仝曉鑫，李惠敏，翟青梅，張璐涵，丁桂鳳

子代臍帶血中的造血干細(xì)胞具有強(qiáng)大的造血重建能力， 目前臍帶血造血干細(xì)胞已在臨床上廣泛應(yīng)用，可用于治療免疫缺陷性疾病、血液病、代謝類疾病等[1，2]。 臍帶血的質(zhì)量直接關(guān)乎于干細(xì)胞移植治療效果[3]。 研究表明，有核細(xì)胞總數(shù)和白細(xì)胞分化抗原34+（cluster differentiation 34+，CD34+） 造血干細(xì)胞數(shù)量是反映臍帶血質(zhì)量的重要指標(biāo)[4]，其數(shù)量主要與移植機(jī)體接受速度、患者生存期長短和中性粒細(xì)胞恢復(fù)顯著相關(guān)。 因此臍帶血庫應(yīng)優(yōu)先選擇有核細(xì)胞總數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)量較高的臍帶血，具體標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)由各個(gè)臍帶血庫因具體情況制定。筆者探究妊娠及圍產(chǎn)期因素對(duì)子代臍帶血CD34+造血干細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇烏魯木齊市婦幼保健院2021 年5 月至2022 年5 月收治的無先天性疾病的健康孕婦120例，采取其分娩新生兒的臍帶血作為研究對(duì)象，其中男性60 例，女性60 例；新生兒體質(zhì)量2500 ～4000 g。 所有入組孕婦均簽署知情同意書，該研究已獲筆者所在醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血采集

子代臍帶血由固定護(hù)士在醫(yī)院手術(shù)室或者產(chǎn)房收集120 份， 在新生兒斷臍后10 s 內(nèi)進(jìn)行臍帶血采集，每份大約2 ～3 mL。采集子代臍帶血時(shí)，穿刺位置選取距離胎盤斷端約5 ～8 cm 的位置， 用碘伏消毒2 遍后，用穿刺針頭呈小角度或斜頭朝下刺入，出血后沿血管壁順行1 ～2 cm，采集子代臍帶血。 采集完成后用止血鉗夾閉穿刺位置雙端的血管，采血過程中進(jìn)行混勻以防血液凝固，記錄好樣品基本信息，暫時(shí)儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，盡快在24 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用XE-2100 全自動(dòng)血液分析儀對(duì)子代臍帶血中的有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次及以上測(cè)量，取平均值作為數(shù)據(jù)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34+造血干細(xì)胞

采用流式細(xì)胞分析儀（美國，DxP Athena）進(jìn)行檢測(cè)。 流式細(xì)胞術(shù)至少需要約2×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行上機(jī)操作，因此，首先使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出樣品所需量。 向樣品中加入20 μL 藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記CD34（CD34-PE）和10 μL多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PercP）標(biāo)記CD45（CD45-Per-CP），用渦旋振蕩儀進(jìn)行振蕩混勻， 避光條件下靜置10 min。 在1000 g 條件下離心5 min，吸棄上清液，加入1 mL 磷酸鹽緩沖溶液重懸細(xì)胞，之后上機(jī)檢測(cè)。用Flow Jo 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，若CD34 陽性、CD45 弱陽性、 前向角散射較淋巴細(xì)胞較大的細(xì)胞則判定為CD34+細(xì)胞，計(jì)算CD34+細(xì)胞的占比，則為CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例。 CD34+細(xì)胞數(shù)量則為有核細(xì)胞總數(shù)×CD34+細(xì)胞占有核細(xì)胞比例。

1.2.4 信息采集與分析

收集新生兒及產(chǎn)婦的臨床資料，主要包括孕母年齡、孕母血型（A 型/B 型/O 型/AB 型）、孕母身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、孕母過敏史、妊娠期糖尿?。ㄓ?無）、妊娠期高血壓（有/無）、分娩方式（剖宮產(chǎn)/順產(chǎn)）、產(chǎn)次（1/2/3）、孕周（＜37 周/＞37 周）、新生兒性別（男/女）、新生兒體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、胎膜早破（有/無）、羊水污染（有/無）、臍帶繞頸（有/無）等信息。其中妊娠期因素由筆者所在醫(yī)院產(chǎn)科醫(yī)生進(jìn)行診斷，圍產(chǎn)期因素由產(chǎn)科醫(yī)生和新生兒科醫(yī)生共同診斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均值± 標(biāo)準(zhǔn)差，組間采取成組t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)表示，組間采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。 皮爾遜卡方檢驗(yàn)則描述兩個(gè)連續(xù)變量之間的相關(guān)性。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期因素對(duì)臍帶血CD34+造血干細(xì)胞的影響

調(diào)查的妊娠期因素主要有孕母年齡、 孕母血型、孕母BMI、孕母過敏史、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、分娩方式、產(chǎn)次和孕周。 其中孕母平均年齡為30 歲，因此將孕母年齡按照30 歲進(jìn)行分組，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)孕母年齡和臍帶血中有核細(xì)胞數(shù)和CD34+細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)， 即孕母年齡＞30 歲時(shí)， 臍帶血的CD34+細(xì)胞數(shù)較多；另外，孕周也與臍帶血的有核細(xì)胞數(shù)和CD34+細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。而其他妊娠期因素與臍帶血的有核細(xì)胞數(shù)和CD34+細(xì)胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 見表1。

表1 妊娠期因素與臍帶血中有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)的關(guān)系[M（P25，P75）]Tab.1 Relationship between pregnancy factors and number of nucleated cells and CD34+hematopoietic stem cells in umbilical cord blood[M(P25,P75)]

2.2 圍產(chǎn)期因素對(duì)臍帶血CD34+造血干細(xì)胞的影響

圍產(chǎn)期因素主要包括新生兒性別、 新生兒體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、胎膜早破、羊水污染、臍帶繞頸。其中新生兒體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量分別按照平均值進(jìn)行分組比較，其他因素則為定性資料。經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，圍產(chǎn)期因素與臍帶血的有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)均無關(guān)。 見表2。

表2 圍產(chǎn)期因素與臍帶血中有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)的關(guān)系[M（P25，P75）]Tab. 2 Relationship between perinatal factors and number of nucleated cells and CD34+hematopoietic stem cells in umbilical cord blood[M(P25,P75)]

3 討論

臍帶血造血干細(xì)胞的首次成功移植是在1988 年由Gluckman E 等[5]對(duì)范科尼貧血患兒進(jìn)行的治療。目前臍帶血在臨床上應(yīng)用廣泛，從臍帶血中獲得的造血干細(xì)胞已治愈許多例血液系統(tǒng)惡性腫瘤或其他影響造血功能的遺傳性疾病[6～8]。 子代臍帶血已成為替代骨髓的造血干細(xì)胞的重要來源。 臍帶血具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如可簡(jiǎn)單快速獲得、可長期保存、被外界環(huán)境污染的發(fā)生率低、排異反應(yīng)發(fā)生率較低、被移植患者的生存質(zhì)量高等[9～11]。 目前，中國多地已構(gòu)建有臍帶血庫， 其很大程度上促進(jìn)了造血干細(xì)胞移植的發(fā)展，增強(qiáng)了其移植成功率和覆蓋面，且降低了治療費(fèi)用。 因此，在各方面提高收集到的子代臍帶血治療具有重要意義[12]。

筆者研究分析妊娠因素和圍產(chǎn)因素對(duì)子代臍帶血中有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)的影響，以進(jìn)一步提高臍帶血庫收集樣品的質(zhì)量。有研究報(bào)道產(chǎn)婦年齡與CD34+造血干細(xì)胞數(shù)無明顯的相關(guān)性，但賀晶等[13]研究發(fā)現(xiàn)孕母年齡與臍帶血的CD34+造血細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系， 筆者研究得出結(jié)果與之一致，據(jù)此分析，可能孕母年齡越大、體內(nèi)自由基較多，則刺激臍帶血產(chǎn)生造血干細(xì)胞則較多。 另外，多項(xiàng)研究表明妊娠期高血壓或糖尿病等并不會(huì)影響臍帶血的有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)[14]。 影響臍帶血造血干細(xì)胞的妊娠期因素?fù)?jù)報(bào)道還有分娩方式等，有研究表明剖宮產(chǎn)患者的臍帶血CD34+造血干細(xì)胞數(shù)多于順產(chǎn)，但也有研究得出相反的結(jié)論[15]，或者得出生產(chǎn)方式并不影響臍帶血造血干細(xì)胞的結(jié)果[16]。 在筆者研究中，調(diào)查結(jié)果表明生產(chǎn)方式等其他因素并不影響臍帶血造血干細(xì)胞數(shù)量，這與部分研究結(jié)果一致。另外，筆者研究發(fā)現(xiàn)孕周越大，則有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)越多，分析其原因可能是隨著孕周的增加胎兒的血液循環(huán)發(fā)育愈發(fā)完善。 另一方面，筆者研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期因素包括新生兒性別、新生兒體質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、胎膜早破、羊水污染、臍帶繞頸均不影響臍帶血的有核細(xì)胞數(shù)和CD34+造血干細(xì)胞數(shù)量，這與部分研究結(jié)果一致[17]，但也有研究表明新生兒體質(zhì)量與CD34+造血干細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)[18]，還有研究表明臍帶繞頸的新生兒的CD34+造血干細(xì)胞數(shù)更多[19]。 分析不同研究得出不一致的原因有收樣規(guī)模和樣品之間存在個(gè)體差異性，筆者研究中納入新生兒發(fā)生臍帶繞頸的例數(shù)較少，且大多數(shù)僅繞頸1 周，很少可以引起臍帶壓迫，也因此很少引起臍帶血的血流動(dòng)力學(xué)的改變。筆者研究仍存在一些不足，納入樣本量較少，另外還有很多其他影響因素例如胎齡[20]、單雙胎[21]、胎盤形態(tài)、受孕方式、孕母煙酒史、分娩時(shí)間等未納入研究。

綜上所述，筆者研究發(fā)現(xiàn)臍帶血中CD34+造血干細(xì)胞數(shù)量隨孕母年齡和孕周增加而增多，這為提高臍帶血庫的樣品質(zhì)量提供了理論依據(jù)。因此臍帶血庫在篩選臍帶血造血干細(xì)胞提供者時(shí)，也可將孕周和孕母年齡納入作為考量因素。