許 云，陶叢珊，劉 梟，姜孫旻，姚 熒

（無(wú)錫市婦幼保健院，江蘇 無(wú)錫 214000）

卵巢儲(chǔ)備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的卵母細(xì)胞數(shù)量減少和（或）質(zhì)量下降，屬于生殖系統(tǒng)功能退行性疾?。?］，進(jìn)一步可發(fā)展為卵巢早衰。隨著我國(guó)女性生育年齡的延遲，DOR 的發(fā)病率持續(xù)增高并呈現(xiàn)年輕化態(tài)勢(shì)，其在女性不孕因素中約占10%［2］，嚴(yán)重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量。

滋腎育胎丸源于全國(guó)中醫(yī)婦科泰斗羅元愷教授經(jīng)驗(yàn)方，臨床研究發(fā)現(xiàn)其可以顯著改善不孕癥患者的卵巢儲(chǔ)備功能［3-7］，但對(duì)其作用機(jī)制研究較少，因此進(jìn)一步深入探討滋腎育胎丸對(duì)DOR 的干預(yù)作用機(jī)制對(duì)于臨床合理用藥具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans，以下簡(jiǎn)稱線蟲(chóng)，是目前生命科學(xué)研究中重要的模式動(dòng)物之一，具有分化完整、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生殖系統(tǒng)，與哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生的生理過(guò)程高度保守。調(diào)控卵子發(fā)生的細(xì)胞凋亡通路，調(diào)控卵母細(xì)胞質(zhì)量的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路，在線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物之間也高度保守［8］。這些基礎(chǔ)研究的快速發(fā)展，為以線蟲(chóng)為模型的藥物篩選和機(jī)制研究打下了很好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)擬采用可致卵巢功能下降的雷公藤甲素進(jìn)行應(yīng)激暴露［9-10］，構(gòu)建線蟲(chóng)DOR 模型，研究滋腎育胎丸水提液改善卵巢儲(chǔ)備功能的作用機(jī)制，明確其治療靶點(diǎn)和分子通路，為滋腎育胎丸的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)株，野生型線蟲(chóng)N2，MD701（bcIs39v）、JK2868 （qIs56v），均來(lái)源于美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲(chóng)遺傳中心。

1.2 藥物 滋腎育胎丸 （國(guó)藥準(zhǔn)字Z44020008，批號(hào)A01026）購(gòu)自廣州白云山中一藥業(yè)有限公司。將藥丸碾碎成粉末，稱取15.00 g，用適量去離子水浸泡30 min，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火熬制30 min，過(guò)濾后取濾液，濾渣再次用適量的去離子水浸泡30 min，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火熬制25 min，過(guò)濾后，合并2 次濾液，定容至50 mL，此時(shí)貯備液質(zhì)量濃度為300 mg／mL （按生藥量計(jì)）［11］。臨用時(shí)，用純水配制成5、10、20 mg／mL 使用。

1.3 試劑 雷公藤甲素對(duì)照品 （純度98%，批號(hào)FY105B211）購(gòu)自南通飛宇生物科技有限公司，稱取1.0 mg 雷公藤甲素，溶于50.0 μL 二甲基亞砜，50 ℃超聲振蕩30 min，搖勻，用K 溶液配制為1 mg／mL 溶液。胰蛋白胨、酵母提取物（英國(guó)Oxoid 公司，批號(hào)3176539、4263680-02）； 瓊脂糖（美國(guó)HydraGene 公司，批號(hào)EZ6789A160）；TRIzol （德國(guó)BioFrox 公司，批號(hào)R0016）； PrimeScriptTMRT Master Mix （日本TaKaRa 公司，批號(hào)AL22263A）； FSE DNA Green Master （瑞士Roche 公司，批號(hào)54460200）；Triton-X-100 （廣東光華科技股份有限公司，批號(hào)201811106）。

1.4 儀器 正置熒光顯微鏡Axio ScopeA1 （德國(guó)Zeiss 公司）； Nanodrop1000 Spectrophotometer （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）； LightCycler96 Real-Time PCR （瑞士Roche公司）； 連續(xù)變倍體視顯微鏡XTZ-E （上海光學(xué)儀器六廠）。

2 方法

2.1 線蟲(chóng)分組、造模與給藥 線蟲(chóng)培養(yǎng)于含有大腸桿菌OP50 的線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基 （nematode growth medium，NGM），20 ℃恒溫培養(yǎng)，同步化獲得大量年輕成蟲(chóng)期線蟲(chóng)［12］。在表面涂布有大腸桿菌OP50 的直徑30 mm 的瓊脂培養(yǎng)基上，加入200 μL 0.1 mg／mL 雷公藤甲素溶液，使其均勻分布于培養(yǎng)基表面。待其晾干后將年輕成蟲(chóng)期線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到加入雷公藤甲素溶液的培養(yǎng)基中，于20 ℃培養(yǎng)箱中處理10 h，制備DOR 線蟲(chóng)模型［10］。同期，另挑取未喂飼雷公藤甲素的線蟲(chóng)10 條作為空白組。將造模線蟲(chóng)隨機(jī)分為雷公藤甲素組和滋腎育胎丸水提液5、10、20 mg／mL 組，每組10 條。各組線蟲(chóng)分別處理24、48、72 h，轉(zhuǎn)移至無(wú)藥物處理液的NGM 培養(yǎng)基中，觀察后代數(shù)目、DTC 細(xì)胞熒光強(qiáng)度、粗線期凋亡細(xì)胞數(shù)目、終變期卵母細(xì)胞數(shù)目。處理48 h后，檢測(cè)線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡通路、TGF-β 通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)。

2.2 后代數(shù)目測(cè)定 后代數(shù)目是指將一個(gè)年輕成蟲(chóng)期線蟲(chóng)放入培養(yǎng)皿中處理，處理結(jié)束后，每隔24 h 將線蟲(chóng)轉(zhuǎn)至1個(gè)新的NGM 培養(yǎng)皿，直至線蟲(chóng)停止產(chǎn)卵，于體視顯微鏡下觀察，將每天所產(chǎn)子代數(shù)目（各期幼蟲(chóng)和受精卵）相加，即得該線蟲(chóng)的后代數(shù)目。

2.3 DTC 細(xì)胞熒光強(qiáng)度分析 于熒光顯微鏡下觀察處理結(jié)束后的JK2868 線蟲(chóng)（GFP 特異性標(biāo)記DTC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)），分別在U 型性腺臂雙側(cè)遠(yuǎn)端頂部確定DTC 細(xì)胞，熒光顯微鏡下DTC 細(xì)胞為邊界清晰、亮綠色傘狀細(xì)胞，固定曝光時(shí)間，定焦拍照，應(yīng)用Image J 軟件對(duì)DTC 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

2.4 粗線期細(xì)胞凋亡數(shù)目測(cè)定 于熒光顯微鏡下觀察處理結(jié)束后的MD701 線蟲(chóng)（GFP 特異性標(biāo)記生殖腺凋亡細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)），凋亡細(xì)胞呈亮綠色圓形紐扣狀。于熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂減數(shù)分裂區(qū)凋亡細(xì)胞的數(shù)目。

2.5 終變期卵母細(xì)胞數(shù)目測(cè)定 于顯微鏡下觀察處理結(jié)束后的N2 線蟲(chóng)，統(tǒng)計(jì)線蟲(chóng)單側(cè)性腺臂遠(yuǎn)端Loop 區(qū)轉(zhuǎn)折處到性腺臂近端納精囊之間卵母細(xì)胞的數(shù)目。

2.6 線蟲(chóng)卵子發(fā)生相關(guān)通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)檢測(cè) 每組取約6 000 條線蟲(chóng)，以TRIzol 法提取RNA 后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制25 μL 體系 （cDNA 2 μL、FSE DNA Green Master 12.5 μL、正向引物1.0 μL、反向引物1.0 μL、H2O 8.5 μL），在熒光實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件為95 ℃預(yù)變性5 s，特異退火30 s，采集熒光信號(hào)40 個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，并繪制熔解曲線。目的基因的引物用Primer 5.0 設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。以比較域值法測(cè)定目的基因相對(duì)表達(dá)，以2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因熒光的比值，用于表示目的基因的表達(dá)情況。

表1 引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 24.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，各組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤甲素致線蟲(chóng)卵巢儲(chǔ)備功能下降模型評(píng)判 如表2 所示，與空白對(duì)照組比較，N2 線蟲(chóng)經(jīng)0.1 mg／mL 雷公藤甲素處理10 h 后，后代數(shù)目、卵母細(xì)胞數(shù)量減少 （P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果顯示雷公藤甲素對(duì)線蟲(chóng)的生育能力和卵母細(xì)胞形成能力有抑制作用，可用于構(gòu)建卵巢儲(chǔ)備功能下降模型。

表2 雷公藤甲素對(duì)N2 線蟲(chóng)生育能力的影響（個(gè)，x±s，n＝10）

3.2 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)后代數(shù)目的影響 如表3 所示，與空白對(duì)照組比較，雷公藤甲素組后代數(shù)目減少（P＜0.01）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液5、10、20 mg／mL 組線蟲(chóng)后代數(shù)目均增加（P＜0.01），滋腎育胎丸水提液1、2.5 mg／mL 組線蟲(chóng)后代數(shù)目無(wú)明顯變化（P＞0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用5、10、20 mg／mL 這3 個(gè)劑量進(jìn)行。

表3 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)后代數(shù)目的影響（x±s，n＝10）

3.3 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)量的影響 如表4 所示，與空白對(duì)照組比較，雷公藤甲素組線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.01）； 與雷公藤甲素組比較，處理24、48 h 后，滋腎育胎丸水提液5、10 mg／mL 組線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.01），處理72 h 后，滋腎育胎丸水提液各劑量組線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)量均增加 （P＜0.01）。

表4 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n＝10）

表4 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)卵母細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與空白對(duì)照組比較，＃＃P＜0.01； 與雷公藤甲素組比較，**P＜0.01。

組別劑量／（mg·mL-1）卵母細(xì)胞數(shù)目／個(gè)24 h48 h72 h空白對(duì)照組—9.7±0.39.3±0.49.7±0.4雷公藤甲素組0.15.5±0.3＃＃5.2±0.5＃＃4.8±0.4＃＃滋腎育胎丸水提液組57.7±0.4**7.4±0.4**8.1±0.4**108.4±0.3**8.3±0.6**8.9±0.6**206.3±0.56.0±0.36.5±0.3**

3.4 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)DTC 傘狀細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響 如表5 所示，處理24、48 h 后，與空白對(duì)照組比較，雷公藤甲素組線蟲(chóng)DTC 傘狀細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.05）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液10 mg／mL 組線蟲(chóng)DTC 傘狀細(xì)胞熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05）。

表5 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)DTC 細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響（x±s，n＝10）

3.5 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)凋亡細(xì)胞數(shù)量的影響 如表6 所示，處理24、48、72 h 后，與空白對(duì)照組比較，雷公藤甲素組線蟲(chóng)凋亡細(xì)胞數(shù)量均增加（P＜0.05）；與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液5、10 mg／mL 組線蟲(chóng)凋亡細(xì)胞數(shù)量均減少（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)凋亡細(xì)胞數(shù)的影響（x±s，n＝10）

3.6 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)卵子發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路基因mRNA 表達(dá)的影響 如表7～8 所示，與空白對(duì)照組比較，雷公藤甲素組線蟲(chóng)細(xì)胞凋亡通路ced-3、ced-4 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05），TGF-β 信號(hào)通路上daf-4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）； 與雷公藤甲素組比較，滋腎育胎丸水提液10 mg／mL 組線蟲(chóng)細(xì)胞ced-3、ced-4 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），daf-4、sma-2、sma-3 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）。

表7 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)凋亡通路基因mRNA表達(dá)的影響（x±s，n＝10）

表8 滋腎育胎丸水提液對(duì)DOR 線蟲(chóng)TGF-β 通路基因mRNA 表達(dá)的影響（x±s，n＝10）

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為腎主宰女性生殖機(jī)能的發(fā)育、旺盛與衰退，對(duì)女性卵巢生理功能起決定作用。滋腎育胎丸方中菟絲子和人參能補(bǔ)腎益精，而巴戟天、續(xù)斷和杜仲能協(xié)同菟絲子補(bǔ)腎壯陽(yáng)，白術(shù)和黨參有補(bǔ)氣健脾之功，全方合奏滋補(bǔ)肝腎、益氣培元之功，臨床上多用于脾腎虛弱型卵巢儲(chǔ)備功能減退的治療［13-14］。

滋腎育胎丸包含多種中藥成分，檢測(cè)任何一種活性成分均不能很好的體現(xiàn)其復(fù)方整體療效，最好采用復(fù)方給藥。但秀麗隱桿線蟲(chóng)體積極其微小，成年線蟲(chóng)也僅1.0 mm 左右長(zhǎng)，無(wú)法采用嚙齒類(lèi)動(dòng)物的給藥方式。常規(guī)的線蟲(chóng)給藥途徑多采用將藥物配制成溶液鋪涂在瓊脂培養(yǎng)板上給藥。滋腎育胎丸為濃縮水蜜丸，為較好的保留復(fù)方中的有效成分，且利于給藥，本實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物進(jìn)行了水提，配制成適宜秀麗隱桿線蟲(chóng)給藥的形式，但水提液和蜜丸狀藥物在制備方法上還是存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致藥物成分的改變，也可能會(huì)影響藥物的藥理作用，這些尚需進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)先就滋腎育胎丸水提液提高生育力的藥理作用進(jìn)行初步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)低劑量滋腎育胎丸水提液能提高DOR 秀麗隱桿線蟲(chóng)后代數(shù)目，提示其具有恢復(fù)卵巢功能的作用，繼而確定低劑量滋腎育胎丸水提液能恢復(fù)DTC 細(xì)胞，降低凋亡細(xì)胞、提高終變期卵母細(xì)胞的生成。凋亡是卵母細(xì)胞發(fā)生中必不可少的過(guò)程，與雷公藤甲素組比較，10 mg／mL 滋腎育胎丸水提液能降低ced-3、ced-4 mRNA 表達(dá)，提示藥物能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)提高卵母細(xì)胞的生成。

TGF-β 信號(hào)通路在卵泡的發(fā)育中也起著重要作用，是調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲(chóng)卵母細(xì)胞質(zhì)量的信號(hào)通路，在秀麗隱桿線蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中高度保守［8］。sma-6 和daf-4 編碼Ⅰ型和Ⅱ型受體，配體受體復(fù)合物募集和磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，該蛋白由sma-2、sma-3、sma-4 和sma-9 編碼形成［15-17］。磷酸化后的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA 結(jié)合后通過(guò)調(diào)控下游基因，調(diào)控卵母細(xì)胞質(zhì)量［18］。與雷公藤甲素組比較，10 mg／mL 滋腎育胎丸水提液能升高daf-4、sma-2、sma-3 mRNA 表達(dá)。TGF-β 與細(xì)胞凋亡有相關(guān)性［19］，提示藥物可能通過(guò)TGF-β 通路影響細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞的生成。

綜上所述，滋腎育胎丸水提液可以通過(guò)影響TGF-β 通路抑制細(xì)胞凋亡，從而提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟，提高卵巢儲(chǔ)備功能。但滋腎育胎丸成分復(fù)雜，富含豐富的活性物質(zhì)，其具體的活性成分和作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。