袁西倫，王文斌，吳劍英

透明質(zhì)酸鈉（sodium hyaluronate，SH）于1934 年被發(fā)現(xiàn)[1]，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基葡糖胺之間通過糖苷鍵相互交聯(lián)的多糖[2，3]。 其主要用在骨關(guān)節(jié)炎治療、眼科、外科手術(shù)防粘連、醫(yī)學(xué)美容、化妝品等領(lǐng)域[4～8]。

文獻(xiàn)研究報(bào)道，SH 的結(jié)構(gòu)中存在大量羥基，在溶液中SH 能夠形成許多氫鍵[9～12]。 在氫鍵及范德華力的作用下，SH 分子形成了二級(jí)雙螺旋結(jié)構(gòu)，提高了穩(wěn)定性[10，12，13]。 二級(jí)結(jié)構(gòu)通過生物化學(xué)作用在體內(nèi)形成網(wǎng)狀三級(jí)結(jié)構(gòu)[13～18]。

SH 的降解是從長鏈大分子裂解成小的鏈段反應(yīng)，是聚合物的破壞反應(yīng)，其降解主要表現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular mass，Mr） 的變化，de Melo BAG 等[9]進(jìn)行了在高溫（60 ℃）及高pH（pH 12）條件下SH 的降解動(dòng)力學(xué)研究。 Mondek J 等[19]研究了在37 ℃及120 ℃條件下對(duì)SH 粉末及溶液的穩(wěn)定性的影響。 筆者通過分子排阻色譜法實(shí)驗(yàn)檢測SH 的Mr，考察不同溫度下的熱穩(wěn)定性， 并建立降解動(dòng)力學(xué)模型。 另外，筆者還進(jìn)行了SH 經(jīng)高溫作用后的穩(wěn)定性研究， 結(jié)合文獻(xiàn)分析其熱穩(wěn)定性變化的可能內(nèi)在原因，為SH 的生產(chǎn)、研究提供理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

SH（上海利康瑞生物工程有限公司，中國）。

1.1.2 主要試劑與儀器

磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉（湖南九典宏陽制藥有限公司，中國）；氯化鈉（江蘇勤奮藥業(yè)有限公司，中國）；聚苯乙烯磺酸鈉對(duì)照品（北京潤匯源公司，中國）。

Agilent 1100 型液相色譜系統(tǒng)、G1362A 示差折光檢測器（安捷倫科技公司，美國）；Shodex SB-806HQ（300 mm × 8.0 mm）凝膠柱（Agilent Technologies，美國）；DHG-9245A 電熱恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國）；Memmert hpp750 恒溫恒濕箱（美墨爾特公司，德國）；RFM-1.2 通風(fēng)式干燥滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，中國）；XPR105DR 天平（梅特勒-托利多公司，瑞士）；RCT 5 D S025 磁力攪拌臺(tái)（艾卡公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 透明質(zhì)酸鈉在不同溫度下的穩(wěn)定性考察

稱取適量的SH 原料（1%）、磷酸氫二鈉（0.054%）、磷酸二氫鈉（0.00017%）、氯化鈉（0.85%）和適量注射用水，配成含1%SH 溶液，用西林瓶分裝；分別在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃下進(jìn)行穩(wěn)定性考察，不同時(shí)間點(diǎn)取樣，檢測SH 的Mr。

1.2.2 121 ℃高溫滅菌后透明質(zhì)酸鈉穩(wěn)定性考察

按照1.2.1 節(jié)配制方法配制SH 溶液， 用西林瓶分裝； 在121 ℃下，F(xiàn)0= 8 進(jìn)行高溫滅菌， 然后在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以及未滅菌的樣品在25 ℃下進(jìn)行穩(wěn)定性考察， 不同時(shí)間點(diǎn)取樣，檢測SH 的Mr。

1.2.3 透明質(zhì)酸鈉相對(duì)分子質(zhì)量檢測方法

采用分子排阻色譜法 （《中國藥典》2015 年版四部通則0514）檢測SH 的Mr。

色譜條件：Shodex SB-806HQ（300 mm×8.0 mm）凝膠柱，0.2 mol/L 氯化鈉溶液（含0.01%NaN3）溶液為流動(dòng)相，柱溫40 ℃，流速為0.5 mL/min，示差折光檢測器。

操作步驟：取樣品適量，加流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL SH 溶液作為供試品溶液，取聚苯乙烯磺酸鈉對(duì)照品適量，加流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度0.5 mg/mL聚苯乙烯磺酸鈉溶液為對(duì)照品溶液； 取供試品溶液、對(duì)照品溶液各100 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）專用軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算SH 的Mr。

1.2.4 透明質(zhì)酸鈉降解動(dòng)力學(xué)模型構(gòu)建

采用阿倫尼烏斯（Arrhenius）[20～22]動(dòng)力學(xué)方程建立SH 降解動(dòng)力學(xué)模型。

一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式（1），轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)形式方程式（2），對(duì)SH 的Mr 與時(shí)間（t）的關(guān)系按照一級(jí)反應(yīng)方程式（2）進(jìn)行擬合。

式中：Mr 為任意時(shí)間SH 的相對(duì)分子質(zhì)量；Mr0為Mr的起始值；k 為相應(yīng)條件下反應(yīng)降解速率常數(shù)；t 為穩(wěn)定性考察時(shí)間。

阿倫尼烏斯（Arrhenius） 動(dòng)力學(xué)方程式（3），其對(duì)數(shù)形式為方程式（4），利用不同溫度下SH 的降解常數(shù)與相應(yīng)的絕對(duì)溫度按方程式（4）進(jìn)行擬合，計(jì)算得活化能Ea（kJ/mol），建立SH 的降解動(dòng)力學(xué)方程。

式中：k 為反應(yīng)降解速率常數(shù)；A 為前因子；Ea 為活化能（kJ/mol）；R 為氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T 為絕對(duì)溫度（K）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin2021 軟件進(jìn)行繪圖、相關(guān)動(dòng)力學(xué)分析與回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 透明質(zhì)酸鈉在不同溫度下相對(duì)分子質(zhì)量變化

2.1.1 透明質(zhì)酸鈉的相對(duì)分子質(zhì)量與溫度和時(shí)間的關(guān)系

SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃條件下， 其Mr 隨時(shí)間的變化趨勢逐漸下降 （圖1）； 在60 ℃、80 ℃條件下，其Mr 隨時(shí)間的變化趨勢逐漸下降（圖2）。

圖1 SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下Mr 隨時(shí)間變化趨勢圖Fig.1 Trend graph of Mr of SH changed with time at 100 ℃,115 ℃and 121 ℃

圖2 SH 在60 ℃、80 ℃下Mr 隨時(shí)間變化趨勢圖Fig. 2 Trend graph of Mr of SH changed with time at 60 ℃and 80 ℃

2.1.2 透明質(zhì)酸鈉的對(duì)數(shù)相對(duì)分子質(zhì)量與時(shí)間和溫度關(guān)系

將SH 的lnMr 與時(shí)間（t）做線性擬合，其具有較高的相關(guān)性，說明SH 的熱降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)；圖3是SH 在60 ℃、80 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖， 圖4是SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖。

圖3 SH 在60 ℃、80 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.3 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 60 ℃and 80 ℃

圖4 SH 在100 ℃、115 ℃、121 ℃下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.4 Linear fitting plot of lnMr-t at 100 ℃,115 ℃and 121 ℃

2.1.3 透明質(zhì)酸鈉在不同溫度的降解常數(shù)與溫度關(guān)系

SH 在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃的降解常數(shù)與溫度關(guān)系見表1， 根據(jù)阿倫尼烏斯（Arrhenius）動(dòng)力學(xué)方程式（4）做lnk-1/T×1000 的線性擬合（圖5）。根據(jù)線性擬合得到的斜率計(jì)算，得到SH 的熱降解活化能Ea=120.012 kJ/mol，SH 熱降解動(dòng)力學(xué)方程式為lnk=lnA-120.012/RT。 筆者實(shí)驗(yàn)的SH 熱降解活化能與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，董科云等[23]研究的SH 熱穩(wěn)定性降解活化能為116 ～118 kJ/mol，T?mmeraas K 等[22]研究的在濃度0.1 mol/L HCl 中SH 降解活化能為137 kJ/mol，Caspersen MB 等[24]在pH值中性條件下SH 降解活化能為127 kJ/mol。

圖5 SH 的lnk-1/T×1000 線性擬合圖Fig.5 Linear fitting plot of lnk-1/T×1000 of SH

2.2 121 ℃滅菌后透明質(zhì)酸鈉的穩(wěn)定性

根據(jù)阿倫尼烏斯（Arrhenius）理論計(jì)算得到了SH熱降解動(dòng)力學(xué)方程式，這樣就可以推算出SH 在不同溫度下的穩(wěn)定性，但根據(jù)中國藥品監(jiān)督管理局法規(guī)要求，用于注射用的藥品、醫(yī)療器械盡可能地進(jìn)行終端滅菌。 經(jīng)過121 ℃高溫滅菌后SH 穩(wěn)定性如何，是否與該熱降解動(dòng)力學(xué)模型一致。 為此，進(jìn)行了121 ℃高溫作用后SH 的穩(wěn)定性研究。

SH 注射液經(jīng)121 ℃、F0=8 min 滅菌后，在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃進(jìn)行穩(wěn)定性考察， 考察SH Mr 的變化。 50 ℃和60 ℃，進(jìn)行l(wèi)nMr-t 的線性擬合（圖6），其相關(guān)系數(shù)（R2）分別是0.80870、0.99016，60 ℃具有較好的相關(guān)性，屬于一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，而50 ℃條件下其線性相關(guān)性較差。 表明高溫作用后的SH 在50 ℃條件下的穩(wěn)定性，其熱降解不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 40 ℃穩(wěn)定性考察的lnMr-t 的線性擬合（圖7），其R2是0.84761，相關(guān)性較差；將Mr 與t 關(guān)系按照ExpDec1模型進(jìn)行非線性擬合（圖8），R2=0.98016，具有較好的相關(guān)性， 說明高溫作用后SH 在40 ℃條件下降解也不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 經(jīng)高溫滅菌和未滅菌的SH 在25 ℃穩(wěn)定性考察，進(jìn)行l(wèi)nMr-t 線性擬合（圖9），其R2分別是0.32102 和0.98985。 結(jié)果表明，未經(jīng)高溫作用的SH 在25 ℃條件下的lnMr-t 線性良好（R2=0.98985），其熱降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 而高溫作用后SH 在25 ℃條件下的lnMr-t 相關(guān)性較差（R2=0.32102）， 將其Mr 與t 按照ExpDec2 模型進(jìn)行非線性擬合（圖10）， 擬合結(jié)果為R2=0.99331，具有很好的相關(guān)性， 說明經(jīng)高溫作用后SH 在25 ℃條件下的降解也不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

圖6 滅菌后SH 在50 ℃、60 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig.6 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 50 ℃and 60 ℃after sterilization

圖7 滅菌后SH 在40 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig. 7 Linear fitting plot of lnMr-t of SH at 40 ℃after sterilization

圖8 高溫滅菌后SH 在40 ℃條件下Mr-t 的曲線擬合圖Fig. 8 Curve fitting plot of Mr-t of SH at 40 ℃after high-temperature sterilization

圖9 高溫滅菌后和未滅菌的SH 在25 ℃條件下lnMr-t 的線性擬合圖Fig. 9 Linear fitting plot of lnMr-t at 25 ℃for SH after hightemperature sterilization and non-sterilization

圖10 高溫滅菌后SH 在25 ℃條件下Mr-t 的曲線擬合圖Fig.10 Curve fitting plot of Mr-t of SH at 25 ℃after high-temperature sterilization

3 討論

已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了SH 的熱穩(wěn)定性研究，但至今未檢索到SH 經(jīng)過高溫滅菌（121 ℃）后其穩(wěn)定性變化的研究。 筆者通過SH 高溫滅菌后不同溫度條件下穩(wěn)定性的研究，結(jié)合文獻(xiàn)分析其熱穩(wěn)定性變化的可能內(nèi)在原因，為SH 的生產(chǎn)、研究提供理論指導(dǎo)。

在60 ℃、80 ℃、100 ℃、115 ℃和121 ℃下SH Mr的lnMr 與t 的線性擬合R2分別是0.98877、0.99976、0.97869、0.98149 和0.98926，均具有較好的相關(guān)性，屬于一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)，其熱降解活化能Ea =120.012 kJ/mol，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

經(jīng)高溫滅菌后（121 ℃），SH 在25 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃下Mr 的lnMr 與t 的線性擬合相關(guān)系數(shù)（R2）分別是0.32102、0.84761、0.8087 和0.99016，除60 ℃具有較好的線性相關(guān)性，屬于一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)，其他25 ℃、40 ℃、50 ℃下其線性相關(guān)性都較差，不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)， 而未經(jīng)過高溫作用的SH 在25 ℃穩(wěn)定性的線性R2是0.98985，具有較好的相關(guān)性，其降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 從上可以看出， 經(jīng)高溫作用后，SH 的熱穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)發(fā)生了變化。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，SH 結(jié)構(gòu)中存在大量羥基，SH 中可以形成許多氫鍵， 氫鍵對(duì)SH 的穩(wěn)定性起到關(guān)鍵作用。Scott JE、Tigwell MJ[10]研究表明，在室溫下，SH 很穩(wěn)定，即使使用高碘酸氧化，其降解也很慢；在37 ℃時(shí)，SH 的構(gòu)象發(fā)生改變， 其氫鍵處于可能過渡態(tài)狀態(tài)，可能空間位阻效應(yīng)和過渡態(tài)能量都對(duì)抗性糖胺聚糖的氧化起作用，SH 中的氫鍵活化能大約為8.4 ～12.6 kJ/mol，SH 的氧化之前需要先破壞聚合物乙二醇基中羥基的氫鍵, 多篇文獻(xiàn)表明[12，25，26]，SH 在溶液中發(fā)生可逆構(gòu)象轉(zhuǎn)變。筆者實(shí)驗(yàn)及多篇文獻(xiàn)[22，23，27]都表明，50 ℃時(shí)Mr 下降不明顯；＞60 ℃時(shí)，SH 的分解速率隨溫度呈指數(shù)增長。 這可能是SH 的氫鍵作用，在＞60 ℃時(shí)，其氫鍵被打開，SH 的穩(wěn)定性很差；在＜60 ℃、＞37 ℃時(shí)，SH 的構(gòu)象發(fā)生改變，其氫鍵處于可能過渡態(tài)狀態(tài)；＜37 ℃時(shí)， 由于氫鍵作用，SH 很穩(wěn)定；SH 在溶液中，隨著溫度的變化，其氫鍵（斷開-耦合）、構(gòu)象，會(huì)發(fā)生可逆轉(zhuǎn)變。

經(jīng)過高溫滅菌后的SH 在60 ℃以上的條件下，其打開的氫鍵可能很難再恢復(fù)，其穩(wěn)定性主要受到了60 ℃的環(huán)境因素影響，降解很快，其穩(wěn)定性的lnMr-t線性擬合的R2達(dá)到0.99016，具有很好的相關(guān)性，降解仍然屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 而當(dāng)?shù)陀?0 ℃后，SH 的氫鍵、構(gòu)象具有可逆轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)，其氫鍵可能會(huì)逐步恢復(fù)，氫鍵處于過渡狀態(tài)，加上穩(wěn)定性的環(huán)境溫度等多重因素影響， 在早期其降解速度也較快，4 ～6 個(gè)月后，被打開的氫鍵逐步恢復(fù)，其相對(duì)分子質(zhì)量下降也逐步變慢；因?yàn)檫@些多重因素的影響，其降解不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。 另外，未經(jīng)過高溫作用的SH 在25 ℃穩(wěn)定性考察中，由于其氫鍵未經(jīng)高溫?cái)嚅_，其穩(wěn)定性的lnMr-t 線性擬合的R2是0.98985， 具有較好的相關(guān)性，其降解很慢，也屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)；從另外一個(gè)維度可能也說明，由于高溫對(duì)其氫鍵的作用，經(jīng)高溫作用后的SH 穩(wěn)定性與未經(jīng)過高溫作用的SH 不一樣。 因此，高溫作用后的SH 穩(wěn)定性，在＞60 ℃仍符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)機(jī)制；＜60 ℃的穩(wěn)定性， 可能由于氫鍵處于過渡態(tài)， 其早期降解速度也較快，4 ～6 個(gè)月后，被打開的氫鍵可能逐步恢復(fù)， 其Mr 下降也逐步變慢，因?yàn)槎嘀匾蛩氐挠绊?，其降解不屬于一?jí)動(dòng)力學(xué)。 至于經(jīng)高溫作用后SH 熱穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)變化的真正內(nèi)在原因還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

經(jīng)高溫作用后SH 熱穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化的發(fā)現(xiàn)，這對(duì)SH 制備、研究有一定的指導(dǎo)意義。 在進(jìn)行SH 的生產(chǎn)時(shí)，為了減少SH 的降解，盡量在＜60 ℃的條件下進(jìn)行，最好在＜37 ℃下制備；進(jìn)行SH 注射液仿制藥研究時(shí)（法規(guī)要求高溫濕熱滅菌），由于從市場上購買的參比制劑（高溫濕熱滅菌）一般都是在生產(chǎn)日期后6 個(gè)月以上的，其Mr 已經(jīng)快速下降，因此購買的參比制劑不能從0 d 開始進(jìn)行穩(wěn)定性考察，也無法做到從生產(chǎn)日期開始就進(jìn)行對(duì)比研究，因此只能從參比制劑生產(chǎn)日期開始后相對(duì)應(yīng)的月份進(jìn)行穩(wěn)定性對(duì)比研究。

4 結(jié)論

SH 的熱降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)機(jī)制， 不同溫度的降解常數(shù)也符合阿倫尼烏斯（Arrhenius）反應(yīng)動(dòng)力學(xué)定律，SH 的熱降解活化能Ea=120.012 kJ/mol， 與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

高溫作用后的SH 穩(wěn)定性，在＞60 ℃屬于一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)；但＜60 ℃時(shí)，SH 的初始降解速度也較快，4 ～6 個(gè)月后，其Mr 下降逐步變慢，其降解不屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

高溫作用后的SH 熱穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)變化， 對(duì)其SH 制備、研究具有一定指導(dǎo)意義。 在進(jìn)行SH 的生產(chǎn)時(shí)，盡量在＜60 ℃條件下進(jìn)行，最好在＜37 ℃下制備。進(jìn)行SH 注射液等仿制藥研究時(shí)，只能從參比制劑生產(chǎn)日期開始后相對(duì)應(yīng)的月份進(jìn)行穩(wěn)定性對(duì)比研究。