夏緒紅 劉慶蘭 陶小慶

（貴州省銅仁市檢驗檢測院，貴州銅仁 554300）

藤茶（Ampelopsis grossedentata）又稱莓茶、白毛猴，是一種顯齒蛇葡萄科的藥食兩用植物，廣泛分布在我國西南及中部的山林地區(qū)[1]。藤茶葉是藤茶入藥和食用的主要部分，為二回羽狀復葉，基部一對小葉常為3 小葉或稀為羽狀復葉，小葉長橢圓形或卵圓形，長4～12 cm，寬2～6 cm，頂端漸尖，基部微心形或圓形，邊緣每側(cè)有3～15個粗鋸齒[1-2]。藤茶具有清熱利濕、平肝降壓和活血通絡的功效，可用于治療痢疾、泄瀉、小便淋痛和頭昏目脹等疾病[2]。研究表明，藤茶含有超過10種礦物質(zhì)，其中鐵、銅、錳、鋅和硒的含量較高[1]；天然野生藤茶有消炎止咳作用，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有明顯的抑制作用[3]；藤茶的主要功能成分包括氨基酸、黃酮類及礦物質(zhì)等，其中黃酮類物質(zhì)含量豐富[3-4]，總黃酮含量超過總多酚的45%，其中二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）含量相對較高，可達葉干重的25%～35%（w/w）[5]。DMY又稱蛇葡萄素，屬于黃酮類有機化合物，分子式為C15H12O8，化學式為（2R，3R）-3，5，7-三羥基-2-（3，4，5-三羥基苯基）苯并二氫吡喃-4-酮[1，6]。研究表明，DMY 是藤茶的主要生理活性成分，具有抗氧化[3]、預防心血管疾病[7]、緩解糖尿病[8]、抗血栓[9]以及調(diào)節(jié)腸道菌群[10]等功效。DMY可以防治肝纖維化及脂肪肝，通過降低導致肝纖維化TGFβ1 的水平，降低肝臟內(nèi)丙二醛含量，提高機體抗氧化水平從而防治肝纖維化[3，11]；DMY 還可以通過降低肝臟腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平，降低脂質(zhì)沉積來保護肝臟[6]。此外，DMY具有廣譜抑菌效果，對金色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌等細菌均有抑制作用[12]，其通過抑制菌體的呼吸代謝、破壞菌體的結構形態(tài)及改變細胞膜的滲透性[3-4]等發(fā)揮抑菌功能。

作為茶飲，藤茶口味獨特，加之其獨特的保健作用，具有很好的市場潛力。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類藤茶中的DMY含量存在一定差異[13-14]。但對不同產(chǎn)地、不同采收時間和不同等級藤茶之間的DMY 含量差異研究相對較少。

本試驗通過收集具有代表性的a、b、c 及d 區(qū)域的不同時期3 種不同類型（按等級分）的藤茶（葉為主），采用熱水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用HPLC 分析不同藤茶中DMY 的含量，為藤茶引種、種植及加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

試劑：甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）；DMY 對照品（98%，上海莼試生物技術有限公司）。

設備：高效液相色譜儀（Thermo UtiMate3000）；電子天平（1/105，梅特勒—托利多）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速粉粹機（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）；隔膜真空泵（GM-0.33A，天津市津騰實驗設備有限公司）；色譜柱：Diamonsil 5um C18（2），150×4.6 mm（3859090）。

1.2 試驗材料

本試驗所用藤茶來源于a區(qū)域某生物科技有限公司、b 區(qū)域藤茶生物科技有限公司、c 區(qū)域藤茶茶業(yè)廠、d 區(qū)域藤茶有限公司。4 月采摘時間為20—26 日，5 月采摘時間為23—29 日，6 月采摘時間為21—28日，7月采摘時間為20—25日。不同等級藤茶的分級標準[1-2，12]如表1所示，分級特征如圖1所示。

圖1 藤茶分級參考標準

表1 藤茶等級分級標準

1.3 試驗方法

1.3.1 DMY 的提取DMY 的提取方法參照文獻[13]并適當修改。精確稱取1.0 g 干燥藤茶葉，按料液比（1∶100，w∶v）加入70 ℃的熱水，磁力攪拌下浸提40 min。浸提結束后進行抽濾，濾渣按上述方法浸提一次并抽濾，合并濾液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1/2 體積，將濃縮液以0.22 μm 濾頭過濾后貯藏（-20 ℃），待測。

1.3.2 DMY 含量的測定DMY 含量的測定參照文獻[14]，采用液相色譜法測定藤茶原料中DMY 的含量，具體條件如下。

（1）色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇∶0.05%磷酸（55∶45）為流動相；檢測波長291 nm；理論塔板數(shù)按DMY計算應不低于3 000。

（2）對照品溶液的制備。精密稱取DMY對照品20.0 mg，置25 mL 量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 mm濾膜過濾，制成0.8 mg/mL貯備液，測定時從貯備液中吸取1～10 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制得0.08 mg/mL DMY 對照溶液，備用。

（3）供試品溶液的制備。將干燥藤茶待檢樣品或藤茶植物干燥嫩莖葉粉碎后過60目篩，精密稱定0.5 g 置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲30 min，放置室溫，用甲醇定容至25 mL，搖勻后精密量取樣液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 mm濾膜過濾后備用。

（4）分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定；本品按干燥品計算，含DMY不得低于18%。

采用外標法計算供試品溶液中DMY含量，樣品中DMY含量（W）計算公式如下。

式中，A1為樣品溶液中DMY 的峰面積；AS為對照品溶液中DMY 的峰面積；C為對照品溶液中的質(zhì)量濃度（mg/mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理每次試驗重復3 次，結果以均值±標準差表示，數(shù)據(jù)單因素方差分析采用SPSS 22.0軟件，并利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同產(chǎn)地不同等級藤茶中DMY含量

不同產(chǎn)地不同等級藤茶中DMY 含量如圖2 所示。不同區(qū)域相同等級藤茶中含DMY 含量范圍為23%～36%，其中a 區(qū)域藤茶的DMY 含量最高，特級藤茶達到36.2 g/100 g dw，與其他地區(qū)同等級的DMY含量存在顯著差異，其次為d區(qū)域和c區(qū)域產(chǎn)藤茶，DMY含量在31.0～32.0 g/100 g dw；b區(qū)域產(chǎn)藤茶含量最低，平均28.5 g/100 g dw。相同區(qū)域不同等級藤茶之間DMY含量也存在不同程度的差異，特級藤茶最高，一級藤茶次之，二級藤茶最低，均未達到顯著差異。

圖2 不同區(qū)域不同等級藤茶DMY含量

2.2 不同采摘時間的藤茶中DMY含量

不同區(qū)域不同等級藤茶在不同采摘時間的DMY 含量如圖3 所示。不同區(qū)域在相同采摘時間的DMY 含量具有明顯差異，均表現(xiàn)為a 區(qū)域藤茶中DMY 含量最高，c、d 區(qū)域藤茶中DMY 含量次之，b 區(qū)域藤茶中DMY 含量略低；相同區(qū)域中各同等級藤茶在不同采摘時間之間的DMY 含量無顯著差異。

圖3 不同區(qū)域不同等級藤茶在不同采摘時間的DMY含量

3 結論與討論

不同區(qū)域藤茶干物質(zhì)中DMY 含量在21.2～36.2 g/100 g，相同等級藤茶中，a 區(qū)域產(chǎn)藤茶DMY含量最高，可達30.9～36.2 g/100 g；相同產(chǎn)地不同等級藤茶之間，特級藤茶DMY 含量高于一、二級藤茶，但未達到顯著水平。這與相關研究結論相符，Ye 等[14]檢測藤茶中DMY 含量為22.6%（w/w），Hu等[15]在廣西藤茶中DMY 含量檢測中，得出含量為12.2%（w/w），Li 等[16]采用微波輔助提取法提取武夷山藤茶時，通過優(yōu)化提取條件，DMY 最高提取率可達85%，Zhen 等[17]采用超聲提取法提取藤茶DMY，提取率可達86%。即不同產(chǎn)地和不同提取方法可能影響DMY 的提取率，進而影響分析結果。同時，提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比和pH等因素對DMY 的提取率均有不同程度的影響[16-18]。值得注意的是，不同品種及不同采收時間也可能會影響藤茶中各類化學成分的含量及檢測結果。

本研究結果中，相同產(chǎn)地相同等級藤茶之間，不同采摘時間的藤茶DMY含量沒有明顯差異，這與相關研究結論[19-20]存在差異，胡百順等[20]發(fā)現(xiàn)藤茶DMY、花旗松素、多酚及DMY異構體含量在5月最高。產(chǎn)生差異的主要原因可能是本研究中藤茶樣品在試驗期間保存不夠嚴格，早期采摘藤茶樣品中黃酮可能被氧化降解，最終導致不同采摘時間樣品間的差異不顯著[21]。不同產(chǎn)地及不同等級藤茶之間的DMY含量存在明顯差異，實際應用中可根據(jù)需求加以選擇。

不同產(chǎn)地相同等級藤茶之間DMY 含量存在顯著差異，相同產(chǎn)地不同等級藤茶之間也有差異，而不同采摘時間之間沒有顯著差異。即產(chǎn)地和等級對藤茶DMY 含量具有顯著的影響。根據(jù)相關研究[6，14]，產(chǎn)生差異的主要原因可能是不同區(qū)域藤茶所處的氣候環(huán)境不同，如溫度、濕度和光照等方面存在差異[3]。也有可能是DMY 存在同分異構體，一般檢測手段難以區(qū)分，檢測結果準確度有待提高[4，15]。此外，不同區(qū)域藤茶的基因可能也存在明顯差異，導致DMY 含量不同[11]。因此，產(chǎn)生差異的原因有待進一步深入探究。

本試驗通過收集具有代表性的a、b、c 及d 區(qū)域的不同時期3 種不同類型（按等級分）的藤茶（葉為主），采用熱水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用液相色譜法分析了不同藤茶中DMY的含量，為藤茶引種、種植及加工利用提供參考。