)。見(jiàn)圖3、4 和表4。 說(shuō)明miR-140-3p 可促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。
表4 4 組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison expression levels of autophagy-related protein in 4 groups
圖3 Western blot 檢測(cè)4 組CNE2 細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的電泳圖Fig. 3 Electrophoretograms of autophagy-related protein expression in 4 groups of CNE2 cell detected by Western blot
圖4 4 組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果比較Fig.4 Comparison results of immunofluorescence detection of autophagy-related protein expression in 4 groups
2.4.1 3 組敲低miR-140-3p 后細(xì)胞增殖、 侵襲及遷
移比較
si-miR-140-3p + OE 組細(xì)胞48 h、72 h 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)高于NC 組(P <0.01);si-miR-140-3p+AGT5 組細(xì)胞48 h、72 h 細(xì)胞增殖、侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)低于si-miR-140-3p+OE 組(P <0.01)。 見(jiàn)圖5 和表5、6。
表5 下調(diào)AGT5 逆轉(zhuǎn)miR-140-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)3 組CNE2 細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞增殖的比較Tab.5 Comparison down-regulation of AGT5 reverses miR-140-3p overexpression on proliferation of CNE2 cells at different times in 3 groups
表6 下調(diào)AGT5 逆轉(zhuǎn)miR-140-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)3 組CNE2 細(xì)胞侵襲及遷移影響的比較Tab.6 Comparison of down-regulation of AGT5 reversed effect of miR-140-3p overexpression on invasion and migration in 3 groups of CNE2 cell
圖5 下調(diào)AGT5 逆轉(zhuǎn)miR-140-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)3 組CNE2 細(xì)胞侵襲及遷移Tanswell 實(shí)驗(yàn)光學(xué)顯微鏡圖Fig. 5 Tanswell experiment optical microscope images of down-regulation of AGT5 reversed effect of miR-140-3p overexpression on invasion and migration in 3 groups of CNE2 cell
2.4.2 3 組miR-140-3p 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞自噬比較
si-miR-140-3p+OE 組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白水平、黃色熒光強(qiáng)度低于NC 組,p62 蛋白水平高于miR-NC 組(P <0.01);si-miR-140-3p+ AGT5 組細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1 蛋白水平、黃色熒光強(qiáng)度高于si-miR-140-3p + OE 組,p62 蛋白水平低于miR-NC 組(P <0.01)。 見(jiàn)圖6、7 和表7。
表7 3 組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較Tab.7 Comparison expression levels of autophagy-related proteins in 3 groups
圖6 Western blot 檢測(cè)miR-140-3p 對(duì)3 組CNE2 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoretograms of autophagy-related protein expression of miR-140-3p in 3 groups of CNE2 cell detected by Western blot
圖7 miR-140-3p 對(duì)3 組CNE2 細(xì)胞自噬表達(dá)影響的免疫熒光圖Fig.7 Immunofluorescence images of miR-140-3p on autophagy expression in 3 groups of CNE2 cells
miR-140-3p 組細(xì)胞AGT5 蛋白水平高于miRNC 組(0.95±0.11 vs 0.45±0.07)(P <0.01),si-miR-140-3p 組細(xì)胞AGT5 蛋白水平低于NC 組(0.12±0.02 vs 0.46±0.06)(P <0.01)。 TargetScan 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-140-3p 與AGT5 mRNA 存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-140-3p+WT-AGT5 組細(xì)胞熒光素酶活性高于miR-NC + WT-AGT5 組(1.75 ± 0.06 vs 1.00 ± 0.01)(t = 20.540,P <0.01),miR-140-3p + MUT-AGT5 組細(xì)胞熒光素酶活性與miR-NC + MUT-AGT5組比較(1.00±0.02 vs 1.00±0.01),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。 見(jiàn)圖8。
圖8 4 組細(xì)胞AGT5 蛋白表達(dá)電泳圖和miR-140-3p 與AGT5 的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)Fig.8 Electrophoretograms of AGT5 protein expression and nucleotide binding sites of miR-140-3p and AGT5 in 4 groups
NPC 是耳鼻喉最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一, 其在中國(guó)的發(fā)病率、死亡率逐漸升高,盡管多種治療方法在一定程度上改善了患者預(yù)后,但總體預(yù)后不佳。 NPC的進(jìn)展涉及多種基因調(diào)控,異質(zhì)性高。 因此探索NPC發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制,對(duì)于腫瘤的防治、改善患者預(yù)后至關(guān)重要。
miRNA 在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要功能, 隨著對(duì)miR-140-3p 研究的深入,miR-140-3p 在腫瘤中的作用越來(lái)越清楚,如Wang Y 等[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-140-3p 過(guò)表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、 侵襲。 此外,miR-140-3p 在胃癌組織中低表達(dá),上調(diào)miR-140-3p可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力[11]。 然而miR-140-3p 與NPC 生物學(xué)行為的關(guān)系尚不清楚。 有文獻(xiàn)報(bào)道,NPC 患者血漿miR-140-3p 低表達(dá), 診斷NPC的效能良好[12]。 筆者研究結(jié)果顯示,NPC 細(xì)胞miR-140-3p 表達(dá)水平低于正常鼻腔黏膜細(xì)胞,提示miR-140-3p 可能參與了NPC 發(fā)生。 為明確miR-140-3p對(duì)NPC 細(xì)胞的影響, 筆者所在課題組構(gòu)建了miR-140-3p 過(guò)表達(dá)、敲低NPC 細(xì)胞株,結(jié)果顯示,上調(diào)miR-140-3p 可抑制NPC 細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力, 反之下調(diào)miR-140-3p 可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力,這與其他腫瘤相關(guān)研究結(jié)果基本一致。
自噬是一種保守的分解代謝過(guò)程,參與細(xì)胞許多生理過(guò)程。 自噬發(fā)生過(guò)程中,細(xì)胞質(zhì)成分被溶酶體蛋白酶溶解。 此外,自噬有助于去除受損的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)聚集體,從而緩解細(xì)胞應(yīng)激并維持體內(nèi)平衡。 最近研究發(fā)現(xiàn), 自噬在NPC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色,如鄭方靜等[13]研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-216a 可誘導(dǎo)NPC 細(xì)胞自噬的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、侵襲及血管合成。 也有文獻(xiàn)報(bào)道,miR-197-3p 可抑制NPC細(xì)胞自噬,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型,增強(qiáng)放射治療敏感性[14]。 有研究發(fā)現(xiàn),抑制自噬可增強(qiáng)NPC 的化學(xué)治療敏感性[15]。 這些研究說(shuō)明,自噬在NPC 發(fā)生發(fā)展及治療中扮演著重要角色。 鑒于自噬在NPC 中的作用,筆者觀察了miR-140-3p 與NPC 自噬的關(guān)系。LC3 是自噬小體上的膜蛋白,在自噬泡形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用, 自噬形成后,LC3Ⅰ經(jīng)泛素化修飾形成LC3Ⅱ,被認(rèn)為是自噬的標(biāo)記物[16]。 p62 在自噬小體與溶酶體融合后被降解,因此自噬發(fā)生時(shí)p62 蛋白水平減少[17]。 Beclin1 可誘導(dǎo)自噬泡的形成,可促進(jìn)自噬的形成。 筆者研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-140-3p 可促進(jìn)LC3Ⅱ、Beclin1 表達(dá),抑制p62 表達(dá),提示miR-140-3p 誘導(dǎo)了腫瘤自噬產(chǎn)生,反之下調(diào)miR-140-3p 得到相反的結(jié)果。
ATG5 位于人體染色體6q21 位點(diǎn), 在自噬小體形成過(guò)程中,ATG5 蛋白可與ATG12 形成復(fù)合物,錨定于自噬泡膜上,促進(jìn)自噬體膜的延伸,促進(jìn)自噬體形成[18]。 大量研究發(fā)現(xiàn),ATG5 與惡性腫瘤進(jìn)展、化學(xué)治療抵抗有關(guān)[19,20]。但ATG5 與NPC 的關(guān)系尚不清楚,筆者研究結(jié)果顯示,NPC 細(xì)胞ATG5 蛋白表達(dá)水平低于正常鼻腔黏膜細(xì)胞, 提示ATG5 可能參與了NPC發(fā)生。 多種miRs 與ATG5 存在靶向調(diào)控關(guān)系[21,22],既然miR-140-3p 可調(diào)控自噬, 因此筆者猜測(cè)miR-140-3p 與ATG5 可能存在靶向關(guān)系。 筆者研究結(jié)果顯示,miR-140-3p 與ATG5 mRNA 存在核苷酸結(jié)合位點(diǎn), 進(jìn)一步熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩者存在靶向關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 上調(diào)miR-140-3p 可促進(jìn)NPC 細(xì)胞ATG5 蛋白表達(dá),反之下調(diào)miR-140-3p 抑制NPC細(xì)胞ATG5 蛋白表達(dá)。最后回復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,上調(diào)ATG5可逆轉(zhuǎn)敲低miR-140-3p 對(duì)NPC 細(xì)胞自噬的抑制作用。 通過(guò)以上結(jié)果證明miR-140-3p 可通過(guò)正性調(diào)控ATG5 介導(dǎo)的自噬。
總之,miR-140-3p 可正性靶向調(diào)控ATG5,進(jìn)而抑制NPC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及自噬。 miR-140-3p 有望成為NPC 防治的一個(gè)靶點(diǎn)。