徐天真，吳夢茹，邵佳麗，常 悅，朱燁婷，陳季璇，陳璐陽，陳登艷，楊 歡，夏國華*

（1.如皋市人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500； 2.南通大學(xué)附屬如皋醫(yī)院藥劑科，江蘇 如皋 226500；3.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

中藥柴胡是傘形科植物柴胡BupleurumchineseDC.或狹葉柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根，分別習(xí)稱“北柴胡” 和“南柴胡”［1］，用藥歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性辛、苦，微寒，具有疏散退熱，疏肝解郁，升舉陽氣等功效。柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用［2-5］，其齊墩果烷型分子結(jié)構(gòu)較大，限制了其通過口服吸收進(jìn)入體循環(huán)。前柴胡皂苷A 是柴胡皂苷B1脫除一分子葡萄糖基后的次級苷［6-8］?，F(xiàn)代藥理研究表明，前柴胡皂苷的藥理活性高于其原生苷［9］，且更易被小腸吸收，因此研究者圍繞該類中藥活性成分的制備技術(shù)開展了一些研究，主要有化學(xué)法、微生物轉(zhuǎn)化法［10-12］。但是由于其在原植物中的含量很低，傳統(tǒng)色譜分離手段難以大量制備； 化學(xué)法的副產(chǎn)物較多且廢水污染嚴(yán)重； 微生物轉(zhuǎn)化法亦存在副產(chǎn)物較多、反應(yīng)條件難以控制等不足；而酶水解法反應(yīng)條件溫和，特異性強(qiáng)，已被廣泛地應(yīng)用于多種中藥苷類活性成分的轉(zhuǎn)化反應(yīng)［13-16］。因此，本文通過酶水解柴胡皂苷B1獲取前柴胡皂苷A，進(jìn)而采用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對水解條件進(jìn)行考察及優(yōu)化，建立了關(guān)鍵技術(shù)，從而為大量制備前柴胡皂苷系列成分以開展藥理藥效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

HP1100 型高效液相色譜儀（HPLC，美國Agilent 公司）； HRQ-3110 型渦旋混勻器（美國Silentshake 公司）；85-2 型控溫磁力攪拌儀（江蘇金怡儀器科技有限公司）；AL-104 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； LXQ型電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS，美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Advance Ⅱ型核磁共振儀（NMR，400 MHz，德國Bruker 公司）。

柴胡皂苷B1（純度≥98.0%，批號18041708）由成都普非德生物技術(shù)有限公司提供。乙腈為色譜純（美國Omni公司）； 甲醇、乙酸、乙酸鈉均為分析純（國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）。β-葡聚糖苷酶（活力≥20 000 U／g）購自江蘇金穗生物科技有限公司； β-葡萄糖苷酶（活力100 U／g）購自江蘇銳陽生物科技有限公司； 纖維素酶（活力≥15 000 U／g，批號20190719）購自國藥化學(xué)試劑有限公司； 柚苷酶（活力100 000 U／g，批號208008）由河南百康化工產(chǎn)品有限公司提供； 蝸牛酶（批號S20200421）購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 色譜條件 Kromasil-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～10 min，35% ～50% A； 10 ～20 min，50% ～60% A； 20 ～25 min，60% ～35% A）； 體積流量1.0 mL／min； 柱溫30 ℃； 檢測波長250 nm； 進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取柴胡皂苷B1對照品9.840 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度0.984 0 mg／mL 的對照品儲備液。按照二倍稀釋法制備得到一系列對照品溶液，0.20 μm PTFE 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定。以柴胡皂苷B1質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝42.343X＋8.615 9 （R2＝0.999 1），在0.120 1～123.0 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 酶水解柴胡皂苷B1分別吸取柴胡皂苷B1溶液和酶溶液（0.20 mol／L HAc-NaAc 緩沖液）置于離心管中，在一定溫度下孵育一段時間。待反應(yīng)結(jié)束后，向水解液中加入等體積甲醇，渦旋混勻。12 000 r／min 高速離心10 min，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液用于HPLC 分析，以不加酶的反應(yīng)體系為空白對照。

2.4 單因素試驗(yàn) 以柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了水解酶（β-葡萄糖苷酶、β-葡聚糖苷酶、纖維素酶、蝸牛酶）、緩沖液pH （3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、酶-底物質(zhì)量比（0.5 ∶1、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1）、反應(yīng)溫度 （30、40、50、60、70 ℃）和反應(yīng)時間（12、24、36、48、60、72 h）對酶水解柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響。

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Design-Expert v8.0.6.1）； 此外，對預(yù)測所得最佳反應(yīng)條件進(jìn)行驗(yàn)證，并考察實(shí)際值與預(yù)測值的相對誤差。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1，模型回歸方程為Y＝β0＋。式中Y為柴胡皂苷的轉(zhuǎn)化率，β0為攔截系數(shù)，βi為線性項(xiàng)，βii為二次項(xiàng)，βij為交互項(xiàng)，Xi、Xj為自變量編碼值（i≠j，i，j＝1，2，3，……，k）。

表1 因素水平

2.6 酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 酶水解結(jié)束后，通過反相柱層析對酶解產(chǎn)物進(jìn)行純化，并采用LC-MS、1H-NMR 和13CNMR 對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 HPLC 色譜圖 按“2.1” 項(xiàng)下HPLC 分析條件對前柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1及其酶解液進(jìn)行分析。如圖1 所示，柴胡皂苷B1及其水解產(chǎn)物前柴胡皂苷A 均能得到較好地分離（R＞1.5）。

圖1 柴胡皂苷B1 對照品（A）、前柴胡皂苷A 對照品（B）和柴胡皂苷B1 酶解液（C）的HPLC 色譜圖（250 nm）

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 水解酶 如圖2 所示，4 種酶均可以選擇性地脫去柴胡皂苷B1末端的葡萄糖，生成前柴胡皂苷A，其中蝸牛酶所得的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)高于其他3 種酶。這可能是由于蝸牛酶含有纖維素酶、β-D-葡糖糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種酶，其中的一些酶對葡萄糖苷鍵具有較強(qiáng)的水解作用。相比單一酶來說，蝸牛酶這種復(fù)合酶對于葡萄糖苷鍵的水解更有優(yōu)勢。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇了蝸牛酶。

圖2 不同濃度水解酶對柴胡皂苷B1 轉(zhuǎn)化率的影響

3.2.2 酶／底物質(zhì)量比 如圖3A 所示，當(dāng)質(zhì)量比由4 ∶1提高到30 ∶1 時，轉(zhuǎn)化率從94%增加至99%，繼續(xù)提高質(zhì)量比，則轉(zhuǎn)化率變化不明顯。因此，最佳酶／底物質(zhì)量比為30 ∶1。

圖3 單因素對柴胡皂苷B1 轉(zhuǎn)化率的影響

3.2.3 緩沖液pH 如圖3B 所示，在pH3.0～4.5 范圍內(nèi)，隨著緩沖液pH 升高，轉(zhuǎn)化率逐漸升高，并在pH4.5 時達(dá)到最高值99.5%，但是將pH 進(jìn)一步提高至5.5 后，轉(zhuǎn)化率明顯下降，當(dāng)pH 為6.5 時，轉(zhuǎn)化率僅為81.2%。因此，最佳緩沖液pH 值為4.5。

3.2.4 反應(yīng)溫度 如圖3C 所示，蝸牛酶對柴胡皂苷B1的轉(zhuǎn)化效果隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減弱的趨勢，并在60 ℃時達(dá)到最大值； 當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，酶蛋白開始變性失活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。因此，最佳反應(yīng)溫度為60 ℃。

3.2.5 反應(yīng)時間 如圖3D 所示，柴胡皂苷B1被蝸牛酶水解12 h 之后，轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%，延長水解時間至24 h，轉(zhuǎn)化率可進(jìn)一步提高到99%； 此后，轉(zhuǎn)化率保持平穩(wěn)。綜合考慮柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率和節(jié)約時間，選擇24 h 作為最佳酶水解時間。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 回歸方程及顯著性分析 通過Box-Behnken 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了緩沖液pH （X1）、反應(yīng)溫度（X2）和反應(yīng)時間（X3）對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

將以上所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到擬合方程Y＝97.76 ＋0.36X1- 2.20X2＋1.12X3＋5.51X1X2- 0.17X1X3＋0.90X2X3-3.37X21- 3.75X22＋2.20X23。此外，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值對各因素的顯著性進(jìn)行分析（表3），P＜0.000 1 且失擬項(xiàng)不顯著，可見所得模型能準(zhǔn)確分析和解釋模型中各因素對響應(yīng)值的影響； 同時，反應(yīng)溫度的升高不利于轉(zhuǎn)化率的增加，而較長的反應(yīng)時間和較高的緩沖液pH 則有利于提升柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率。從二次項(xiàng)的P值分析可知，X12（P＝0.0002）、X22（P＜0.0001）、X32（P＝0.0020）均小于0.05，三者對柴胡皂苷B1的轉(zhuǎn)化率具有顯著性影響。

表3 二階多項(xiàng)回歸方程方差分析

3.3.2 反應(yīng)時間和緩沖液pH 對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響 反應(yīng)時間和緩沖液pH 的交互作用見圖4。當(dāng)體系中pH為4.5 時，隨著反應(yīng)時間的增加，柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率緩慢上升后趨于穩(wěn)定； 當(dāng)反應(yīng)時間為24 h 時，轉(zhuǎn)化率隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，pH 偏高或偏低時會影響蝸牛酶與底物的結(jié)合，降低反應(yīng)速率。

圖4 交互項(xiàng)（反應(yīng)時間和緩沖液pH）對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響

3.3.3 反應(yīng)溫度和緩沖液pH 對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響 反應(yīng)溫度和緩沖液pH 的交互作用見圖5。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，隨著體系中pH 升高，柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率先上升后下降； 當(dāng)pH 4.5 時，轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高呈現(xiàn)出相同的趨勢，即先增加后降低，表明反應(yīng)溫度和緩沖液pH 過高或過低均不利于酶水解反應(yīng)的進(jìn)行。

圖5 交互項(xiàng)（反應(yīng)溫度和緩沖液pH）對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響

3.3.4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的交互作用見圖6。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，隨著反應(yīng)時間的增加，柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率先上升后趨于穩(wěn)定； 當(dāng)反應(yīng)時間為24 h 時，轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高先增加后迅速降低。

3.3.5 最佳水解條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-expert 8.0.6.1 軟件優(yōu)化后得到蝸牛酶水解柴胡皂苷B1的最佳反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度55.78 ℃，反應(yīng)時間33.24 h，緩沖液pH

圖6 交互項(xiàng)（反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間）對柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率的影響4.36，并對其進(jìn)行驗(yàn)證，考慮到實(shí)驗(yàn)的實(shí)際可操作性，將水解條件調(diào)整為反應(yīng)溫度56 ℃，反應(yīng)時間33 h，緩沖液pH 4.5； 在此條件下，3 次平行實(shí)驗(yàn)所得的柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率為99.1%，與預(yù)測值100.2%基本相符，表明優(yōu)化得到的酶水解條件與實(shí)際擬合度較好。

3.4 酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 ESI-MSm／z：641［M＋Na］＋。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ：0.58 （s，24-CH3），0.66 （s，26-CH3），0.73 （s，29-CH3），0.84（s，25-CH3），0.90 （s，30-CH3），0.93 （s，27-CH3），1.22 （d，H-6′），4.33 （d，H-1′），5.55 （dd，H-11），6.35 （dd，H-12）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）δ：38.0（C-1，19），25.5 （C-2），80.3 （C-3），43.0 （C-4），46.6（C-5），18.7 （C-6），32.0 （C-7），40.4 （C-8），54.0 （C-9），36.1 （C-10），126.8 （C-11），125.4 （C-12），135.7（C-13），43.8 （C-14），34.2 （C-15），75.4 （C-16），43.7（C-17），133.2 （C-18），32.6 （C-20），34.8 （C-21），29.7 （C-22），63.1 （C-23），12.9 （C-24），17.7 （C-25），17.2 （C-26），21.9 （C-27），62.8 （C-28），24.9 （C-29），32.4 （C-30），105.2 （3-O-Fuc-C-1′），74.1 （C-3′），71.6（C-2′），71.4 （C-4′），70.2 （C-5′），17.0 （C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［17-18］報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為前柴胡皂苷A。

4 結(jié)論與討論

本研究基于酶水解構(gòu)建了從柴胡皂苷B1制備稀有前柴胡皂苷A 的關(guān)鍵技術(shù)。與傳統(tǒng)酸水解相比，該方法可方便地獲取柴胡次級苷，而不產(chǎn)生柴胡皂苷元副產(chǎn)物； 而且在反應(yīng)過程中不使用無機(jī)酸，因此是一種清潔的水解技術(shù)。本文所建立的酶水解關(guān)鍵技術(shù)，可為大量制備前柴胡皂苷A 以開展藥理藥效研究奠定基礎(chǔ)。

采用單因素和響應(yīng)面相結(jié)合的方法對酶水解條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用LC-MS、NMR 確定產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，柴胡皂苷B1的最佳水解酶為蝸牛酶，當(dāng)酶／底物質(zhì)量比為30 ∶1、酶解反應(yīng)時間33 h、酶解反應(yīng)溫度56 ℃、緩沖液pH 4.5 時，柴胡皂苷B1轉(zhuǎn)化率高達(dá)99.1%，產(chǎn)物為前柴胡皂苷A。

中藥活性成分包括三萜類、黃酮類、蒽醌類、甾體類、生物堿類等，是中醫(yī)藥在臨床實(shí)踐中發(fā)揮防病治病作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也是現(xiàn)代醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中備受關(guān)注的藥用分子實(shí)體，其新型制備技術(shù)是近年來較為活躍的研究領(lǐng)域。本文所構(gòu)建的酶水解法具有效率高和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，利用該技術(shù)從天然產(chǎn)物中獲取生物活性化合物（包括次級苷或苷元）具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>