張 勇，張 斌，吳 瑕，宋 紋

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300052； 2.黃驊神農(nóng)居醫(yī)院中醫(yī)科，河北 滄州 061100； 3.天津宏仁堂藥業(yè)有限公司，天津 300385）

辛芳鼻炎膠囊主要由辛夷、白芷、細(xì)辛等10 余味藥物組成，常用于治療慢性鼻炎、鼻竇炎。早期研究已初步證實(shí)辛芳鼻炎膠囊具有抗炎，抗過(guò)敏等藥理作用［1］，近年來(lái)亦有該藥物用于治療變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的散在臨床報(bào)道［2-3］，但目前尚未見(jiàn)該藥物干預(yù)AR 動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)建立AR 大鼠模型，對(duì)辛芳鼻炎膠囊抗炎、抗過(guò)敏藥理作用及其干預(yù)機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期為擴(kuò)大其臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2016-0006］，體質(zhì)量160～200 g，分籠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心空調(diào)動(dòng)物房，室溫22 ～26 ℃，相對(duì)濕度55% ～65%，12 h／12 h 晝夜節(jié)律光照，自由進(jìn)食、飲水，定期更換、消毒飼養(yǎng)籠，保持環(huán)境清潔，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究方案經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)審核并通過(guò)（倫理號(hào)IRMDWLL-2020078）。

1.2 藥物與試劑 辛芳鼻炎膠囊（規(guī)格0.25 g／粒，批號(hào)BL09002，天津宏仁堂藥業(yè)有限公司）； 氯雷他定片［規(guī)格10 mg／片，批號(hào)JS12630，拜耳醫(yī)藥（上海）有限公司］。卵清蛋白 （OVA）、氫氧化鋁 ［Al （OH）3］（批號(hào)SLBX8657、WXBB1151，美國(guó)Sigma 公司）； 吸入用七氟烷（批號(hào)20011431，上海恒瑞醫(yī)藥有限公司）； 10%緩沖中性甲醛（批號(hào)B09D00119，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）； 大鼠OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4、IFN-γ ELISA試 劑 盒 （ 貨 號(hào) ML620587、ML002986、ML003188、ML102825、ML002833，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 儀器 DNM-9602 型酶標(biāo)儀［普朗科（北京）科技有限公司］； DM3000 型光學(xué)顯微鏡、DFC 420C 型顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)（德國(guó)徠卡公司）； TL-18M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海離心機(jī)械研究所有限公司）； AL204 型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

2 方法

2.1 大鼠AR 模型的建立

2.1.1 全身致敏 參照宋興興等［4］報(bào)道的方法并加以改進(jìn)，首先將OVA 溶于無(wú)菌生理鹽水 （終質(zhì)量濃度為0.4 mg／mL），然后與等體積氫氧化鋁混懸液混合均勻，每只大鼠腹腔注射混合液l mL （含0.2 mg OVA 和20 mg 氫氧化鋁），隔日致敏1 次，連續(xù)致敏7 次； 對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積無(wú)菌生理鹽水。

2.1.2 鼻腔激發(fā) 第15 天至第21 天，大鼠經(jīng)七氟烷吸入短暫全身麻醉后，以5% OVA 溶液雙側(cè)滴鼻，每次50 μL／鼻孔，每天1 次，對(duì)照組大鼠以等體積生理鹽水滴鼻。在末次滴鼻完成后，觀察大鼠噴嚏、抓鼻及流涕情況，按趙氏疊加量化計(jì)分法［5］進(jìn)行評(píng)估，觀察時(shí)間30 min，總分≥5 分表示造模成功。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為①鼻癢，大鼠抓鼻1 ～5次記為1 分，6～10 次記為2 分，10 次以上記為3 分； ②噴嚏，大鼠打噴嚏4 個(gè)以下記為1 分，4～10 個(gè)記為2 分，10個(gè)以上記為3 分； ③流涕，大鼠鼻涕流至鼻前孔記為1 分，超過(guò)鼻前孔記為2 分，涕流滿面記為3 分。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（氯雷他定）及辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量組，每組8 只。

2.2 藥物干預(yù) 所有藥物事先均以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液懸浮，使用前充分搖勻，其中辛芳鼻炎膠囊低、中、高劑量分別為0.25、0.5、0.75 g／kg，氯雷他定劑量為1 mg／kg［6］。自第22 天（造模結(jié)束24 h 后）開(kāi)始，各給藥組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物混懸液，對(duì)照組及模型組大鼠均予以等量0.5% CMC-Na 溶液灌胃，每天1次，連續(xù)干預(yù)14 d。

2.3 行為學(xué)觀察 末次給藥結(jié)束后，按照“2.1.2” 項(xiàng)下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，再次對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察和評(píng)分，觀察時(shí)間30 min。

2.4 標(biāo)本采集 第36 天（干預(yù)結(jié)束24 h 后），所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液（300 mg／kg）腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血5 mL，置于含有惰性分離膠和促凝劑的真空取血管中靜置2 h 后，3 000 r／min 離心15 min，血清經(jīng)分裝后置于-40 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙戤吅笱杆傺乇侵芯€剪開(kāi)大鼠鼻腔，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，提取鼻中隔（含鼻中隔軟骨及其雙側(cè)黏膜），置于10% 緩沖中性甲醛溶液中固定72 h。

2.5 鼻黏膜組織病理觀察 鼻黏膜組織標(biāo)本放入5%甲酸溶液中脫鈣3 d，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE 染色后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察鼻腔組織內(nèi)覆蓋各部位的黏膜上皮細(xì)胞有無(wú)變性、壞死，黏膜下有無(wú)充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，鼻腔內(nèi)有無(wú)炎性分泌物等。

2.6 細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平，嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算相應(yīng)細(xì)胞因子濃度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較方差齊性時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)則采用Tamhane 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 辛芳鼻炎膠囊對(duì)AR 大鼠一般情況的影響 在造模階段，對(duì)照組大鼠飲食及日常行為活動(dòng)無(wú)異常，被毛光亮柔順，無(wú)頻繁的噴嚏、抓鼻、流涕等表現(xiàn)； 與對(duì)照組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量減輕，活動(dòng)力下降，?？煽吹角氨强咨踔敛€結(jié)膜潮濕，頻繁出現(xiàn)噴嚏、抓鼻動(dòng)作，部分大鼠可見(jiàn)血性鼻涕，少數(shù)大鼠還會(huì)出現(xiàn)一過(guò)性喉中哮鳴音。

3.2 辛芳鼻炎膠囊對(duì)AR 大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響 如表1所示，給藥前，各給藥組與模型組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較無(wú)差異（P＞0.05）。給藥結(jié)束后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠行為學(xué)評(píng)分升高（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠行為學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05）。

3.3 辛芳鼻炎膠囊對(duì)AR 大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)變化的影響 對(duì)照組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰，表面覆有假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮，上皮間有多量分泌黏液的杯狀細(xì)胞，上皮細(xì)胞排列整齊，平滑，沒(méi)有杯狀細(xì)胞増生，黏膜下層腺體正常，未見(jiàn)增生，無(wú)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，血管無(wú)擴(kuò)張充血； 模型組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞有不同程度的脫落、壞死，杯狀細(xì)胞增生，出現(xiàn)明顯的小血管擴(kuò)張和組織間隙水腫現(xiàn)象，存在以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，腺體增生、腫脹，黏膜表面分泌物增多； 各給藥組大鼠鼻黏膜較模型組有不同程度的改善，炎性浸潤(rùn)，小血管擴(kuò)張和組織間隙水腫均減輕，其中陽(yáng)性對(duì)照組和辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組變化相近，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)觀察（HE，×400）

3.4 辛芳鼻炎膠囊對(duì)AR 大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS、IL-4I 及FN-γ 水平的影響 如表2 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平升高（P＜0.05），IFN-γ 水平降低（P＜0.05）； 與模型組比較，辛芳鼻炎膠囊中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清OVA-sIgE、LTC4、HIS 及IL-4 水平降低（P＜0.05），IFN-γ水平升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清OVA-sIgE、HIS、LTC4、IL-4 及IFN-γ 水平比較（x±s，n＝8）

4 討論

AR 又稱(chēng)過(guò)敏性鼻炎，是人體接觸變應(yīng)原后，由免疫球蛋白E （IgE）介導(dǎo)而涉及多種免疫細(xì)胞和炎癥因子共同參與的鼻黏膜非感染性疾病，屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾?。?］。該病典型癥狀為陣發(fā)性噴嚏，大量清水樣涕，鼻癢及鼻塞等，其發(fā)病率占整個(gè)人群的10% ～20%［8］。

AR 發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，至今尚未完全明確，已知當(dāng)機(jī)體首次接觸變應(yīng)原后，經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞傳遞給Th 細(xì)胞，并分化為T(mén)h2 細(xì)胞，Th2 細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)B 細(xì)胞分泌IgE 并聚集于鼻黏膜。當(dāng)變應(yīng)原再次進(jìn)入機(jī)體內(nèi)時(shí)，將會(huì)與IgE 結(jié)合，誘發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒后釋放組胺、白三烯等炎性遞質(zhì)，促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，致使鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷，毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增高，腺體分泌增加，引起鼻塞、噴嚏、流涕等癥狀［9］。體內(nèi)IgE 異常表達(dá)是誘發(fā)此類(lèi)鼻炎的主要原因，且血清總IgE 水平與患者病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［10］。已有研究表明，組胺是引起機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)的重要的血管活性物質(zhì)，其在體內(nèi)具有促進(jìn)血管擴(kuò)張、增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性及腺體分泌增加等效應(yīng)，介導(dǎo)了I 型變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生［11］。氯雷他定作為第二代抗組胺藥物，具有抑制肥大細(xì)胞釋放白三烯和組胺等藥理作用，是當(dāng)前治療AR 的一線口服藥物，故本研究將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。目前普遍認(rèn)為T(mén)h1／Th2 細(xì)胞免疫失衡是引起AR 的關(guān)鍵［12］，Th1 細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ 等細(xì)胞因子以參與細(xì)胞免疫應(yīng)答； Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5 等細(xì)胞因子以參與體液免疫應(yīng)答，其中IL-4 能夠促進(jìn)β 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細(xì)胞合成IgE，抑制IFN-γ 產(chǎn)生； 而IFN-γ 是IL-4 合成的生物拮抗劑，能增強(qiáng)Th1 細(xì)胞活性，抑制β 細(xì)胞合成IgE 和抑制Th0 細(xì)胞分化Th2 型細(xì)胞［13］，IL-4 和IFN-γ 常作為監(jiān)測(cè)Th 反應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)。當(dāng)特異性抗原作用于特應(yīng)性個(gè)體時(shí)，抗原信號(hào)呈遞給T 輔助淋巴細(xì)胞，使Th 細(xì)胞分化發(fā)生偏移，從而導(dǎo)致Th1／Th2 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)，出現(xiàn)Th2＞Th1 反應(yīng)［14］。

現(xiàn)代藥理研究表明，辛夷的主要有效成分辛夷油能夠抑制Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，減少組胺的釋放，并且能夠上調(diào)Thl／Th2 的比值，促進(jìn)IL-4、干擾素的表達(dá)，從而對(duì)AR 發(fā)揮一定的治療作用［15］。柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎癥組織中組胺的釋放，抑制白細(xì)胞游走［16］。防風(fēng)的提取物能減少致敏小鼠血清IgE 的產(chǎn)生，從而延遲或減輕由卵蛋白致敏引起的I 型變態(tài)免疫反應(yīng)［17］。有研究表明，白芷內(nèi)的揮發(fā)油不但能夠抑制AR 患者肥大細(xì)胞脫顆粒，而且還能夠有效地對(duì)抗組胺引起的致炎反應(yīng)，降低毛細(xì)血管通透性，減輕或消除AR 癥狀［18］； 另有報(bào)道稱(chēng)，白芷干預(yù)AR小鼠后，能有效改善小鼠的過(guò)敏性鼻炎癥狀，減輕其鼻黏膜組織損傷，其機(jī)制可能與下調(diào)Th17 比例，上調(diào)Treg 比例，恢復(fù)Th17／Treg 平衡有關(guān)［19］。有研究表明，黃芩的主要活性成分黃芩苷可調(diào)節(jié)Th1／Th2 細(xì)胞失衡，抑制IL-33／ST2 信號(hào)通路，對(duì)AR 治療作用明顯［20］； 另有報(bào)道稱(chēng)，黃芩苷能夠緩解OVA 誘導(dǎo)的小鼠AR 癥狀，其機(jī)制與通過(guò)抑制細(xì)胞自噬來(lái)調(diào)控Th17／Treg 細(xì)胞分化平衡有關(guān)［21］。

本研究證實(shí)辛芳鼻炎膠囊可明顯改善AR 大鼠鼻黏膜癥狀，其機(jī)制與降低血清中OVA-sIgE、LTC4、HIS 和IL-4水平，升高血清IFN-γ 水平有關(guān)。